瓊脂糖凝膠電泳論壇問答整理

1、要跑瓊脂糖凝膠電泳，5ng就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？ 參考見解：5ng已經(jīng)可以了，但是或許20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內(nèi)呈線性。把210bp的pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到190+20bp的兩個(gè)片段,請(qǐng)問能用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果嗎? 用多大濃度的膠和多大的電壓呢？參考見解：可以用瓊脂糖凝膠電泳分開，電壓不變，可用1.5%到2%的膠,20bp得片斷不一定能看得到，所以應(yīng)用未酶切的PCR片斷作對(duì)照.瓊脂糖濃度（W/V）大小范圍（bp）0.6%1000-230000.8%800-100001.0%400-80001.2%300-70001.5

2、%200-40002%100-3000丙烯酰胺凝膠電泳更適合于分離純化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以達(dá)到1個(gè)bp。所以建議進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳試 試。Marker做瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)Marker在加樣孔有一個(gè)明顯的亮帶，什么原因？參考見解：marker有時(shí)會(huì)出現(xiàn)這樣的問題，應(yīng)該是時(shí)間久了。新買時(shí)跑膠在點(diǎn)樣孔沒有，過一段時(shí)間就會(huì)在點(diǎn)樣孔出現(xiàn)亮點(diǎn)。也可能是蛋 白，有時(shí)DNA提的不純含有蛋白時(shí)就會(huì)出現(xiàn)上樣孔有條帶的現(xiàn)象。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA時(shí),跑出的帶后面出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，什么原因造成的？參考見解：DNA帶模糊?：1、DNA降解?避免核酸酶污染。2、DNA上樣量過多?減少凝膠中D

3、NA上樣量。3、所用電泳條件不合適?電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30r,巨大DNA鏈，溫度應(yīng)15C，核查所用電泳緩沖液是否有足夠的 緩沖能力。4、DNA樣含鹽過高?電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。5、有蛋白污染?電泳前酚抽提去除蛋白。6、DNA變性，？電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。將從組織提取的DNA進(jìn)瓊行脂糖凝膠電泳，用的1.5%的膠加了 EB，80V跑1小時(shí)，溴酚藍(lán)已經(jīng)跑到 頭了，在紫外燈觀察什么帶也沒有，只見孔里面有橘紅色的亮光。好象沒跑出來，是怎么回事？參考見解：1、根據(jù)目的條帶長(zhǎng)度來調(diào)整凝膠濃度，一般1.5%左右，也不一定。2、紫外燈下沒見帶，不一定沒有

4、出孔，而是量少看不到，可以測(cè)一下濃度看一下，或直接試跑一下PCR。3、最好加一個(gè)marker孔，尤其你第一次跑膠時(shí)。4、電泳時(shí)間可能過長(zhǎng)，一般75vx30min左右，但是具體看溟酚藍(lán)的離孔距離和目的條帶離孔距離。內(nèi)切酶酶切后應(yīng)該產(chǎn)生300+74+25bp的3個(gè)片段，用瓊脂糖凝膠電泳能不能跑得開？如果能，得用多 少濃度？參考見解：1、分是分的開的，只是不知道要不要看到這條帶，如果只是對(duì)多個(gè)樣本的分析的，那是完全沒有問題的。用2.53.0%的膠跑過，不同 樣本間是肯定看的到的。當(dāng)然，25BP這條帶是看不到的。2、用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來進(jìn)行電泳分離，可以分開的。不過緩沖液要用0.5的T

5、BE，不要用TAE，其效果差些。下面 是10ml的配方:30%丙烯酰胺母液3.3 ml5 x TBE 1ml 10% A.P 70 ulTEMED 5ul120v 1.5h在pH7.6的TBE緩沖液中進(jìn)行質(zhì)粒(DNA)的瓊脂糖凝膠電泳時(shí)質(zhì)粒向哪一極運(yùn)動(dòng)，為什么？如在DNA 樣品中加足夠的亞精氨后再電泳會(huì)發(fā)生什么現(xiàn)象，為什么？參考見解：1、DNA分子在堿性凝膠緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中由負(fù)極向正極遷移。2、樣品中加足夠的亞精氨后，亞精胺頭部的強(qiáng)陽(yáng)極性使整個(gè)分子高度親和于DNA, DNA與堿性亞精胺結(jié)合,結(jié)合分子帶陽(yáng)離子。在瓊脂糖電泳時(shí)0.5CM孔DNA上樣量不宜超過500ng ;可是當(dāng)組分不同時(shí)

6、可加2030ug這是怎么回事？ 參考見解：?jiǎn)蝹€(gè)條帶不超過500ng,如果有很多條帶的話，總量500ng可能就會(huì)少了點(diǎn)，條帶不清晰。怎樣根據(jù)目測(cè)條帶亮度來判斷DNA濃度？參考見解：1、跑膠時(shí)候marker可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker,按說明書的量上樣電泳，如加500ng量的DNA marker,電泳 完畢后，就可將目的DNA條帶和MARKER條帶的亮度做個(gè)大致的比較，找出兩者最接近亮度的條帶。因?yàn)閙arker的各條帶都已知所含 的DNA濃度(說明書中詳細(xì)注明)，因此根據(jù)條帶的亮度、大小大致就可推測(cè)目的DNA的濃度。2、在通過目測(cè)DNA濃度的時(shí)候，最好要把加樣量設(shè)一

7、個(gè)梯度，比如從0。5、2、4、6,因?yàn)椋绻|(zhì)粒的量很濃的話，通過簡(jiǎn)單的對(duì) 一條條帶的目測(cè)產(chǎn)生的結(jié)果誤差是很大的或者利用marker(推薦DL 2000)，再用軟件做半定量分析。變性單鏈DNA在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移率與什么有關(guān)？應(yīng)該選用什么marker? marker上樣時(shí) 要變性嗎？參考見解：電泳遷移率(mobility):如果把生物大分子的膠體溶液放在沒有干擾的電場(chǎng)中，使帶電顆粒具有恒定遷移率的驅(qū)動(dòng)力來自于顆 粒上的有效電荷Q和電位梯度E，即：F = QE (1)帶電顆粒在遷移中同時(shí)受到來自于介質(zhì)的摩擦力F，對(duì)于球形顆粒來說，在自由溶液中此阻力服從Stock定律：F = 6n r

8、n v (2這里v是在介質(zhì)粘度為n的溶液中，半徑為r的帶電顆粒的移動(dòng)速度。但在凝膠中，這種阻力并不完全符合Stocks定律。F還取決于介質(zhì)中的其它因素如凝膠厚度、顆粒大小和介質(zhì)的內(nèi)滲等。當(dāng)帶電顆粒達(dá)到穩(wěn)態(tài)運(yùn)動(dòng)時(shí)，F(xiàn)=F，由(1)、(2)式推導(dǎo)出：v Q=(3)E 6nr n不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度不同，其泳動(dòng)速度用遷移率(或稱泳動(dòng)度)m來表示，定義為在電位梯度E(V/cm)的影響下，顆 粒在時(shí)間t中遷移距離d(cm)，即在單位電場(chǎng)強(qiáng)度(1 V/cm)時(shí)的泳動(dòng)速度：v dm =(4)E tE將(3)代入(4)，得到Qm =(5)6nr 由上式可看出電泳遷移率與球形分子、介質(zhì)粘度、顆粒所

9、帶電荷有關(guān)。在確定的條件下，某物質(zhì)的遷移率為常數(shù)，是該物質(zhì)的物化特性 常數(shù)。從（4）式可以導(dǎo)出遷移率的單位是cm2s-1V-1。請(qǐng)問配制聚丙烯酰胺凝膠電泳膠時(shí)，促凝的是TEMED還是過硫酸銨？膠聚時(shí)間很長(zhǎng)如何解決？參考見解：過硫酸鉉提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通過催化過硫酸鉉形成自由基而加速它倆的聚合。膠 聚合時(shí)間長(zhǎng)可能是TEMED失效了，過硫酸鉉固體時(shí)間過久也會(huì)失效的。一個(gè)讓PAGE膠很快聚合的方法：不要先配AP （過硫酸鉉）溶液，因?yàn)锳P很容易變質(zhì)。在保證TEMED和AP質(zhì)量的情況下，每次配膠時(shí)，直接稱一定量的AP粉劑溶入 液體狀態(tài)的PAGE中，這樣可以保證A

10、P的催化能力，而且可以多加一點(diǎn)。配25ml的PAGE膠，加0.03克AP粉劑，最后加入25ulTEMED， 20分鐘左右就可以凝固（當(dāng)然這個(gè)時(shí)候拔梳子，會(huì)有少量未凝固的PAGE在孔里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不 影響跑膠效果和條帶的形狀和位置）。DNA電泳的MARKER怎么是扭曲的？參考見解：1、配制膠時(shí)的緩沖液和電泳緩沖液不是同時(shí)配制的.最好是同時(shí)配制.電泳時(shí)緩沖液高過液面12mm即可。2、電泳時(shí)電壓過高,可以在電泳前15分鐘用較低電壓（3V/cm），等條帶出孔后比較漂亮了.然后再調(diào)電壓。3、上樣時(shí)盡量慢慢加樣，等樣品自然沉降后再加電壓。跑出的DNA帶模糊？參考見解：1、

11、DNA降解：避免核酸酶污染。2、電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖 液。3、所用電泳條件不合適:電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過20V/cm，溫度30r ；巨大DNA鏈電泳，溫度應(yīng)15C ；核查所用電泳緩沖液是否有足 夠的緩沖能力。4、DNA上樣量過多：減少凝膠中DNA上樣量。5、DNA樣含鹽過高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。6、有蛋白污染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA變性：電泳前勿加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA。有不規(guī)則DNA帶遷移？參考見解：1、對(duì)于入/Hind III片段cos位點(diǎn)復(fù)性：電泳前于65C

12、加熱DNA 5分鐘，然后在冰上冷卻5分鐘。2、電泳條件不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度30C ；經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、DNA變性：以20mM NaCl Buffer稀釋DNA，電泳前勿加熱。跑出的DNA條帶帶弱或無DNA帶？參考見解：1、DNA的上樣量不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低。2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。3、DNA走出凝膠：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、對(duì)于EB染色的DNA，所用光源不合適?應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源。跑出的DNA帶缺失不完整是怎么回事？參考見解：?1、小DNA帶走出凝膠?？s短

13、電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。2、分子大小相近的DNA帶不易分辨?增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃8度。3、DNA變性：電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA鏈，以20mM NaCl Buffer稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適?在脈沖凝膠電泳上分析。做PCR電泳后跑電泳，目的基因是489BP的，結(jié)果每次切膠回收后再跑電泳就變成500多了，快到600 了？為什么？參考見解：有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示目的片段是1300多，結(jié)果就跑到1000 的marker下面去了，后來證實(shí)片段沒有問題。也有做的一個(gè)片段也是這樣，是490BP.理論上兩個(gè)條帶一樣，可

14、是PCR結(jié)果顯示就是大 小不一致。然后回收以后的檢測(cè)結(jié)果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個(gè)測(cè)序，才知道根本沒有問題。跑完P(guān)CR，暫時(shí)不方便膠回收，條帶已經(jīng)切下來放到ep管里了，這個(gè)能保存么？會(huì)不會(huì)有不良影響？參考見解：還有個(gè)問題，pcr的產(chǎn)物可以不可以直接拿來做模板再進(jìn)行pcr。我試過，可是總是出現(xiàn)一個(gè)拖尾亮條，沒有帶，是什么原因 呢？割下來的膠放在-20保存兩個(gè)星期完全沒有問題。切下來的膠放在4度冰箱中4、5小時(shí)沒有問題回收的效果也很好。凝膠回收DNA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在哪里？參考見解：最關(guān)鍵的是切膠之后,溶膠的那一步.切膠的時(shí)候要盡量把多余的瓊脂糖凝膠切干凈，按照實(shí)驗(yàn)步驟,第一步應(yīng)該是將膠充分的

15、溶 化.這以后步一定要做充分，保證凝膠已經(jīng)完全溶解了 .加乙醇這步也很關(guān)鍵，當(dāng)凝膠溶解后最好多過幾次柱子。還有就是洗脫的那一步。 洗脫的時(shí)候最好用加熱到60度的洗脫液洗脫，如果實(shí)在效果不好可以分兩次洗脫。切膠的時(shí)候如何能切的準(zhǔn)呢？條帶的位置肉眼很難判斷出來，如何判斷條帶的位置呢？參考見解：可以將產(chǎn)物與Marker 一起電泳，染色后，在紫外燈下觀察結(jié)果，跟Marker進(jìn)行相比，就知道要的是哪條帶。注意，紫外燈 下切膠速度要快，否則DNA會(huì)降解，另外，紫外線對(duì)身體傷害很大，特別是眼睛，請(qǐng)注意采取保護(hù)措施（比如在專門的箱子里切，帶眼 鏡等）。|RNA用具要用10%的NaOH浸泡過液，再用DEPC水沖

16、洗干凈70%的乙醇用過 國(guó)產(chǎn)分析乙醇有雜質(zhì)，RNA酶還會(huì)有，并帶入其它污染|EB是制膠時(shí)候加的，待膠不是很燙手的時(shí)候加入即可；可以配成EB染液，等跑完膠之后泡三分鐘，用自來水沖洗，然后照膠非常亮；loading buffer跟質(zhì)粒是1:5 （質(zhì)粒濃度大概100ng/ul上下）；在手套上點(diǎn)漠酚藍(lán)，然后5ul 一混進(jìn)行點(diǎn)樣；質(zhì)粒提取，既然已經(jīng)加大了菌量，條帶亮度還是不夠亮質(zhì)粒電泳條帶不亮最根本的原因是提取的質(zhì)粒質(zhì)量比較差。從質(zhì)粒電泳圖上判斷質(zhì)量好與壞 取決于質(zhì)粒超螺旋的那條帶，跟EB先加或后染色關(guān)系不重要，只要確定EB發(fā)揮作用 并且同時(shí)上樣的marker條帶正常就可以，跟loding buffer加多加少也沒多大關(guān)