植物組織培養(yǎng)-新編講義

1、第一章緒 論目的要求：1掌握組織培養(yǎng)的概念和培養(yǎng)的類型2掌握組織培養(yǎng)的特點(diǎn)3一般掌握組織培養(yǎng)發(fā)展歷史4初步掌握組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)實(shí)踐上的應(yīng)用第一節(jié)組織培養(yǎng)的意義高等植物的組織培養(yǎng)(tissue culture)技術(shù)是指分離一個(gè)或數(shù)個(gè)體細(xì)胞或植物體的一部分在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的技術(shù)。通常我們所說的廣義的組織培養(yǎng)，是指通過無(wú)菌操作分離植物體的一部分(即外植體explant)，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件進(jìn)行培養(yǎng)，使其生成完整的植株。組織培養(yǎng)按培養(yǎng)對(duì)象可分為植株培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等。 植株培養(yǎng)(plant culture)是對(duì)完整植株材料的培養(yǎng)，如幼苗及較大植株的培養(yǎng)。 2

2、 器官培養(yǎng)(organ culture)即離體器官的培養(yǎng)，根據(jù)作物和需要的不同,可以分離莖尖、莖段、根尖、葉片、葉原基、子葉、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果實(shí)等外植體的培養(yǎng)。 3. 組織或愈傷組織培養(yǎng)(tissue or callus culture)為狹義的組織培養(yǎng)，是對(duì)植物體的各部分組織進(jìn)行培養(yǎng)，如莖尖分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮組織、胚乳組織和薄壁組織等等；或?qū)τ芍参锲鞴倥囵B(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，二者均通過再分化誘導(dǎo)形成植株。4. 細(xì)胞培養(yǎng) (cell culture )是對(duì)由愈傷組織等進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)所得到的能保持較好分散性的離體單細(xì)胞或花粉單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)

3、。 5. 原生質(zhì)體培養(yǎng)(proplast culture ) 是用酶及物理方法除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的培養(yǎng)。 組織培養(yǎng)是本世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一門技術(shù)，由于科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是外源激素的應(yīng)用，使組織培養(yǎng)不僅從理論上為相關(guān)學(xué)科提出了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，而且一躍成為一種大規(guī)模、批量工廠化生產(chǎn)種苗的新方法，并在生產(chǎn)上越來(lái)越得到廣泛的應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)之所以發(fā)展如此快，應(yīng)用的范圍如此廣泛，是由于其具備以下幾個(gè)特點(diǎn)： 培養(yǎng)條件可以人為控制 組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基質(zhì)和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化、以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地

4、進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。生長(zhǎng)周期短，繁殖率高 植物組織培養(yǎng)由于可人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)快，往往個(gè)月左右為一個(gè)周期 。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來(lái)說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營(yíng)養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化的高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需

5、要的土地。 第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展只是近50年的事，但它的整個(gè)歷史可以追溯至19世紀(jì)末和上世紀(jì)初。20世紀(jì)初，在schleiden和schwann所發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞學(xué)說的推動(dòng)下，1902年德國(guó)植物學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織為許多細(xì)胞組成的觀點(diǎn)，以及植物細(xì)胞全能性的理論，即植物的體細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛在能力。他首次發(fā)表了植物離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的報(bào)告。1912年，Haberlandt的學(xué)生Kotte和美國(guó)的Robins在根尖培養(yǎng)中獲得了組織培養(yǎng)的成功。Kotte采用了無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各種氨

6、基酸的培養(yǎng)基。Robins用含無(wú)機(jī)鹽、加葡萄糖或果糖的瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)了長(zhǎng)度為1.45-3.75厘米的豌豆、玉米和棉花的莖尖，形成了一些缺綠的莖和根。自Haberlandt的實(shí)驗(yàn)之后，直到1934年美國(guó)的White由番茄根建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系，并反復(fù)轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，使根的離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)獲得了真正的成功，并在以后28年間培養(yǎng)了1600代。 這之后，white又以小麥根尖為材料，研究了光、溫度、通氣、pH、培養(yǎng)基組成等各種培養(yǎng)條件對(duì)生長(zhǎng)的影響，并于1937年建立了第一個(gè)組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，其成份均為已知化合物，包括3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，該培養(yǎng)基后來(lái)被定名為

7、White培養(yǎng)基。與此同時(shí)，Gautheret(1934)在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了B族維生素和生長(zhǎng)素對(duì)組織培養(yǎng)的重要意義，并于1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成層獲得首次成功。同年，White由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被譽(yù)為組織培養(yǎng)學(xué)科的奠基人。我們現(xiàn)在所用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基，基本上都是由這三位科學(xué)家建立的。后來(lái)， White于1943年發(fā)表了植物組織培養(yǎng)手冊(cè)專著，使植物組織培養(yǎng)開始成為一門新興的學(xué)科。 四十年代Skoog和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)

8、以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤或腺苷可以解除培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素(IAA)對(duì)芽形成的抑制作用，而能誘導(dǎo)形成芽，從而明確了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。即這一比例高時(shí)，產(chǎn)生芽；這一比例低時(shí)，則形成根；相等則不分化。在尋找促進(jìn)細(xì)胞分裂的物質(zhì)過程中， Miller等人于1956年發(fā)現(xiàn)了激動(dòng)素。不久即知道激動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽，并且效果可增加3萬(wàn)倍。結(jié)果上述控制器官分化的激素模式變?yōu)榧?dòng)素與生長(zhǎng)素的比例關(guān)系。這方面的成功發(fā)現(xiàn)，有力地推動(dòng)了植物組織培養(yǎng)的發(fā)展。1952年，morel和Martin通過莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無(wú)病毒植株。1935194

9、5年Muir 把單細(xì)胞放在一張鋪在愈傷組織上面的濾紙上培養(yǎng)，使細(xì)胞發(fā)生了分裂，即實(shí)施了看護(hù)接種技術(shù)，使單細(xì)胞培養(yǎng)獲得初步成功。1960年，cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功。1971年，Takebe等在煙草上首次由原生質(zhì)體獲得了再生植株，這不僅在理論上證明了無(wú)壁的原生質(zhì)體同樣具有全能性，而且在實(shí)踐上為外源基因的導(dǎo)入提供了理想的受體材料。80年代中期以來(lái)，對(duì)禾谷類作物的原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼告捷，在這方面中國(guó)學(xué)者作出了重要貢獻(xiàn)。1962年印度Guha等人成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，這促進(jìn)了花藥和花粉培養(yǎng)的研究。以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、

10、辣椒、草莓、蘋果等多種植物獲得成功，其數(shù)目達(dá)到160多種，其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養(yǎng)在中國(guó)取得了引人注目的成就。1960年，motel提出了一個(gè)離體無(wú)性繁殖蘭花的方法，其繁殖系數(shù)極高。由于這一方法有很大的應(yīng)用價(jià)值，很快被蘭花生產(chǎn)者所采用，迅速建立起蘭花工業(yè)。1973年Carlson等通過兩個(gè)煙草物種之間原生質(zhì)體融合，獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，Cocking等倡導(dǎo)的原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交，研究得到了迅速發(fā)展，已經(jīng)能使矮牽牛和煙草屬的雜種細(xì)胞增殖分化生成雜種植株。在整個(gè)組織培養(yǎng)發(fā)展的歷史中，我國(guó)學(xué)者做出多方面的貢獻(xiàn)，除了前述的崔徵的工作以外，還有1993年李繼侗等關(guān)于玉米等植物離體根尖培

11、養(yǎng)的工作，以及羅士韋關(guān)于幼胚和莖尖培養(yǎng)，李正理關(guān)于離體胚培養(yǎng)、王伏雄等關(guān)于幼胚培養(yǎng)的工作。第三節(jié) 組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)的關(guān)系植物組織培養(yǎng)成為生物科學(xué)的一個(gè)廣闊領(lǐng)域，除了在基礎(chǔ)理論的研究上占有重要地位，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。一、快速繁殖優(yōu)良種苗用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖是生產(chǎn)上最有潛力的應(yīng)用，包括花卉和觀賞植物，其次是蔬菜、果樹、大田作物及其它經(jīng)濟(jì)作物?？旆奔夹g(shù)不受季節(jié)等條件的限制，生長(zhǎng)周期短，而且能使不能或很難繁殖的植物進(jìn)行增殖?？焖俜敝晨捎孟铝惺侄芜M(jìn)行：通過莖尖、莖段、鱗莖盤等產(chǎn)生大量腋芽；通過根、葉等器官直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽；通過愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。試管快速繁殖應(yīng)用在下列研究

12、中：1.繁殖雜交育種中得到的少量雜交種，以及保存自交系、不育系等。2.繁殖脫毒培養(yǎng)得到的少量無(wú)病毒苗。3.繁殖生產(chǎn)上急需的或種源較少的種苗。由于組織培養(yǎng)周期短，增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)，加上培養(yǎng)材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。組織培養(yǎng)突出的優(yōu)點(diǎn)是“快”，通過這一方法在較短時(shí)期內(nèi)迅速擴(kuò)大植物的數(shù)量，以一個(gè)莖尖或一小塊葉片為基數(shù)，經(jīng)組織培養(yǎng)一年內(nèi)可增殖到10,000100,000株。二、無(wú)病毒苗(Virus free)的培養(yǎng) 幾乎所有植物都遭受到病毒病不同程度的危害，有的種類甚至同時(shí)受到數(shù)種病毒病的危害，尤其是很多園藝植物靠無(wú)性方法來(lái)增殖，若蒙

13、受病毒病，代代相傳，越染越重。自從Morel(1952)發(fā)現(xiàn)采用微莖尖培養(yǎng)的方法可得到無(wú)病毒苗后，微莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病危害的重要途徑之一。若再與熱處理相結(jié)合，則可提高脫毒培養(yǎng)的效果。對(duì)于木本植物，莖尖培養(yǎng)得到的植株難以發(fā)根生長(zhǎng)，則可采用莖尖微體嫁接的方法來(lái)培育無(wú)病毒苗。 組織培養(yǎng)無(wú)病毒苗的方法已在很多作物的常規(guī)生產(chǎn)上得到應(yīng)用，如馬鈴薯，甘薯，草莓，蘋果，香石竹，菊花等。已有不少地區(qū)建立了無(wú)病毒苗的生產(chǎn)中心，這對(duì)于無(wú)病毒苗的培養(yǎng)、鑒定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一個(gè)規(guī)范的系統(tǒng)程序，從而達(dá)到了保持園藝植物的優(yōu)良種性和經(jīng)濟(jì)性狀的目的。三、在育種上的應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)為育種提供了許多手段和

14、方法，使育種工作在新的條件下更有效的進(jìn)行。如用花藥培養(yǎng)單倍體植株；用原生質(zhì)體進(jìn)行體細(xì)胞雜交和基因轉(zhuǎn)移；用子房、胚和胚珠完成胚的試管發(fā)育和試管受精等 ；種質(zhì)資源的保存等等。 胚培養(yǎng)技術(shù)很早就有利用，在種屬間遠(yuǎn)緣雜交的情況下，由于生理代謝等方面的原因，雜種胚常常停止發(fā)育，因此不能得到雜種植物，通過胚培養(yǎng)就可保證遠(yuǎn)緣雜交的順利進(jìn)行。到五十年代在實(shí)踐上的應(yīng)用就更多了，在桃、柑橘、菜豆、南瓜、百合、鳶尾等等許多園藝植物遠(yuǎn)緣雜交育種上都得到了應(yīng)用。大白菜甘藍(lán)的遠(yuǎn)緣雜交種“白蘭”，就是通過雜種胚的培養(yǎng)而得到的。對(duì)早期發(fā)育幼胚因太小難培養(yǎng)的種類，還可采用胚珠和子房培養(yǎng)來(lái)獲得成功，利用胚珠和子房培養(yǎng)也可進(jìn)行試管

15、受精，以克服柱頭或花柱對(duì)受精的障礙，使花粉管直接進(jìn)入胚珠而受精?；ㄋ?、花粉的培養(yǎng)在蘋果、柑橘、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘藍(lán)、天竺葵等約20種園藝植物得到了單倍體植株。在常規(guī)育種中為得到純系材料要經(jīng)多代自交，而單倍體育種，經(jīng)染色體加倍后可以迅速獲得純合的二倍體，大大縮短了育種的世代和年限。利用組織培養(yǎng)可以進(jìn)行突變體的篩選。突變的產(chǎn)生因部位而異，莖尖遺傳性比較穩(wěn)定，根、莖、葉乃至愈傷組織和細(xì)胞的培養(yǎng)則變異率就較大。培養(yǎng)基的激素也會(huì)誘導(dǎo)變異，因濃度而不同。此外還有采用紫外線、X射線、射線對(duì)材料進(jìn)行照射，來(lái)誘發(fā)突變的產(chǎn)生。在組織培養(yǎng)中產(chǎn)生多倍體、混倍體現(xiàn)象比較多，產(chǎn)生的變異為育種提供了材料，可以根據(jù)

16、需要進(jìn)行篩選。利用組織培養(yǎng)，采用與微生物篩選相似的技術(shù)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行突變體的篩選更加富有成效。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù)的開發(fā)，在育種上展現(xiàn)了一幅嶄新的前景。已有多種植物的經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到再生植物，有些植物得到體細(xì)胞雜種，這無(wú)論在理論和實(shí)踐上都有重要價(jià)值。隨著這方面工作的深入，水平的提高，原生質(zhì)體培養(yǎng)一定會(huì)在育種上產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。四、工廠化育苗 近年來(lái)，組培苗工廠化生產(chǎn)已作為一種新興技術(shù)和生產(chǎn)手段，在園藝植物的生產(chǎn)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展。 組培苗工廠化生產(chǎn)，是以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，在含有植物生長(zhǎng)發(fā)育必需物質(zhì)的人工合成培養(yǎng)基上，并附加一定量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，把脫離于完整植株的本來(lái)已經(jīng)分化的植物器官或

17、細(xì)胞，接種在不同的培養(yǎng)基上，在一定的溫度、光照、濕度及pH、值條件下，利用細(xì)胞的全能性以及原有的遺傳基礎(chǔ)，促使細(xì)胞重新分裂、分化長(zhǎng)成新的組織、器官或不定芽。最后長(zhǎng)成和母株同樣的小植物體。例如非洲紫羅蘭組培苗的工廠化生產(chǎn)，就是取樣品株一定部位的葉片為材料，消毒后切成一定大小的塊，接種在適宜的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，兩個(gè)月左右在切口處產(chǎn)生不定芽，這些不定芽再切割后又形成新的不定芽，如此繼續(xù)，即可獲得批量的幼小植株，按需要量生產(chǎn)與樣品株完全相同的苗子。工廠化生產(chǎn)組培苗，是按一定工藝流程規(guī)范化程序化生產(chǎn)的，具有繁殖速度快、整齊、一致、無(wú)蟲少病、生長(zhǎng)周期短、遺傳性穩(wěn)定的特點(diǎn)，可以加速產(chǎn)品的發(fā)展，盡快獲

18、得繁殖無(wú)性系。特別是對(duì)一些繁殖系數(shù)低、雜合的材料有性繁殖優(yōu)良性狀易分離、或從雜合的遺傳群體中篩選出表現(xiàn)型優(yōu)異的植株，需要保持其優(yōu)良遺傳性，有更重要的作用。組培苗的無(wú)毒生產(chǎn)，可減少病害傳播，更符合國(guó)際植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)的要求，擴(kuò)大產(chǎn)品的流通渠道，增加產(chǎn)品市場(chǎng)的銷售能力，同時(shí)減少了氣候條件對(duì)幼苗繁殖的影響，緩和了淡、旺季供需矛盾。世界上一些先進(jìn)國(guó)家園藝植物組織培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展從60年代就巳經(jīng)開始，并隨著生長(zhǎng)、分化規(guī)律性探索逐步深化，到了70年代僅花卉業(yè)就已在蘭花、百合、非洲菊、大巖桐、菊花、香石竹、矮牽牛等二十幾種花卉幼苗生產(chǎn)上建立起大規(guī)模試管苗商品化生產(chǎn)，到1984年世界花卉幼苗產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)總值已達(dá)二

19、十億美元，其中美國(guó)花卉幼苗市場(chǎng)總值為六億多美元，日本三友種苗公司有60的幼苗靠組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖。1985年僅蘭花一項(xiàng)，在美國(guó)注冊(cè)的公司就有100余家，年銷售額在一億美元以上。由于組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，加快了花卉新品種的推廣。以前靠常規(guī)方法推廣一個(gè)新品種要幾年甚至十多年，而現(xiàn)在快的只要l2年就可在世界范圍內(nèi)達(dá)到普及和應(yīng)用。我國(guó)采用快速繁殖技術(shù)，也使優(yōu)良品種達(dá)到迅速的推廣和應(yīng)用。如廣東切花菊“黃秀風(fēng)”的應(yīng)用，使菊花變大，長(zhǎng)勢(shì)加強(qiáng)，花色鮮艷，抗病力增強(qiáng)，打開了進(jìn)入香港市場(chǎng)的渠道，使三十多種觀葉植物的推廣很快遍及全國(guó)，豐富了人們的生活；并將自然界的幾百個(gè)野生金錢蓮品種繁種馴化，培養(yǎng)了一批園林垂直綠化的材

20、料，促進(jìn)了園林業(yè)的發(fā)展。 植物組織培養(yǎng)也存有一定的困難，首先是繁殖效率與商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解決，因而無(wú)法滿足生產(chǎn)的需要，其次是在培養(yǎng)過程中如何減少變異株的發(fā)生。更重要的是應(yīng)降低組培苗工廠化生產(chǎn)的成本，只有降低成本，才能更好的投產(chǎn)應(yīng)用。總之，隨著組織培養(yǎng)這一技術(shù)的發(fā)展及各種培養(yǎng)方法的廣泛應(yīng)用，使這一技術(shù)在遺傳育種、品種繁育等方面表現(xiàn)出了巨大的潛力，特別是生物工程和工廠化育苗實(shí)施以后，它將以新興產(chǎn)業(yè)的面目在技術(shù)革命中發(fā)揮重大作用。本章小結(jié)1植物組織培養(yǎng)是指分離單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或植物體的一部分，在人工配制的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使之長(zhǎng)成一株完整植株的過程。2按照外植體的不同，植物組

21、織培養(yǎng)可分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)5種類型。3組織培養(yǎng)具有：培養(yǎng)條件可以人為控制；生長(zhǎng)周期短；繁殖率高；管理方便；利于工廠化生產(chǎn)的特點(diǎn)。因而發(fā)展迅速。4植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：快速繁殖優(yōu)良苗木；獲得脫毒苗；植物育種；工廠化育苗等。復(fù)習(xí)思考題1植物組織培養(yǎng)的廣義與狹義概念？2外植體的含義？3根據(jù)外植體的不同，植物組織培養(yǎng)可以分為幾種？比較常用的是哪些？4植物組織培養(yǎng)有哪些特點(diǎn)？5你認(rèn)為植物組織培養(yǎng)技術(shù)在目前的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有什么價(jià)值？為什么？第二章實(shí)驗(yàn)設(shè)備及培養(yǎng)條件目的要求：1掌握組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)和組成及各組成部分的作用2掌握組織培養(yǎng)常用的實(shí)驗(yàn)

22、儀器和設(shè)備及其使用方法3掌握調(diào)控組織培養(yǎng)的主要環(huán)境條件在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對(duì)工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個(gè)全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模太小，太小則會(huì)限制生產(chǎn)，影響效率。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行的。要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)包括洗滌室、配置室、無(wú)菌室、培養(yǎng)室、觀察室等。在實(shí)際中可結(jié)合

23、可行條件，合并一部分。一、洗滌室洗滌室完成玻璃器皿和其它儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，用于培養(yǎng)器皿的洗滌，最好是內(nèi)襯白瓷磚的水泥槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪橡膠板，上下水道要暢通。備有大型塑料筐，用于放置培養(yǎng)器皿?？芍苯又糜跀R架上，以節(jié)約空間和便于運(yùn)輸工作。備有空干架，以空干涮凈的培養(yǎng)器皿。二、配置室準(zhǔn)備室要求明亮、通風(fēng)。在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。如果房間較多，可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩部分。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。為完成培養(yǎng)基的制備工作，準(zhǔn)備室還應(yīng)配備以下儀器設(shè)備：1

24、大型工作臺(tái) 其高度應(yīng)方便配制工作。2藥品柜 用以放置常用藥品。3普通冰箱 主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。4電子分析天平和托盤天平 電子分析天平精確度為0.001g，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品；托盤天平精確度為0.1g，用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。天平應(yīng)放置在干燥、不受振動(dòng)的固定操作臺(tái)上。5電蒸餾水器 電蒸餾水器， 采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基，配培養(yǎng)基可用自來(lái)水來(lái)代替，若實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話，則須用蒸餾水。6磁力攪拌器磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等 。磁力攪拌器還可加熱 ，使之更利于溶解。7

25、恒溫水浴鍋 水浴鍋用于難溶藥品的溶解、瓊脂的溶化等。若沒有水浴鍋，也可用1500或2000W電爐或電飯鍋代替。電爐應(yīng)配有鋁鍋。8酸度計(jì)組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基p值的準(zhǔn)確度是十分重要的， 應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì)，若無(wú)酸度計(jì)，也可使用pH試紙進(jìn)行粗測(cè)。首次使用酸度計(jì)前，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位，然后固定。 測(cè)量p時(shí)，待測(cè)液必須充分?jǐn)嚢杈鶆?。如果培養(yǎng)基溫度過高，測(cè)量時(shí)要調(diào)整p計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。 注意保護(hù)好玻璃電極，用后電極應(yīng)用蒸餾水沖洗凈，蓋上電極帽。9培養(yǎng)基分裝設(shè)備 小型組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可采用燒杯、漏斗等作為分裝培養(yǎng)基的工具。也可采用醫(yī)用“下口杯”作為分裝工具，在“下口杯”的下口管上套一段軟膠管，加一彈簧

26、止水夾，使用時(shí)非常合用。更大規(guī)?；蛞蟾咝蕰r(shí)，可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。10高壓滅菌鍋 用以進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。通常以電作能源。11烘箱 用于干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測(cè)定干物重。用于干燥需保持80100；進(jìn)行干熱滅菌需保持150，達(dá)小時(shí)；若測(cè)定干物重，則溫度應(yīng)控制在80烘干。 12恒溫培養(yǎng)箱 內(nèi)有溫度調(diào)節(jié)器，生化培養(yǎng)箱還配有光源，用于植物材料的培養(yǎng)。三、接種室接種室是是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。其無(wú)菌條件的好壞對(duì)組織培養(yǎng)成功與否起重要作用

27、。在工作方便的前提下，無(wú)菌操作室宜小不宜大，一般78m2；要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光潔，易于清潔和消毒。無(wú)菌操作室應(yīng)配置拉動(dòng)門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。無(wú)菌操作室要求干爽安靜，清潔明亮，在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外線滅菌燈，用以經(jīng)常地照射滅菌。最好能安置一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可讓門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。無(wú)菌操作室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積2 m2為宜。進(jìn)入無(wú)菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外滅菌燈，用以照射滅菌。 無(wú)菌操作室的主要設(shè)備及用具有：1接種箱在投資少的情況下，可以用接種箱來(lái)代替超凈臺(tái)。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來(lái)保證內(nèi)部空間無(wú)菌。

28、但操作活動(dòng)受限制，準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)，工作效率低。接種箱可參考圖21自行仿制?，F(xiàn)在也有許多廠家能夠提供很漂亮的有機(jī)玻璃做的接種箱。 圖21 接種箱構(gòu)造圖長(zhǎng)700cm,上寬300cm，下寬450cm，高500cm。左右各有一個(gè)小拉門，背面下方有進(jìn)氣孔，頂上有出氣孔。2 超凈臺(tái)超凈臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時(shí)間短。開機(jī)10分鐘即可操作，可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間使用。在工廠化生產(chǎn)中，接種工作量很大，需要經(jīng)常長(zhǎng)久地工作時(shí)，超凈臺(tái)是很理想的設(shè)備。超凈臺(tái)功率在145260W左右，它裝有小型鼓風(fēng)機(jī)，使空氣穿過一個(gè)前置過濾器，在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉，然后再使空氣穿過一個(gè)細(xì)致的高效過濾器，它除去了大

29、于0.3m的塵埃、細(xì)菌和真菌孢子等。超凈空氣的流速為每分鐘2430m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。在這樣的無(wú)菌條件下操作，就可以保證無(wú)菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染。 3解剖鏡 解剖鏡種類較多， 用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。 雙筒解剖鏡在分離莖尖等較小組織時(shí)，便于觀察、操作，通常放大倍。 放大倍以上操作需要有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。為進(jìn)行操作，要有照明裝置。 解剖鏡上要求帶有照相裝置， 根據(jù)需要隨時(shí)對(duì)所需材料進(jìn)行攝影記錄。4無(wú)菌操作用的器具 按單人超凈臺(tái)上的用量計(jì)：酒精燈1個(gè)；2025cm長(zhǎng)的醫(yī)用鑷子1把；4號(hào)解剖刀1把，

30、解剖刀片若干；15cm醫(yī)用剪1把；500ml廣口瓶1只，內(nèi)放酒精，用于浸泡鑷子、刀、剪等；用于架放灼燒過的刀、鑷子的小架。5擱架 貯放高壓滅菌后等待接種的培養(yǎng)基。 四、培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要的培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其它附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)層，最低一層離地高約100厘米，其它每層間隔30厘米左右，培養(yǎng)架即高1.7米左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度，因一般在每層上端裝置日光燈,以供照明，所以都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，

31、則長(zhǎng)1.3m，30 W的長(zhǎng)米即可。寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度， 一般保持在2027左右，可安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。要求溫度因熱帶植物和寒帶植物等的種類不同而異，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度以保持在7080%為好,可安裝加濕器。培養(yǎng)架上裝置日光燈時(shí)，可安裝定時(shí)開關(guān)鐘控制照明時(shí)間，植物組織培養(yǎng)的光照強(qiáng)度一般在10004000勒克斯（lux）， 每天照明1016小時(shí)，也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長(zhǎng)日照植物需要長(zhǎng)日照條件?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽(yáng)光照作為能源， 這樣不但可以節(jié)省能源,而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。在陰

32、雨天用燈光作補(bǔ)充。 第二節(jié) 設(shè)備和器材一、玻璃器皿在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。 要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成， 以保證長(zhǎng)期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；培養(yǎng)用的還要求透光度好， 能耐高壓高溫，能方便放入培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿，根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求，可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿.其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是三角瓶，規(guī)格有100、250、500毫升等， 一般使用100毫升三角瓶，無(wú)論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大， 利于組織生長(zhǎng)，受光也比試管好。由于瓶口較小，亦不易污染。培養(yǎng)皿常用9、12厘米直徑等規(guī)格，要求上、下能密切吻合。這在游離細(xì)胞、 原生質(zhì)體

33、、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無(wú)菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。試管常用口徑18180 mm或20200mm規(guī)格?？捎糜谂囵B(yǎng)較高的試管苗 ，另外也不易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時(shí)操作方便、 工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可增加培養(yǎng)的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來(lái)，從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高溫，可進(jìn)行高

34、壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性消耗品，不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí)間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無(wú)須另外配蓋，使用時(shí)是非常方便的。瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。以前封口常用棉塞。不過這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基濕度?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便， 且通氣好。也可采用專用的封口材料如封口膜。在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括100、250、1000毫升燒杯；100、1000毫升量筒； 100

35、、1000毫升試劑瓶（棕色）等等。二、器械用具鑷子類主要采用醫(yī)療上用的鑷子。根據(jù)操作的需要有各種類型，若用毫升的三角瓶作為培養(yǎng)瓶， 可用厘米長(zhǎng)的鑷子。鑷子過短.容易使手接觸瓶口， 造成污染。鑷子太長(zhǎng)，使用起來(lái)不靈活。某些微小部分的精細(xì)操作則用鐘表鑷子， 如在分離莖尖幼葉時(shí)，由于其尖端鋒利，所以幾乎可代替剪刀使用。剪刀類可采用五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3解剖刀切割較小材料時(shí)可用解剖刀。 分離莖尖分生組織，有時(shí)也用解剖刀。 常用的解剖刀刀片可以經(jīng)常調(diào)換，刀口要保持鋒利狀態(tài)，否則切割時(shí)會(huì)造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡

36、，影響培養(yǎng)效果。解剖針解剖針用于深入到培養(yǎng)瓶中， 轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉。第三節(jié) 培養(yǎng)條件在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。一、溫度溫度是組織培養(yǎng)過程中的重要因素。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長(zhǎng)分化表現(xiàn)良好， 大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在2327之間進(jìn)行，很多研究者采用了25的恒溫條件。低于15時(shí)培養(yǎng)，組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于35時(shí)對(duì)生長(zhǎng)不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是20、月季是2527、番茄是28。 溫度不僅影響組培苗的生長(zhǎng)速度， 也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽

37、的形成以28為最好， 在12以下，33以上形成率皆最低。不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25下的高。 桃胚在25條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35處理草莓的莖尖分生組織35天，可得到無(wú)病毒苗。二、光照 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一， 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面：1光照強(qiáng)度 光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響， 從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。 一般來(lái)說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。2光質(zhì)光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及

38、器官的分化都有明顯的影響。 如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下， 幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3光周期試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)， 最常用的周期是16小時(shí)的光照， 小時(shí)的黑暗，研究表明，對(duì)短日照敏感的品種的器官組織， 在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)， 尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。三、濕度濕度的影響包括培養(yǎng)容器和環(huán)境的濕度條件， 容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。 前者又受瓊脂含量的影響。在冬

39、季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量， 否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基， 導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受影響。環(huán)境的相對(duì)濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)， 一般要求的相對(duì)濕度， 常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來(lái)調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高,進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行；過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。三、滲透壓培養(yǎng)基中添加的鹽類、 蔗糖、甘露醇及聚乙二醇類高分子化合物，影響到滲透壓的變化。 個(gè)大氣壓對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，個(gè)大氣壓以上就對(duì)生長(zhǎng)有阻礙作用， 個(gè)大氣壓生長(zhǎng)就

40、完全停止，個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。四、p值不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適p值的要求也是不同的（表2-），大多在.左右，一般培養(yǎng)基皆掌握在.，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。表2-不同植物的最適p值種 類最適PH值種 類最適PH值杜 鵑40月 季58越 桔45胡蘿卜、石刁柏60蠶 豆55桃70番茄、葡萄57p值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣， 后者較高一些。一般來(lái)說當(dāng)高于.時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低p值（約.個(gè)p） 因此在配制時(shí)常提高p值.單位。p值大小調(diào)整可用.的a和.的l來(lái)調(diào)整。ml的a可使p值升高.單位，ml的H

41、CL可使值降低.單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆?。五、氣體氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素， 瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥， 夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來(lái)增加通氣度,以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。本章小結(jié)1植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室一般由洗滌室、配置室、接種室和培養(yǎng)室構(gòu)成。其中，接種室是一個(gè)最為重要的操作室。2植物組織培養(yǎng)常用的設(shè)備和器材有：玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；器械用具，如鑷子、剪刀、解剖刀、解剖針等；儀器設(shè)備，如超凈

42、工作臺(tái)、冰箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等。3溫度、光照、氧氣、PH、濕度都會(huì)影響到組織培養(yǎng)成功率，因此，實(shí)際培養(yǎng)外植體時(shí)，要根據(jù)不同的植物材料，將上述因素調(diào)整到適宜的范圍。復(fù)習(xí)思考題1因地制宜建一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，需要哪些組成部分？各部分的作用是什么？2常規(guī)組織培養(yǎng)時(shí)，需要什么設(shè)備和器械？你是否會(huì)用？3組織培養(yǎng)中，PH有什么作用？如果PH過高或過低會(huì)有什么后果？4談?wù)劷M織培養(yǎng)中如何根據(jù)外植體的不同調(diào)整適宜的培養(yǎng)溫度？第三章 培養(yǎng)基目的要求：1一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)和各自的作用2掌握基本培養(yǎng)基的配方3一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量4掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟5熟練掌

43、握培養(yǎng)基的分裝和滅菌方法6一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。在植物組織培養(yǎng)歷史進(jìn)程中，事實(shí)上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí)，對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn)，或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展，取得越來(lái)越多的成功。一、培養(yǎng)基的種類培

44、養(yǎng)基有許多種類，根據(jù)不同的植物和培養(yǎng)部位及不同的培養(yǎng)目的需選用不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是acks(1680)和nop(1681)，他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究， 根據(jù)植物從土中主要是吸收無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無(wú)機(jī)鹽組成的acks和nop溶液，至今仍在作為基本的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。 以后根據(jù)不同目的進(jìn)行改良產(chǎn)生了多種培養(yǎng)基， hite培養(yǎng)基在四十年代用得較多，現(xiàn)在還常用。而到60和70年代則大多采用等高濃度培養(yǎng)基， 可以保證培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要， 并能生長(zhǎng)快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過程中某些成分有些出入,也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。培養(yǎng)基的名稱，一直根據(jù)沿用的習(xí)慣。

45、多數(shù)以發(fā)明人的名字來(lái)命名， 如hite培養(yǎng)基，urashige和koog培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱 培養(yǎng)基），也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。 目前國(guó)際上流行的培養(yǎng)基有幾十種。常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下： 培養(yǎng)基 它是1962年由urashige和koog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。 特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適， 可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其它培養(yǎng)基為高， 廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來(lái)的。 5培養(yǎng)基 是1968年由amBorg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。 其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少

46、培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。從實(shí)踐得知有些植物在5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)更適宜，如雙子葉植物特別是木本植物。 hite培養(yǎng)基 是1943年由hite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。1963年又作了改良，稱作hite改良培養(yǎng)基，提高了g4 的濃度和增加了硼素。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。6培養(yǎng)基 是1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。 其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，3和（4）24含量高。在國(guó)內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)和其它組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基 它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。 其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜。它包括了所有的單糖和維生素。廣泛用于原生質(zhì)體和融合體的培養(yǎng)。常用培養(yǎng)配方如下：表

47、 31 MS和White培養(yǎng)基配方表有機(jī)物(毫克/升)hite(毫克/升)433al224g42H24e42.a2-.n4 2.n2 8.6ol220.025u420.025.a2o42025H3BO3 6.2.煙酸(Vpp).鹽酸吡多醇(VB6)0501鹽酸硫胺素(VB1).肌醇 100甘氨酸23二、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、 無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。水水是植物原生質(zhì)體的組成成分， 也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。 它是生命活動(dòng)過程中不可缺少的物質(zhì)。 配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)

48、水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成份的變化引起不良效果。無(wú)機(jī)元素大量元素，指濃度大于0.5mmol/l的元素，有、a、g、等。其作用是：(1)氮 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分， 是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有硝態(tài)氮又含銨態(tài)氮。銨態(tài)氮對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。 供應(yīng)的氮化物有硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀等。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。(2)磷 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是、等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中， 向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)的吸收， 增加蛋白

49、質(zhì)在植物體中的積累。常用于培養(yǎng)基的磷化物有24或a24等。(3)鉀 是植物營(yíng)養(yǎng)、之一。對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加， 維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。但濃度不易過大，一般為mg/l為好。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以L、3 等鹽類提供。 (4) g、和ag是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；是含蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以g472提供。用量為mg/l較為適宜； a 是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，a對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以al22提供。(5)微量元素指小于0.5mmol/l的元素， e、n、u、o、o等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過

50、氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)， 它又是葉綠素形成的必要條件。 培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。 在制做培養(yǎng)基時(shí)不用e2（4）3和el3 （因其在pH.以上，易形成e（）3的不溶性沉淀），而用 e 42和 a2-結(jié)合成螯合物使用。、n、n、u、o、o等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)，分裂異常?？傊参锉匦锠I(yíng)養(yǎng)元素可組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)。也可構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。此外，還在維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面起著重要作用。這些整株植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)

51、于植物組織培養(yǎng)來(lái)說也是必需的。當(dāng)某些營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不足時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出一定的缺素癥狀。如缺氮，會(huì)表現(xiàn)出一種花色素苷的顏色，不能形成導(dǎo)管；缺鐵，細(xì)胞停止分裂；缺硫，表現(xiàn)出非常明顯的褪綠；缺錳或鉬，則影響細(xì)胞的伸長(zhǎng)。有機(jī)化合物培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長(zhǎng)。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類：(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在，常用， 即配制升培養(yǎng)基稱取克蔗糖，有時(shí)可用.，但在胚培養(yǎng)時(shí)采用的高濃度， 因蔗糖對(duì)

52、胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對(duì)生長(zhǎng)的影響不同。從各種糖對(duì)水稻根培養(yǎng)的影響來(lái)看:以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。 不同植物不同組織的糖類需要量也不同，實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)配方規(guī)定按量稱取，不能任意取量。高壓滅菌時(shí)一部分糖發(fā)生分解、制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。（2）維生素(Vitamin) 維生素類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多項(xiàng)代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。雖然大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上還明顯不足，通常需加入一至數(shù)種維生素，以便獲得最良好的生長(zhǎng)。主要有VB1 （鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇

53、）、VPP(煙酸)、VC(抗壞血酸) 、有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.11.0mg/l。，有時(shí)用量較高。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，VPP與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。VC有防止組織變褐的作用。(3)肌醇又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。通?？捎闪姿崞咸烟寝D(zhuǎn)化而成，還可進(jìn)一步生成果膠物質(zhì)，用于構(gòu)建細(xì)胞壁。肌醇與6分子磷酸殘基相結(jié)合形成植酸，植酸與鈣、鎂等陽(yáng)離子結(jié)合成植酸鈣鎂，植酸可進(jìn)一步形成磷脂，參與細(xì)胞膜的構(gòu)建。使用濃度一般為毫克/升，在適當(dāng)?shù)那闆r下使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、 分化

54、有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。(4)氨基酸是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其它的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時(shí)采用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約二十種氨基酸的混合物，用量在101000mg/l之間。由于它們營(yíng)養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無(wú)特別需要，以不用為宜。（5）天然復(fù)合物其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用，特別是新的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不斷產(chǎn)生，

55、更縮小了它的使用范圍?？墒怯捎谄鋵?duì)一些難以生長(zhǎng)培養(yǎng)材料的特殊作用，所以在一些試驗(yàn)中還常常應(yīng)用它。 椰乳 是椰乳的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過毫米時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。香蕉 用量為毫升。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。?duì)pH的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對(duì)發(fā)育有促進(jìn)作用。馬鈴薯 去掉皮和芽后，加水煮3分鐘，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為克/升。對(duì)pH緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。水解酪蛋

56、白 為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為毫克/升。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。其它 酵母提取液（）（.），主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液（.）、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。4.植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動(dòng)，在培養(yǎng)基的各成分中，植物激素是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)， 對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。（1）生長(zhǎng)素類在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分

57、化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在促進(jìn)生長(zhǎng)方面，根對(duì)生長(zhǎng)素最敏感。 在極低的濃度下，（mg/L）就可促進(jìn)生長(zhǎng)。天然的生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。組織培養(yǎng)中常用人工合成的生長(zhǎng)素類物質(zhì)。IAA（吲哚乙酸）是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低,是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素， 對(duì)器官形成的副作用小，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA（萘乙酸）在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成， 耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)莖的增殖。IB

58、A（吲哚丁酸）是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）起動(dòng)能力比高倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高， 但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95酒精助溶。2，4D可用0.1mol/l的NaOH或KOH助溶。生長(zhǎng)素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。 （2）赤霉素（GA）有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚發(fā)育成小植株，促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。此外，赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長(zhǎng)素赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分

59、化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化。此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。赤霉素溶于酒精，配制時(shí)少量可用95酒精助溶。赤霉素不耐熱，高壓滅菌后將有70100失效，應(yīng)當(dāng)采用過濾滅菌法加入。（3）細(xì)胞分裂素類 這類激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6芐基氨基嘌呤）、Kt（激動(dòng)素）、ZT（玉米素）等。其中ZT活性最強(qiáng)，但非常昂貴。常用的是6-BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素相互作用，當(dāng)組織內(nèi)細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素的比值高時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織或器官分化出不定芽。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑

60、制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時(shí)使用。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的細(xì)胞類型，決定著愈傷組織再分化， 是長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度， 或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg/L（即ppm）表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度， 因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異,一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.055mg/L， 細(xì)胞分裂素0.0510mg/L。5培養(yǎng)材料的支持物(1)瓊脂 在固體培養(yǎng)時(shí)瓊脂是最好的固化劑。固體培養(yǎng)基利于組織置于培養(yǎng)基表面。瓊脂是一種由