rs4242384多態(tài)性與前列腺癌遺傳易感的相關(guān)研究資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。rs4242384多態(tài)性與前列腺癌遺傳易感的相關(guān)研究-rs4242384多態(tài)性與前列腺癌遺傳易感的相關(guān)研究前列腺癌(prostatecancer,PCa)在西方國家中已然成為中老年男性最常見的惡性腫瘤之一，死亡原因占男性罹患癌癥的死亡原因的第二位1。就目前情況來看，我們中國的前列腺癌發(fā)病幾率還尚低于西方許多國家，但隨著近十年來我國人口日漸趨于老齡化，并且我國國人的生活條件的不斷的改善，前列腺癌病的發(fā)病幾率卻有著明顯上升的趨勢。在中國乃至全亞洲，前列腺癌病已然成為男性泌尿、生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中的發(fā)病率躍居第

2、三位，可以看出人類的50歲以上男性的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命政治慢慢下降，正在被前列腺癌病悄悄影響著，已然成為泌尿生殖外科乃至于整個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)越發(fā)顯得重要的課題。近些年，我國的前列腺癌病的發(fā)病幾率也有明顯上升，雖然已經(jīng)有了零星報(bào)道我國一些局部地區(qū)的前列腺癌病的發(fā)病幾率，但大面積且大宗發(fā)病幾率及分布情況調(diào)卻一直查尚無系統(tǒng)發(fā)布。曾有學(xué)者對引起前列腺癌發(fā)病的大量相關(guān)因素進(jìn)行了非常大量的調(diào)查，其目的就是為了探討我國前列腺癌病的發(fā)病幾率上升原因，截至目前為止，我們已經(jīng)可以明確年齡、種族和家族史肯定是與前列腺癌病發(fā)病幾率和患病風(fēng)險(xiǎn)存在正相關(guān)性的主要的幾個(gè)因素2，這些大量的調(diào)查中學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)了前列腺癌病與某些

3、營養(yǎng)素（總脂肪、胡蘿卜素、硒、飽和脂肪酸、動(dòng)物脂肪）的攝入有著明顯劑量聯(lián)系，而與其他的營養(yǎng)微量元素（總能量、總蛋白質(zhì)、碳水化合物、視黃醇、維生素E、鎂、鋅、鐵、銅）的攝入?yún)s并無明顯的劑量相關(guān)關(guān)系。還有一些研究顯示，前列腺癌病的發(fā)病可能與男性性行為存在這一些微妙的關(guān)系，一些研究分析顯示：危險(xiǎn)性最大的就是首次遺精的年齡，首次遺精年齡越小，其發(fā)生前列腺癌病的危險(xiǎn)性也就越大，而且有著明顯的劑量相關(guān)反應(yīng)關(guān)系。在所以被調(diào)查的人群中，存在并且保持這手淫習(xí)慣的人發(fā)病的危險(xiǎn)性大大高于正常男性的發(fā)病幾率。再婚者或者有多個(gè)性伴侶的男性中發(fā)病危險(xiǎn)性最高，這也是國外一些婚姻狀態(tài)調(diào)查中顯示出來的。還有就是營養(yǎng)攝入情況與前

4、列腺癌病發(fā)生的關(guān)系，這一關(guān)系在前列腺癌病發(fā)生的原因中也一直受到廣泛關(guān)注。中國人、日本人等亞洲人群的前列腺癌發(fā)病率相對歐美國家低，許多跡象表明這可能與飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)系，亞洲人的飲食中有這更多的綠葉蔬菜、豆類、碳水化合物、纖維素、水果、干果、植物來源蛋白質(zhì)和脂肪，關(guān)鍵在于亞洲人飲食中占比例較低的是動(dòng)物蛋白和脂肪。所以目前主流研究都認(rèn)為這些植物性激素的食物質(zhì)中可能對前列腺癌病的發(fā)生有明顯的抑制作用，建議多使用含有較多的植物激素的食物。學(xué)者們就前列腺癌病的發(fā)生、發(fā)展以及發(fā)病后的診斷瘤標(biāo)、預(yù)后監(jiān)測等項(xiàng)目做出了大量大規(guī)模的研究。前列腺癌病的分子遺傳學(xué)及分子調(diào)控研究取得了令人矚目的巨大成果。但是在我國的前列腺

5、癌病研究中，各項(xiàng)基礎(chǔ)研究就相對的薄弱，我過的研究還主要集中在一些國外研究工作的重復(fù)上面，在這些重復(fù)的工作中絕大部分還集中在免疫組化研究和對前列腺癌的細(xì)胞株研究上，對多種基因側(cè)面的研究（癌基因和抑癌基因、多藥耐藥基因、雄激素受體、生長因子及其受體）在中國前列腺癌病發(fā)生中的表達(dá)和他們的意義，同時(shí)還對前列腺癌細(xì)胞株的抑制從基因療法側(cè)面進(jìn)行了研究，但尚未對國人前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的驚醒分子生物學(xué)層面進(jìn)行大規(guī)模的深入研究。目前，被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩選、診斷和隨訪檢測的指標(biāo)是前列腺特異性抗原（PSA）。PSA在診斷和鑒別前列腺癌或良性前列腺增生癥之中發(fā)揮了巨大作用，然而我們也是自1979年被科學(xué)家Wan

6、g等從前列腺組織內(nèi)分離和提純PSA得到之后才得以廣泛應(yīng)用的。我們知道的PCa的臨床癥狀表現(xiàn)在早期往往沒有任何的特異性，很多年來國際上將前列腺直腸指診(DRE)聯(lián)合血清前列腺特異性抗原(PSA)測定認(rèn)為是篩查PCa的最佳方法，但是血清中PSA-t對前列腺癌組織并無特異性?？茖W(xué)家們?yōu)榱颂剿髂切┮鹎傲邢侔┌l(fā)病的非編碼序列的特征及其生物學(xué)作用，不斷的對人類基因組深入研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這些非編碼序列有著極為深遠(yuǎn)的意義。近些年來，隨著這些方面的研究不斷的進(jìn)行，對腫瘤癌癥基因組多態(tài)性的大量研究都表明，這些非編碼RNAs對癌基因組多態(tài)的影響效果還是非常顯著的3。非編碼小分子RNA也就是通常意義上，人們所說的

7、miRNA，科學(xué)家們對miRNA做出了非常大量的研究，研究其對人類的疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)展中所起到的作用。同時(shí)國內(nèi)外的專家學(xué)者們已經(jīng)把miRNA與多種腫瘤的發(fā)病相關(guān)性的研究當(dāng)作一個(gè)最前沿?zé)狳c(diǎn)的課題了。miRNA從根本來說是一種非編碼的內(nèi)源性小分子，一種單鏈的RNA鏈。他之所以能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的編碼基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，原理是通過其與相對應(yīng)的靶mRNA特異結(jié)合來達(dá)到最終的調(diào)控的，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生差異性，最終最終導(dǎo)致人們罹患各種不同的疾病的。miRNA是1993年首次被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的，Croce小組又在2004年的時(shí)候提出了一個(gè)新的概念，即單個(gè)細(xì)胞內(nèi)全部miRNA的集合（miRNA組）的概念。miR

8、NA的研究已經(jīng)相當(dāng)?shù)牧钊瞬毮?，尤其是在腫瘤癌癥等復(fù)雜疾病領(lǐng)域，其研究結(jié)果更已經(jīng)被世界各國醫(yī)學(xué)界所應(yīng)用。miRNA與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系密切相關(guān)，這已經(jīng)被大量的相關(guān)研究所證明，miRNA對機(jī)體的單個(gè)細(xì)胞的生長發(fā)育4、乃至整個(gè)機(jī)體的生長發(fā)育及代謝5-7等重要生命活動(dòng)都參與調(diào)控，通過這些調(diào)控而對人體的各種相關(guān)疾病也可以進(jìn)行調(diào)控。人們在miRNA被發(fā)現(xiàn)的20年來進(jìn)行了大量研究，想要從全方位來了解miRNA是如何進(jìn)行分離的，而且還要對其的調(diào)控機(jī)制做到更深入的研究，只有了解了他的調(diào)控機(jī)制，才能更好的預(yù)防m(xù)iRNA調(diào)控相關(guān)的疾病。但是，即使有科學(xué)家們做了這些大量的研究，到目前為止miRNA調(diào)控中的精細(xì)過

9、程還是知之甚少，是目前醫(yī)學(xué)界的一個(gè)重要難題。在自然界中，miRNA是廣泛存在的，不論是哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、昆蟲及植物中，miRNA的調(diào)控都被發(fā)現(xiàn)過。秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了lin-4和let-7，那是miRNA最早于被發(fā)現(xiàn)的物種。而且已經(jīng)確認(rèn)有一千多種miRNA的調(diào)控，存在于有脊椎動(dòng)物的基因組中。而目前在人類茫茫的基因組中，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多的基因受到miRNA的調(diào)控，已確認(rèn)的也大約占人類基因組的1左右（500個(gè)），這些miRNA調(diào)控這機(jī)體各種相關(guān)的變化，其中參與癌癥相關(guān)的多個(gè)環(huán)節(jié)至少有五分之二的調(diào)控8。一個(gè)miRNA可以調(diào)控的mRNA是多少呢？這個(gè)數(shù)字比人們想象的要大很多，并不是單純的一對一的調(diào)控

10、，一個(gè)miRNA可以調(diào)控近兩百個(gè)mRNA，也就是說他與靶基因結(jié)合后，至少有三分之一的蛋白編碼收到調(diào)控，這意味著機(jī)體大多數(shù)編碼蛋白受到miRNA的調(diào)控影響而進(jìn)行表達(dá)9，這也就是人類的miRNA調(diào)控相關(guān)疾病的基本原理。提到腫瘤的遺傳和發(fā)病，大多數(shù)普通人們都會(huì)認(rèn)為是單基因遺傳的，每種疾病或是每種癌癥都由一個(gè)致病基因?qū)е?，最終導(dǎo)致腫瘤癌癥等復(fù)雜疾病在一個(gè)家族中“代代相傳”。然而事與愿違，這種單基因遺傳疾病其實(shí)是很少見的，尤其是在腫瘤癌癥等疾病中，單基因遺傳的情況更是少之又少，據(jù)統(tǒng)計(jì)不足百分之一。大多數(shù)腫瘤的發(fā)生不僅是遺傳因素所決定的，同時(shí)還受到環(huán)境因素的影響，更為重要的是，現(xiàn)今社會(huì)，越來越多的致癌因素

11、影響著我們的機(jī)體，所有的因素共同作用才引起了腫瘤的發(fā)生。而遺傳易感性因素中最為重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一就是基因的單核苷酸點(diǎn)突變所形成的基因多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)。眾所周知，致癌的環(huán)境因素有三大類，一類是包括輻射在內(nèi)的物理性因素，一類是比如苯丙芘、煙草等在內(nèi)的化學(xué)性因素，還有一種因素較為常見的，就是病毒、細(xì)菌等生物素。但不論那種因素，它們都會(huì)對機(jī)體緩慢的產(chǎn)生影響，不會(huì)立即致病。致癌效應(yīng)之所以能致癌，關(guān)鍵就在于時(shí)間，適宜劑量并且在一個(gè)相對持續(xù)性的作用，才最終導(dǎo)致病變。正是時(shí)間和劑量這兩個(gè)因素，使人體在癌變的整個(gè)過程中，通過自身免疫系統(tǒng)，對致癌因素代

12、償、抵抗、修復(fù)、排除。內(nèi)因和外因共同作用，只有達(dá)到了一定量的累計(jì)，才會(huì)最終造成病變的發(fā)生。不同的機(jī)體對各種慢性損傷的免疫能力有這明顯個(gè)體差異的，就算同一個(gè)體對不同種的疾病也有著不同程度的免疫能力。SNPs廣泛存在于基因中，它也是造成人體遺傳差異的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。SNPs的存在屬于一種疾病的易感因素，他也不會(huì)讓機(jī)體立即致病，但他的存在，可能會(huì)某種致病的易感因素作用更強(qiáng)，讓機(jī)體致病的幾率更高。在動(dòng)物幾千年的漫長進(jìn)化過程中，環(huán)境對基因的選擇貫徹從未停止，SNP就是在這樣的環(huán)境選擇中形成的。它們本身他也不會(huì)讓機(jī)體立即致病，但他的存在，可能會(huì)某種致病的易感因素作用更強(qiáng)，讓機(jī)體致病的幾率更高，甚至有這種可能

13、，就是在當(dāng)時(shí)的環(huán)境下，snps可能還是一種優(yōu)勢的突變。SNPs不僅是個(gè)體遺傳差異的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也是人種之間存在差異的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)之一，每一個(gè)基因上都存在SNP,但是每個(gè)SNP只有百分之一的幾率在人群被檢測出。在全基因組研究中，SNP的檢出率大約在千分之一到萬分之一之間11-15。世界上各個(gè)國家都開始對與人類基因組計(jì)劃并行或后續(xù)的SNPs項(xiàng)目著手研究，研究那些不同地區(qū)上國家的人群，研究這些人群中基因序列上表達(dá)的差異。如今各個(gè)國家都已經(jīng)做出了大量的單純SNPs的篩查數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)做為全球共享的資源，可以供各國引用參考。每天都有有大量的SNPs被發(fā)現(xiàn)，并不斷的被公之于眾。在我們國家，國內(nèi)一些大

14、型基因研究中心已經(jīng)開展了對國人SNP的篩查，尤其是對我國特有的本民族基因組中SNPs，展開了篩查。同時(shí)日益受到重視的還有一些問題，SNPs與疾病相關(guān)性的研究就是其中一項(xiàng)，但就目前的水平看來，不論國內(nèi)外的研究都遠(yuǎn)沒有形成大規(guī)模系統(tǒng)的研究。目前，學(xué)術(shù)界普遍利用與疾病基因關(guān)聯(lián)的DNA標(biāo)記，來發(fā)現(xiàn)前列腺癌等復(fù)雜疾病微效基因，是目前被視為最有力的方法，即SNP基礎(chǔ)上的關(guān)聯(lián)分析，也就是全基因組的關(guān)聯(lián)性研究(Genomewideassociationstudy,GWAS)。這項(xiàng)關(guān)聯(lián)性研究與以往的傳統(tǒng)的遺傳研究不同，只需研究一個(gè)群體中的病人與非病人的基因型變現(xiàn)，而不需他們的家系資料，當(dāng)一個(gè)遺傳標(biāo)記在病人中被發(fā)

15、現(xiàn)，而且出現(xiàn)的頻率在病人中明顯超過非病人時(shí)，就表明該標(biāo)記與疾病存在這關(guān)聯(lián)性。通過比較分析，對兩者的單倍型和連鎖不平衡進(jìn)行分析，關(guān)聯(lián)分析最終可將基因組中任何未知的致病基因定位。為了分析尋找與前列腺癌的SNP，國外在全基因組關(guān)聯(lián)進(jìn)行了許多相關(guān)的研究，但是結(jié)果還處于起步階段，但進(jìn)展令人矚目，其速度是極快的，已經(jīng)取得了的成果不勝枚舉。目前，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)前列腺癌SNP超過12個(gè)以上，同時(shí)也在多個(gè)獨(dú)立人群里隨后得到證實(shí)。SNPs用于PCa遺傳易感性研究的理論基礎(chǔ)是等位基因關(guān)聯(lián)，它是指疾病性狀的標(biāo)記等位基因發(fā)生率的顯著性改變（升高或下降），它代表著與疾病性狀的表現(xiàn)型相關(guān)的等位基因在隨機(jī)發(fā)生中的偏差。等位基因關(guān)

16、聯(lián)研究起源于變異（或多態(tài)性）的直接生物行為。該方法不需要對大量的家族遺傳的情況進(jìn)行分析，僅需在同一個(gè)群體中進(jìn)行研究，研究在這一個(gè)群體中病人的DNA與非病人DNA。當(dāng)一個(gè)遺傳標(biāo)記的頻率在病人明顯超過非病人時(shí)，這就表明該標(biāo)記與這一人群中的這種疾病存在關(guān)聯(lián)性?？梢詫Σ煌巳哼M(jìn)行同一個(gè)遺傳標(biāo)記的研究，來確定是否這一遺傳位點(diǎn)還對其他人群有發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。Collins等曾提出了假說，該假說認(rèn)為在廣大的人群中某些易感基因位點(diǎn)出現(xiàn)了常見的變異，這就導(dǎo)致了人們對這些常見的疾病有了易感性，尤其當(dāng)這些被視為常見的變異，存在與編碼區(qū)域或是調(diào)控區(qū)域中，這種疾病的易感性會(huì)更加明顯。如果這一假的正確性得到進(jìn)一步證實(shí)的話，那

17、么某一疾病的患者中檢測出了特異的SNPs，而同事這一SNPs又是在非患者中出現(xiàn)的頻率較低的話，我們會(huì)把這一位點(diǎn)與疾病進(jìn)行一定的關(guān)聯(lián)、分析，就有可能確定這一疾病易感性的SNPs。因此，在對罹患PCa的人群進(jìn)行研究的時(shí)候，我們通常要用到分析對比研究，這就要對同等數(shù)量的或是更多的正常的對照人群，用以進(jìn)行分析，這樣才能確定這一SNPs位點(diǎn)與PCa發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，因而可以應(yīng)用與PCa遺傳易感性的研究。我們都知道A、T、C、G4種堿基組成了人類的DNA遺傳密碼，因此我們有理由去得知，SNPs可能存在這二等位的多態(tài)性、三、四等位的多態(tài)性，甚至更多位的多態(tài)性。但是實(shí)際上三、四等位多態(tài)性的情況是非常少見的，幾乎

18、可以忽略掉。因此通常所說的SNPs都是二等位的多態(tài)性，檢測時(shí)能通過一種簡單的“+/-”分析進(jìn)行基因檢測分型，這就使得SNPs的檢測、分析易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化17-18。目前SNPs的檢測方法主要有傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法和高通量、自動(dòng)化程度較高的檢測兩大類：傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的，方式較為傳統(tǒng)的一大類，如：（1）PCR-SSCP（singlestrandconformationpolymorphism，單鏈構(gòu)象多態(tài)性法）；（2）PCR-RFLP（restrictionfrag-mentlengthpolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性法）；(3)DGGE,（denaturinggr

19、adientgeleletrophoresis，變性梯度凝膠電泳）；（4）PCRASPCR,（allelespecificPCR,等位基因特異性）等。這些傳統(tǒng)方法對設(shè)備要求不高，在大多數(shù)普通實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行，花費(fèi)也是相對較低的。雖然話費(fèi)較低，但是這種方法還是有他的缺點(diǎn)，就是速度慢，自動(dòng)化程度較差，這一確定就決定了該方法難以對SNP進(jìn)行大規(guī)模檢測。高通量、自動(dòng)化檢測的方法是近些年來逐步發(fā)展起來的，這種檢測SNP的方法自動(dòng)化程度高，目前大型實(shí)驗(yàn)室中常用，其包括：1.DNA直接測序法；2.脫氧核糖核酸的芯片檢測；3變性高效液相色譜法（DHPLC,denaruringhighperformanceliq

20、uidchromatograph）;4.飛行質(zhì)譜儀（MALDI-TOFMS,Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTime-Of-FlihgtMassSpectrometry）檢測；5.微測序技術(shù)（PEX,PrimerExtending）等方法，6.高分辨熔解曲線分析（HRM；high-resolutionmeltinganalysis）。（1）SPR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性是用內(nèi)切酶降解DNA樣品后做變性處理，非變性條件下，單鏈DNA內(nèi)堿基互作發(fā)生卷曲而形成一個(gè)較穩(wěn)定的空間構(gòu)象，DNA序列的改變會(huì)使卷曲DNA分子構(gòu)象發(fā)生變化，所以，有序列差異的DN

21、A分子通過非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，由于構(gòu)象不同，所受到的阻力大小也就不同，因此涌動(dòng)速度不同，從而可區(qū)分不同的SPN。（2）PCR-RFLP利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用與同一DNA片段，如果存在SPN位點(diǎn)，酶切片段的長度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否有SPN位點(diǎn)以及出現(xiàn)的堿基替換的類型。該技術(shù)應(yīng)用的前提是SPN的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，它是SPN篩查中最經(jīng)典的方法之一。SNP高通量、自動(dòng)化的檢測方法（1）HPLC法變性高效液相色譜法，其原理是通過把各種擴(kuò)增形成的DNA（各種純和雙鏈和雜合雙鏈DNA）吸附到固定相上，再對固

22、定相進(jìn)行加溫使DNA變性，其中錯(cuò)配的雜合雙鏈DNA熔點(diǎn)相對與完全配對的DNA低，解鏈時(shí)間自然會(huì)早于完全配對的純和雙鏈DNA。在不同的解鏈溫度條件下，兩種雙鏈DNA解鏈程度存在差異，這些差異最后導(dǎo)致電荷分布出現(xiàn)了不同，最終它們與層析柱之間的結(jié)合能力也會(huì)出現(xiàn)差異，在變性并不完全的情況下下，兩種二倍體在層流住柱中滯留時(shí)間也會(huì)出現(xiàn)差異，我們正是利用這樣的差異性，達(dá)到檢測目的DNA的堿基變異的最終目的。DHPLC只需要花費(fèi)幾分鐘，就能完整的檢測出一個(gè)樣品，并且是全自動(dòng)化的操作。其優(yōu)點(diǎn)顯而易見，快速、經(jīng)濟(jì)的檢測出單核苷酸多態(tài)性是現(xiàn)代話科研的方向，且無放射性的污染。但HPLC仍有不足之處，那就是不能鑒定出堿

23、基突變的具體位置，我們需要進(jìn)行新一次的測序才能篩選出新的突變或新的多態(tài)性。目前HPLC的主要應(yīng)用是用來檢測小的DNA片段，一般都是小于500bp一下的。我們就是利用HPLC篩查SNP的高效率，其效率優(yōu)于其他的電泳方法。因此，我們先通過DHPLC對試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行初步篩選，再對其中的一些峰型特異的序列再次進(jìn)行測序確認(rèn)，這樣就可以降低試驗(yàn)成本，大大的提高檢測檢測效率。（2）MALDI-TOFMS法基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，是指使用質(zhì)譜直接或者間接檢測等位基因特異性的延伸產(chǎn)物，質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品通過激光照射，離子化并攜帶單電荷進(jìn)入氣相，經(jīng)高壓脈沖電場加速后進(jìn)入無電場的漂移區(qū)，

24、樣品在漂移區(qū)中的飛行時(shí)間與速度成正比，而速度與加速度電場所做的功相關(guān)。當(dāng)電場電壓和飄逸區(qū)距離等參數(shù)確定時(shí)，對飛行時(shí)間進(jìn)行測定就能計(jì)算出樣品的質(zhì)荷比，根據(jù)不同離子的荷質(zhì)不同，應(yīng)用這一不同的差異來分析分離并確定分子量。質(zhì)譜分析最靈敏的指標(biāo)就是對質(zhì)量的靈敏度，所以將僅含有一個(gè)不同堿基的2段基因序列區(qū)別開是很輕松的。而且質(zhì)譜檢測還不需要熒光劑的標(biāo)記，樣本來源也是多源性的，可以是PCR產(chǎn)物，可是引物延伸反應(yīng)查無，可以是等位基因特異終止還可以是invader酶切產(chǎn)物等，我們通過質(zhì)譜檢測，可直接檢測不同質(zhì)量的樣品或探針，進(jìn)而可以推導(dǎo)出樣品的SNP，最終可以可用新發(fā)現(xiàn)的SNP與已知的SNP的分型進(jìn)行對比。還有

25、一種質(zhì)譜也被人們廣泛應(yīng)用，那就是基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，現(xiàn)在在SNP的檢測中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。引物延伸法結(jié)合基質(zhì)，從而輔助了激光解吸附電離飛行時(shí)間的質(zhì)譜，它也是是利用質(zhì)譜技術(shù)檢測SNP的一種特殊的形式，相較于一般性的引物延伸反應(yīng)，它的特點(diǎn)在于引物的5端會(huì)引入生物素，使延伸的產(chǎn)物能被估相結(jié)合從而達(dá)到純化的目的。我們在實(shí)驗(yàn)中利用質(zhì)譜分析，只需要幾秒鐘就能分析一個(gè)樣品，如果分析數(shù)千個(gè)樣品也不超過幾小時(shí)，其特點(diǎn)不言而喻，快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高和高通量等特點(diǎn)當(dāng)之無愧。由于它沒有了分子量的限制，而且效率和準(zhǔn)確性都大幅提高，已經(jīng)成為蛋白組計(jì)劃中的重要檢測工具之一。近年來，隨著與更多的前沿方法（

26、引物延伸法、測序法、肽核酸探針雜交法以及侵襲探針切割法等技術(shù)）的結(jié)合，MALDI-TOF-FS技術(shù)在SNP的檢測中，應(yīng)用的頻率越來越大了。但是這項(xiàng)技術(shù)方法也有不足，對分析樣品的分離純化程度要求很高是他最大的問題。（3）HRM檢測HRM（high-resolutionmeltinganalysis，高分辨熔解曲線分析）技術(shù)是近年國外興起的，這種方法是一種全新的對突變掃描的方法，同事還可以進(jìn)行基因分型的遺傳分析?；谀壳拔覀兊腜CR技術(shù)已經(jīng)很穩(wěn)定了，所以HRM已經(jīng)不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，所以在突變掃描過程中不再需要序列特異性探針，在PCR進(jìn)行結(jié)束后可以直接自動(dòng)運(yùn)行高分辨熔解。可完成對樣品突變、

27、單核苷酸多態(tài)性-SNP、甲基化、HLA配型等的多種分析。HRM技術(shù)受到了國內(nèi)外的普遍關(guān)注，究其原因主要有4點(diǎn)，操作簡便快速，這點(diǎn)最為重要，可以讓大家簡單上手。使用成本低，這點(diǎn)使HRM技術(shù)得以在國內(nèi)外推廣。結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。HRM的主要原理：DNA序列的長度各不相同，所以GC含量以及堿基互補(bǔ)性就存在了差異，其解鏈溫度是不同的，HRM就是應(yīng)用這一差異，在DNA在不同溫度熔解的過程中，進(jìn)行了高分辨率的熔解曲線，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分析的目的。HRM通過極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨的精度達(dá)到對單個(gè)堿基間的差異進(jìn)行區(qū)分。隨著高精度PCR儀（LightCycler480和Rotor-Ge

28、ne6000）和飽和染料（LCGreen、EvaGreen等）的出現(xiàn)，HRM技術(shù)的會(huì)越來越被廣泛的普及使用。HRM應(yīng)用已在多種方面得到廣泛應(yīng)用，如SNP（單核苷酸多態(tài)性）的篩查、基因突變掃描，包括缺失、重復(fù)、點(diǎn)突變、新突變的篩查、甲基化的篩查、遺傳育種中特定突變的篩查、未知突變的發(fā)現(xiàn)、HLA基因組配型、等位基因頻率分析、物種鑒定、品種鑒定、甲基化研究、法醫(yī)學(xué)鑒定、親子鑒定、動(dòng)植物品質(zhì)相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的研究等。植物抗逆性，突變與性狀關(guān)聯(lián)性研究。HRM檢測有著高通量、高敏度、特異性好、重復(fù)性好、適用范圍廣、操作簡便的特點(diǎn)：重復(fù)性好：HRM技術(shù)可以達(dá)到完全重復(fù)之前的試驗(yàn)結(jié)果。操作簡便：只需設(shè)計(jì)特異引物

29、，之后的檢測完全由HRM儀器全自動(dòng)檢測。成本低：由于HRM儀器將檢測步驟簡化，檢測的時(shí)間就大大的降低了，從而節(jié)約了成本。標(biāo)本范圍廣：可用各種新鮮樣本或者已經(jīng)固定的樣本，（新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本），甚至是微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等標(biāo)本，都可以應(yīng)用HRM的檢測。其它：只針對PCR樣品中熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行檢測，所以不會(huì)消耗任何PCR樣品，更不會(huì)對PCR樣本造成污染，故進(jìn)行完HRM的PCR產(chǎn)物，仍然可以進(jìn)行下游分析，不會(huì)存在任何誤差影響，所以非常適合于測序前的SNP篩查。綜上所述的HRM技術(shù)的優(yōu)勢，HRM技術(shù)已經(jīng)悄然成為國內(nèi)外SNPs篩查的不二選擇。萬事開頭難，我們對SNP

30、s的研究還處于起步階段，對于snp的關(guān)鍵部位還沒有完全把握，所以利用snps去研究前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和遺傳易感性的成果更是少之又少。雖然，我們已經(jīng)有了以上那么多的先進(jìn)方法，已經(jīng)使我們的工作簡化了許多，使工作更容易進(jìn)行，這樣能讓我進(jìn)行的研究從數(shù)量上得以迅速增加。但是迄今為止，即使科學(xué)家們做了大量的研究，但是這些研究所做出的結(jié)果卻是不盡如人意的。同事，隨著科學(xué)家們進(jìn)行的研究的數(shù)量級的增加，一些問題也隨之暴露出來。但是我們只有發(fā)現(xiàn)問題，并去很好的將問題解決，這樣才能更好的利用我們所掌握的方法，進(jìn)一步的去檢測SNPs。目前最常見的問題就是研究結(jié)果的一致性較差。同一組病例-對照研究對象，但是其研究結(jié)果可

31、能會(huì)出現(xiàn)較大的差異，學(xué)者們已經(jīng)開始廣泛的重視這一情況了，也對這種情況產(chǎn)生的原因做出了分析。其原因主要有一下幾點(diǎn)，首先就是DNA的遺傳異質(zhì)性、及其表形和結(jié)構(gòu)太過復(fù)雜，就算是最先進(jìn)的方法，也難以確定無誤的對其檢測。其次就是基因與環(huán)境相互作用的復(fù)雜性和不同種族之間的差異性等因素。還有一點(diǎn)比較重要的原因就是研究樣本少，這一原因才是最為重要的原因。研究樣本數(shù)量少這一原因不是試驗(yàn)人員的技能或者儀器精密性提高就能避免的，因?yàn)榍傲邢侔┑牟±龜?shù)本來在全世界范圍來看也不是常見的，所以病例組的樣本來源是十分有限。目前主要的辦法之一是聯(lián)合多家單位共同收集病例標(biāo)本，小一點(diǎn)規(guī)模的可以匯總本地市幾家醫(yī)療機(jī)構(gòu)共同采樣，大一點(diǎn)

32、的也可以同一地區(qū)，同一國家更或者是同一大洲的醫(yī)療機(jī)構(gòu)共同匯總進(jìn)行分析，才能盡量擴(kuò)大病例組的數(shù)量級，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。另外，還有另一種有效的方法，可以提高檢測的準(zhǔn)確性，就是進(jìn)行meta分析。但meta分析的前提是病例資料要有一定的規(guī)范，至少應(yīng)包括性別、年齡、種子、入選的基礎(chǔ)等必要信息。本次試驗(yàn)查閱大量資料，通過NCBI、GENOME數(shù)據(jù)庫的資料發(fā)現(xiàn)，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GenomeWideAssociationStudies,GWAS)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了70個(gè)PCa相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)變異，看似已經(jīng)有很多的風(fēng)險(xiǎn)變異已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是基于家族的連鎖分析發(fā)現(xiàn)，大部分的風(fēng)險(xiǎn)變異存在于HPC區(qū)域，而在這些區(qū)域的風(fēng)險(xiǎn)變異在

33、人群中復(fù)制的成功的可能性很小，缺乏普遍研究意義。盡管GWAS研究本身也有很多問題，如鑒定的變異的關(guān)聯(lián)風(fēng)險(xiǎn)性都是很低變異風(fēng)險(xiǎn)，占的遺傳因素很小，可能就是基因序列的某一個(gè)或者幾個(gè)堿基的變化，但相比家族連鎖研究，GWAS鑒定出常見的但是外顯率很低的易感等位基因還是很有可能。另一方面，自從歐洲、拉丁美洲人群開始大規(guī)模參與PCa相關(guān)的GWAS以來，許多的PCa易感風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)在多個(gè)人種中被研究，并且已經(jīng)在其他人種中驗(yàn)證了這些風(fēng)險(xiǎn)基因的風(fēng)險(xiǎn)性，如日本人群GWAS研究確定的24個(gè)PCa風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)中19個(gè)與歐美人群報(bào)道的相同，PCa的易感位點(diǎn)區(qū)域8q24上的位點(diǎn)也在多種人群中復(fù)制驗(yàn)證，但是又由于遺傳異質(zhì)的存在，還有

34、就是基因與環(huán)境相互作用的復(fù)雜性和不同種族之間的差異性等因素的共同作用，使這些PCa風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)在不同種族中又不盡相同。2006年9月，F(xiàn)reedmanML19等在ProcNatlAcadSciUSA報(bào)告中提到：，通過對非裔美國人群進(jìn)行的大量調(diào)查研究，最終利用了混合基因定位等方法，鑒定出一個(gè)新的前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)性位點(diǎn)，也就是目前人們研究最多的8q24位點(diǎn)。他們利用全基因組掃描了1579個(gè)非裔美國人，從這些受檢者中發(fā)現(xiàn)了8q24，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了位于8q24上的一個(gè)小片段，其長度約3.8Mb，雖然長度很小，但是他與前列腺癌的易感性非常明顯。研究這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，有它獨(dú)有的臨床意義，是因?yàn)楫?dāng)時(shí)經(jīng)診斷而確診為前列腺癌的

35、男性中，有很多都是非洲裔的，而且年齡都小于72歲，這一研究結(jié)果預(yù)示著，在非裔美國人群中，年齡是一個(gè)相當(dāng)重要的影響因素，進(jìn)一步可以說，前列腺癌的發(fā)病與年齡正相關(guān)的流行病學(xué)結(jié)果。隨后有很多專家進(jìn)行了前列腺癌的連鎖分析，隨后又做了許多精細(xì)作圖來分析證實(shí)8q24這一區(qū)域于前列腺癌發(fā)病相關(guān)聯(lián)。GudmundssonJ20等在2007年5月的NatGenet的報(bào)告中提到：我們最近發(fā)現(xiàn)的了8q24區(qū)域中一個(gè)新的易感位點(diǎn)，在與8q24區(qū)域的另一個(gè)前列腺癌易感位點(diǎn)聯(lián)合后，在偶卓國家前列腺癌患者中進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示大約1113的歐洲血統(tǒng)的前列腺癌病人可以檢測出兩者的存在，并且同時(shí)31非裔美國人的病人當(dāng)中檢測出兩者存在。他們這次是通過4次重復(fù)研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的，他們對1453個(gè)病人和3064個(gè)對照的全基因組關(guān)聯(lián)性進(jìn)行反復(fù)的試驗(yàn)，通過用IlluminaHumanHap300BeadChip的方法得出了以上的結(jié)果。而目前在中國人群的PCa關(guān)聯(lián)