9第九章經(jīng)典液相色譜法課件

1、第九章 經(jīng)典液相色譜法 123經(jīng)典液相柱色譜法液相色譜的固定相和流動相液相色譜法類型平面色譜法薄層掃描法簡介第1頁，共64頁。本章要求掌握熟悉了解液相色譜技術(shù)的基本原理吸附等溫線液相色譜技術(shù)的基本操作第2頁，共64頁。3 液相色譜法類型LC 以液體為流動相的色譜法稱為液相色譜法Liquid Chromatography定義第3頁，共64頁。4 -按分離效能分類經(jīng)典液相現(xiàn)代液相-按操作形式-按分離機制液相色譜法類型第4頁，共64頁。5 常壓下靠重力或毛細作用輸送流動相的色譜方法經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典柱色譜法平面色譜法現(xiàn)代液相色譜法高壓輸液泵輸送流動相高效液相色譜法（HPLC）液相色譜法類型第5頁，共

2、64頁。6 液相色譜的固定相和流動相吸附色譜分配色譜離子交換色譜空間排阻色譜第6頁，共64頁。7 吸附色譜固定相吸附劑流動相有機溶劑溶質(zhì)基于吸附現(xiàn)象而獲得分離的液-固色譜分析方法分離分析極性至弱極性的化合物液相色譜的固定相和流動相第7頁，共64頁。8 1.對吸附劑的要求1）有較大表面積和足夠的吸附能力，對不同物 質(zhì)吸附能力不同2）與洗脫劑、溶劑、樣品不起化學反應(yīng)，且不 溶于洗脫劑和溶劑3）粒度細而均勻吸附色譜的固定相液相色譜的固定相和流動相第8頁，共64頁。9 2. 常用吸附劑-有機類： 活性炭、淀粉、蔗糖等、聚酰胺、大孔樹脂-無機類： 氧化鋁、硅膠、硫酸鈣、滑石粉、硅藻土等液相色譜的固定相和

3、流動相第9頁，共64頁。10液相色譜的固定相和流動相第10頁，共64頁。11 1）硅 膠（SiO2xH2O)吸附能力：取決于骨架表面硅羥基-極性吸附劑吸附機理：氫鍵作用-硅羥基為質(zhì)子給予體適用范圍：適用于分離酸性和中性化合物活化溫度：105110物質(zhì)的極性越大，硅膠吸附能力越強溶劑的極性越弱，硅膠吸附能力越強化學反應(yīng)將有機分子以共價鍵連接在硅羥基上，則成為化學鍵合固定相，按鍵合官能團極性分為極性鍵合相及非極性鍵合相液相色譜的固定相和流動相第11頁，共64頁。12 2） 氧化鋁優(yōu)點：分離能力強、活性可控分類：酸性、中性、堿性，以中性氧化鋁使用較多用途：酸性-分離酸性化合物，如有機酸中性-分離生物

4、堿、揮發(fā)油、萜類、甾體、蒽醌以及在酸堿中 不穩(wěn)定的苷類、醌、內(nèi)酯堿性-分離堿性和中性化合物，如生物堿類活化溫度：200400活化：一定溫度下加熱除去水分以增強活性的過程失活：一定溫度下加入一定量水分使吸附劑活性降低的過程液相色譜的固定相和流動相第12頁，共64頁。含水量（%）活度級別吸附能力硅膠氧化鋁051525380361015含水量越低，活度級別越小，吸附能力越強。含水量越高，活度級別越大，吸附能力越弱。吸附劑的吸附能力常稱為活度或活性液相色譜的固定相和流動相第13頁，共64頁。14 3）聚酰胺常用種類：聚己內(nèi)酰胺作用機理：氫鍵作用（1）酰胺基中的羰基 與酚類、黃酮類、酚類中的羥基或羧基形

5、成氫鍵（2）酰胺基中的氨基 與醌類、硝基類中的醌基、硝基形成氫鍵液相色譜的固定相和流動相第14頁，共64頁。15 4）大孔吸附樹脂 定義：不含交換基團，有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子 吸附劑種類：非極性和中等極性兩類范圍：水溶性化合物的分離純化液相色譜的固定相和流動相第15頁，共64頁。16 組分在色譜柱中的移動速度和分離效果取決于：1. 吸附劑對樣品各組分的吸附能力-吸附活性2. 洗脫劑對各組分的解吸能力-極性大小3. 待分離各組分本身極性差異-結(jié)構(gòu)性質(zhì)吸附色譜的條件選擇液相色譜的固定相和流動相第16頁，共64頁。171. 化合物的極性及其判斷規(guī)律常見化合物按其極性由小到大順序為：烷烴烯烴醚硝基化合

6、物二甲胺酯類酮類醛類硫醇胺類酰胺類醇類酚類羧酸類依據(jù)規(guī)律：（1）基本母核相同基團極性越強，整個分子極性越強（2）分子中雙鍵越多，吸附能力越強 共軛雙鍵越多，吸附能力也越強（3）基團的空間排列能形成分子內(nèi)氫鍵吸附能力較弱液相色譜的固定相和流動相第17頁，共64頁。18 分離極性小的物質(zhì)，選用吸附能力強的吸附劑分離極性大的物質(zhì)，選用吸附能力弱的吸附劑2. 吸附劑的選擇液相色譜的固定相和流動相第18頁，共64頁。19 常用溶劑的極性順序為：石油醚環(huán)己烷四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷乙醚氯仿乙酸乙酯丙酮正丁醇乙醇甲醇水乙酸3. 流動相的選擇分離極性大的物質(zhì)應(yīng)選用極性大的溶劑分離極性小的物質(zhì)應(yīng)選用極性弱

7、的溶劑液相色譜的固定相和流動相第19頁，共64頁。20選擇色譜分離條件時，必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動相三方面綜合考慮。 吸附色譜三要素之關(guān)系液相色譜的固定相和流動相第20頁，共64頁。21分配色譜正相分配色譜：固定相的極性大于流動相反相分配色譜：固定相的極性小于流動相比較項目正相色譜法（NP）反相色譜法（RP）固定相強極性非極性流動相弱-中等極性中等-強極性出峰順序極性弱的組分先出峰極性強的組分先出峰保留值與流動相極性的關(guān)系隨流動相極性增大保留值減小隨流動相極性增大保留值增大適于分離的物質(zhì)極性物質(zhì)弱極性物質(zhì)液相色譜的固定相和流動相第21頁，共64頁。22分配色譜的固定相固定相：載體+固定液

8、某種溶劑涂布在吸附劑顆粒表面或紙纖維上，形成液膜正相分配色譜法：水、各種緩沖劑、稀硫酸、甲醇、甲酰胺、丙二醇等強極性溶劑及它們的混合液等反相分配色譜法：硅油、液體石蠟等極性較小的有機溶劑1. 固定液液相色譜的固定相和流動相第22頁，共64頁。232. 常用的載體（只起負載固定相的作用 ）（1）硅膠：吸收本身重量50%以上水分后喪失吸附作用（2）硅藻土：應(yīng)用最多的載體-硅藻土中氧化硅性質(zhì)較為 致密，幾乎不發(fā)生吸附作用（3）纖維素：紙色譜的載體，也是分配柱色譜常用載體3. 對載體的要求 化學惰性 對固定液有較強吸附性，但對組分無吸附性 顆粒大小均勻，純凈液相色譜的固定相和流動相第23頁，共64頁。

9、244. 流動相正相色譜：石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷類、苯或混合物反相色譜：水、各種水溶液（包括酸、堿、鹽及緩沖液）、低級醇類要求：與固定液不互溶，極性相差較大對樣品組分的溶解度足夠大，又相對小于固定液對組分的溶解度液相色譜的固定相和流動相第24頁，共64頁。分配色譜的條件選擇先使用對各組分溶解度大的溶劑為洗脫劑再根據(jù)實際分離情況改變洗脫劑的組成即：在流動相中加入一些可調(diào)節(jié)溶解度的溶劑，以改變各組分待分離的情況與洗脫速率液相色譜的固定相和流動相第25頁，共64頁。26離子交換劑為固定相水或與水混合的溶劑為流動相根據(jù)離子交換劑對各組分離子親合力不同使其分離離子交換色譜(ion exchan

10、ge chromatography)液相色譜的固定相和流動相第26頁，共64頁。27離子交換樹脂包括基體離子和可交換離子分類：陽離子交換樹脂-含-SO3H、-COOH陰離子交換樹脂-含-NH2、NHR規(guī)律：組分離子對基體離子的親合力越大，即交換能力越強，就越易交換到離子交換劑上，保留時間就越長離子交換色譜的固定相液相色譜的固定相和流動相第27頁，共64頁。28空間排阻色譜法定義：利用某些凝膠對不同組分因分子大小不同而阻滯 作用不同的差異而進行分離的方法實質(zhì)：分子篩效應(yīng)固定相：化學惰性多孔物質(zhì)凝膠分類： 根據(jù)流動相的不同 以有機溶劑為流動相，稱為凝膠滲透色譜法 以水溶液為流動相，稱為凝膠過濾色譜

11、法液相色譜的固定相和流動相第28頁，共64頁。29固定相的類型葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠葡聚糖凝膠LH-20聚苯乙烯凝膠親水性凝膠親脂性凝膠液相色譜的固定相和流動相第29頁，共64頁。硅膠吸附柱色譜聚酰胺柱色譜法離子交換柱色譜法凝膠柱色譜法經(jīng)典液相柱色譜法第30頁，共64頁。31平面色譜法借用毛細作用的原理輸送展開劑（流動相），色譜過程在平面上進行的方法。固定相成平面狀態(tài)，試樣溶液點于平面一端，在相對密閉的容器中展開（分離）后，根據(jù)組分在平面上移動的距離和濃度進行分析。常用有薄層色譜法和紙色譜法第31頁，共64頁。32 1）比移值Rf2）相對比移值(Rst) 3）分離度（Rs）平面色譜

12、法的定性參數(shù)平面色譜法第32頁，共64頁。33比移值Rf在薄層色譜法中，用比移值Rf表示各組分在色譜中的保留行為Rf表示物質(zhì)色譜特性的參數(shù)，可用以定性分析平面色譜法第33頁，共64頁。34 在給定條件下，Rf值為常數(shù)，其值在01之間Rf=0 表示化合物在薄層上不隨溶劑擴散移動，仍在原點位置Rf=1 表示溶質(zhì)不進入固定相，即表示溶質(zhì)和溶劑同步移動一般要求Rf值0.2 0.8之間，最佳范圍0.30.5平面色譜法第34頁，共64頁。35 影響Rf值的因素：分離對象的化學結(jié)構(gòu)固定相的組成及性質(zhì)流動相的組成及性質(zhì)介質(zhì)的影響（包括實驗室及展開箱的濕度、溫度、飽和與否、上樣量等等）平面色譜法第35頁，共64

13、頁。36 解決方法：由于Rf值重現(xiàn)性差，進行定性困難的問題，可以采用相對比移植Rst來定性。平面色譜法第36頁，共64頁。37參照物-另外加入的某一物質(zhì)的純品-試樣混合物中的某一組分Rf VS. Rst-取值范圍不同: Rf值小于1，Rst值不一定小于1相對比移值(Rst) 試樣中某組分的移動距離與參照物移動距離之比平面色譜法第37頁，共64頁。38l2、l1-原點至兩斑點中心的距離d-兩斑點中心間的距離W1、W2-兩斑點的寬度分離度(Rs) 兩相鄰斑點中心間距離與兩斑點平均寬度（直徑）的比值現(xiàn)行版中國藥典規(guī)定薄層色譜法中：Rs1平面色譜法第38頁，共64頁。39 固定相-均勻涂鋪在具有光潔表

14、面的玻璃、鋁箔、塑料片或金屬板上形成薄層流動相-展開劑分離過程-混合試樣溶液置于薄層板一端確定位置（點樣），在相對密閉容器中用適當?shù)恼归_劑展開，通過物理或物理化學的方法觀察組分斑點的移動距離，根據(jù)Rf或Rst及斑點大小進行定性定量分析的方法薄層色譜法thin layer chromatography，TLC平面色譜法第39頁，共64頁。1）常用吸附劑硅膠200300目硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254氧化鋁堿性氧化鋁、酸性氧化鋁和中性氧化鋁氧化鋁H、氧化鋁G和氧化鋁HF254平面色譜法第40頁，共64頁。2）展開劑及其選擇 一般原則：與吸附柱色譜法中選擇流動相的原則相同主要根據(jù)：-

15、被分離物質(zhì)的極性-吸附劑的活性-展開劑本身的極性點滴實驗法平面色譜法第41頁，共64頁。42規(guī)律：酸性組分-加入一定比例的酸，可防止斑點拖尾堿性物質(zhì)-氧化鋁為吸附劑，中性溶劑為展開劑 硅膠為吸附劑，堿性展開劑；堿性較弱的生物 堿可使用中性展開劑 平面色譜法第42頁，共64頁。43 3）操作技術(shù)選 擇制 板點 樣展 開檢 視分 析平面色譜法第43頁，共64頁。44 選擇(1)選板：玻璃板、塑料膜、金屬鋁箔 表面光滑、平整清潔(2)固定相（吸附劑） 粘合劑：CMC-Na、煅石膏、淀粉等(3)流動相（展開劑）(4)顯色劑平面色譜法第44頁，共64頁。45 制板將吸附劑均勻地涂鋪在玻璃板上使成薄層步驟

16、：(1)吸附劑的涂布 (2)板的活化平面色譜法第45頁，共64頁。46 (1) 吸附劑的涂布 硬板(加粘合劑) 硅膠 軟板(不加粘合劑) 氧化鋁 硬板的涂鋪方法： 傾注法 、平鋪法、涂鋪器 、噴霧法平面色譜法第46頁，共64頁。47 (2)板的活化 鋪成的薄層，置于水平臺面上晾干（也可以熱風吹干） 置烘箱中于105110活化0.51小時平面色譜法第47頁，共64頁。48 點樣 一般使用微量注射器或毛細管點樣 平面色譜法第48頁，共64頁。49 注意事項：溶劑、點樣量和正確的點樣方法（1）溶劑應(yīng)易揮發(fā)，不要以水為溶劑改變吸附劑活度（2）樣品濃度不能過高產(chǎn)生拖尾 濃度也不能過低起始點為空心點，色譜

17、斑點畸形 對照品濃度控制在幾mg/mL（3）點樣體積宜在20l以下、直徑3mm，需分次點加（4）點加量一般為幾幾十mg 過多斑點太大，形狀不良 太少斑點模糊或無法顯色（5）原點距離底邊、兩側(cè)邊及點與點之間的距離大于1cm（6）點樣管用內(nèi)徑約0.51mm的毛細管，管口應(yīng)平整（7）點樣操作需迅速暴露空氣中時間過長吸水降低活性平面色譜法第49頁，共64頁。50 展 開（1）展開原理（2）展開裝置（3）展開方式（4）展開劑的選擇（5）邊緣效應(yīng)平面色譜法第50頁，共64頁。51 （1）展開原理將薄板一端浸入展開劑，點樣處不可接觸展開劑，展開劑借助毛細作用上升，帶動樣品中組分的遷移。平面色譜法第51頁，共

18、64頁。52（2）展開裝置立式臥式平面色譜法第52頁，共64頁。53（3）展開方式軟板只能進行近水平展開硬板可以進行近水平、下行、上行、徑向、雙向、多次展開，其中以上行法展開最為常用平面色譜法第53頁，共64頁。54 （4）展開劑的選擇首選單元溶劑，再選混合溶劑（由簡至繁） 若二元溶劑系統(tǒng)不夠理想可考慮多元溶劑系統(tǒng)平面色譜法第54頁，共64頁。55 （5）邊緣效應(yīng) 定義：同一組分的色譜斑點在同一薄層板上出現(xiàn)在邊緣部分的Rf與中間部分的Rf有差異的現(xiàn)象產(chǎn)生原因：色譜缸內(nèi)溶劑蒸氣未達飽和，造成展開劑的蒸發(fā)速率在薄層板兩邊與中間部分不等邊緣部分的Rf相對較大平面色譜法第55頁，共64頁。56 減少邊緣效應(yīng)的辦法：用較小體積的展開缸或?qū)⒈釉诟變?nèi)放置一定時間待溶劑蒸汽達到飽和后再展開在展開缸內(nèi)壁貼上浸濕展開劑的濾紙條采用3cm以下的狹小薄板，只點23個點平面色譜