植物基因克隆原理和技術

1、關于植物基因的克隆原理與技術第一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月內 容一基因克隆所需要的酶和載體二植物轉化載體的構建三基因克隆的方法第二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆所需要的酶和載體第三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一般認為基因工程誕生于1973年上世紀40年代70年代初分子生物學領域理論上的三大發(fā)現和技術上的三大發(fā)明 對于基因工程的誕生起到了決定性的作用。第四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1- DNA是遺傳物質被證實1944年，Avery O.T.肺炎雙球菌轉化實驗第五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2- D

2、NA雙螺旋模型的提出Watson 和Crick 1953年，James Watson 和Francis Crick提出了DNA的雙螺旋模型。第六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3 “中心法則”的提出以Nireberg等為代表的一批科學家確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一個氨基酸，到1966年，全部破譯了64個密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。第七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 工具酶的發(fā)現和應用 Smith等分離并純化了限制性核酸內切酶Hind II， 1972年，Boyer等相繼發(fā)現了coR I 一類重要的限制性內切酶。

3、 Werner Arber 1968年發(fā)現限制酶第八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 工具酶的發(fā)現和應用 1967年，世界上五個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現DNA連接酶，特別是1970年Khorana等發(fā)現的T4 DNA連接酶具有更高的連接活性。第九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2 反轉錄酶的發(fā)現和應用1970年，Baltimore等和Temin等各自發(fā)現了反轉錄酶，完善了中心法則，使單個真核基因的制備成為了可能。第十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3 載體的發(fā)現和應用 1972年，美國Stanford大學的P.Berg等首次成功地實現了DNA的體外重組。第

4、十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3 載體的發(fā)現和應用 1973年，Stanford大學的Cohen等成功地利用體外重組實現了細菌間性狀的轉移。這一年被定為基因工程誕生的元年。第十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月提取目的DNA酶切DNA片段導入到細菌中重組菌的篩選序列分析和基因表達等研究植物基因工程的基本流程載體第十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆所需要的酶類限制性內切核酸酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA修飾酶核酸外切酶單鏈DNA內切酶“ ”第十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、限制性核酸內切酶的發(fā)現2、限制性核酸內切酶

5、的命名和分類3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、限制性核酸內切酶的消化反應 限制性核酸內切酶第十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性內切核酸酶的發(fā)現50年代發(fā)現了大腸桿菌具有對付噬菌體和外來DNA的限制系統(tǒng)；60年代后期證明了細菌的限制和修飾系統(tǒng)；1968年，Meselson 和Yuan從大腸桿菌K和B中發(fā)現了I型限制性核酸內切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核酸內切酶Hind II，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。第十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制（Restriction）限制性內切酶將侵入

6、細菌體內的外源DNA切成小片斷。修飾（Modification）細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內切酶識別切割。第十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內切酶的概念 限制性核酸內切酶（ Restriction endonucleases）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內切酶。已經從近300種微生物中分離出了2300種，其中商品化的限制性核酸內切酶500余種。第十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性核酸內切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成

7、3個斜體字母的略語表示酶來源的菌種名稱。如：大腸桿菌Escherichia coli 表示為Eco ；屬名流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為Hin；種名第十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2、修飾性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco3、用一個正體字母表示菌株的類型 如Escherichia coli RY13 Eco R4、以羅馬數字表示分離出來的先后順序 如Eco R I、 Hin d III第二十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性內切核酸酶類型：目前鑒定出三種不同類型的限制性內切酶。I 型限制性內切酶I

8、I 類限制性內切酶III類限制性內切酶限制性核酸內切酶的分類第二十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月不同類型核酸內切酶主要特性的比較分析I 型II 型III 型限制-修飾活性單一多功能的酶限制酶和修飾酶分開雙功能酶內切酶的蛋白質結構3種不同亞基單一成分2種不同亞基活性輔助因子ATP、Mg2+、SAMATP、Mg2+、SAMMg2+甲基化位點寄主特異性的位點特異性切割否是否基因克隆中的用途用途有限十分廣泛用途有限第二十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月II型限制性核酸內切酶的3大特點識別位點的特異性 識別序列的對稱性 切割位點的規(guī)范性第二十三張，PPT共一百五十八頁，

9、創(chuàng)作于2022年6月與II型核酸內切酶有關的幾個概念粘性末端 ( cohesive ends )：因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產生的兩個粘性末端很容易通過互補堿基的配對而重新連接起來。5端凸出（如EcoR I）3端凸出（如Pst I）第二十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月平 末 端 (Blunt end)：因酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端不易重新連接起來。第二十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月同裂酶 (isoschizomers )：能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同

10、內切酶。完全同裂酶識別位點和切點完全相同 如Hind 和Hsu I不完全同裂酶識別位點相同但切點不同如Xma I 和 Sma IHind 5-A AGCTT-3 3-TTCGA A-5 Hsu I 5-A AGCTT-3 3-TTCGA A-5Xma I 5-C CCGGG -3 3-GGGCC C-5 Sma I 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5第二十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月同尾酶(isocaudamers):識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。注 意：由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重

11、新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。BamH IG GATCCCCTAG G5-33-5Bgl II 5-A GATCT-3 3-TCTAG A-5 第二十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 經同尾酶消化的DNA末端連接示意圖5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXX

12、XXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II第二十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月影響酶活性的因素很多：DNA的濃度和質量是影響酶切的最為關鍵的因素 純度的鑒定：紫外吸光值A260/A280 濃度低于500ng/ L酶切消化的緩沖液 Mg2+ Tris-HCL BSA（牛血清蛋白）酶切反應的溫度（通常為37）影響酶切消化的其他因素 時間 體積 RNA限制性核酸內切酶的消化反應第二十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022

13、年6月酶切反應的基本步驟Buffer (10) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb0.4kb0.5kb0.6kb1.0kb電泳紫外分析37 1h加反應液CKMCKMTT第三十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、DNA連接酶作用的機理2、DNA連接酶的反應條件3、DNA連接的策略DNA連接酶及其應用第三十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA連接酶的發(fā)現T4DNA連接酶:由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。 容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所以在基

14、因克隆中應用廣泛。DNA連接酶:由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子。 從細菌DNA環(huán)化現象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。第三十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA連接酶作用的特點A. 連接的兩條鏈必須分別具有 3端自由羥基（-OH） 和5端磷酸基團（-P），而且只有這兩個基團彼此相鄰時才能進行連接反應；B. 連接反應必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。第三十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA連接反應的條件4 過夜加反應液轉化CK-CK+重組菌影響連接效率的因素有：溫度（最主要的因素）dNT

15、P的濃度(10M-1M)連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）反應時間（通常連接過夜）插入片段和載體片段的摩爾比第三十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月平末端DNA片段的末端加尾連接法33553355末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶第三十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月平末端DNA片段加接頭連接法 銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學合成的一段10-12個核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個或幾個限制性酶切位點。使用時只須將銜接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DN

16、A連接酶進行連接，就可獲得能產生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第三十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌DNA聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶Taq聚合酶 逆轉錄酶DNA聚合酶及其應用第三十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于

17、2022年6月DNA聚合酶35外切酶活性53外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenow fragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高逆轉錄酶無無低中Taq DNA聚合酶無有快高常用DNA聚合酶的特性比較第三十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉錄酶 一種可以有效地將mRNA轉錄成為DNA的酶，其產物稱為cDNA (complementary DNA)。實際上，是一種RNA依賴的DNA聚合酶。來源 RNA腫瘤病毒。 最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）和鼠白血

18、病毒反轉錄酶（avian myeloblastosis virus, M-MLV）AMV的性質 由和兩條多肽鏈組成。第四十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月聚合酶活性和 RNaseH活性。RNaseH： 經過蛋白酶水解后產生的一條多肽。以53或35方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNADNARNaseHRNADNA第四十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月逆轉錄酶的用途合成cDNA以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結合）。RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉錄出cDNA第一鏈。mRNA 5A A A A A AT

19、T T T T T 35mRNA 5A A A A A AT T T T T T 35第四十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA修飾酶末端脫氧核苷酸轉移酶T4多核苷酸激酶堿性磷酸酶細菌性堿性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase，BAP從大腸桿菌中分離出來。具有抗熱性。堿性磷酸酶小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來。SDS中加熱68可完全失活。第四十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月堿性磷酸酶的特性：催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。5 P-OH35

20、HO-P35 HO-OH35 HO-OH3堿性磷酸酶第四十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Hind酶切 5AAGCTT TTCGAA 5 堿性磷酸酶A-OH5P-AGCTTTTCGA-P5HO-AA-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A易載體自連堿性磷酸酶的功能防止線性化的載體份子自我連接第四十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月A-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A外源DNA5P-AGCTTA-OH33HO-ATTCGA-P5連接酶A-AGCTTAAGCTTTTCGA-ATTCGAA轉入細菌后會被修復第四十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作

21、于2022年6月基因工程載體第四十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆的本質是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達，而目的基因本身無法進行復制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細胞”來實現。第四十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。 能獨立于染色體而進行自主復制并且是高效的復制。 要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點 multiple cloning sites，MCS）。 有適合的標記，易于選擇。 有時還要求載體要能啟動外源基因進行轉錄及表達，并且盡可能是高效的表達。 從安全角度考

22、慮，要求載體不能隨便轉移，僅限于在某些實驗室內特殊菌種內才可復制等。 載體需要滿足的條件第四十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月載體分類根據功能分：克隆載體:克隆一個基因或DNA片斷表達載體:用于一個基因的蛋白表達整合載體:把一個基因插入到染色體組中根據來源： 質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體第五十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質粒載體第五十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質粒載體（plasimid vectors）1、質粒載體的生物學特性2、質粒載體相關知識介紹第五十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.質粒載體的生物學

23、特性（1）質粒是一種廣泛從在于細菌細胞中染色體以 外的能自主的復制的裸露的環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現了質粒。目前對細菌的質粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質粒。第五十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質粒的不親和性：兩種親緣關系密切的不同質粒不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存。質粒的存在形式：有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋3種。雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋）開環(huán)雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）第五十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質粒DNA的分子構型質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖L:松弛線性的DNA 松弛開環(huán)的O

24、C構型 超螺旋的SC構型 第五十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月作為基因工程載體，質粒至少應該具備復制的起始區(qū)、選擇標記基因區(qū)、多克隆位點等部分。第五十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月多克隆位點功能：用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內切酶位點組成。特點：每個限制性內切酶位點應該在整個載體中是唯一的。選擇標記基因：在基因工程中的一類用于選擇轉化細胞（菌）的抗性基因。功能：通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選擇得到轉化的細胞（菌）。第五十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6

25、月 -互補 (alpha-complementation) 大腸桿菌-半乳糖苷酶可以和其底物X-Gal 相互作用并且釋放出一種藍色物質，當該酶的-片段和-片段分開時就失去了這種顯色的功能。 通常將編碼該酶-片段的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側翼序列中。 在一些人工構建的大腸桿菌株系中只能編碼產生該酶的片段。這樣一來，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導入到這類寄主細胞中時，載體編碼的 -片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補并具有了對底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應），這種現象被稱為是 alpha-complementation。第五十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6

26、月 所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和誘導物IPTG的平板上分辨出來。因為這類菌落中釋放出的藍色物質可以將整個菌落染成藍色，非常容易辨別。第六十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月互補顯色反應 第六十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pBR322質粒載體 “P”表示是一種質粒； “BR”表示兩位主要構建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實驗編號。pBR3224363第六十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共一百五十八頁

27、，創(chuàng)作于2022年6月加反應液 AmpTet + Amp連接pBR3224363第六十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC質粒載體在pBR322的基礎上，組入了一個在其5-端帶有一段多克隆位點的lacZ基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。第六十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月pUC質粒載體的優(yōu)點:第一，具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因。 所編碼的-肽鏈可參與- 互補作用，用X-gal顯色對重組子進行鑒定，而pBR322質粒的重組子要進行兩步的選擇。 第二，具有多克隆位點MCS區(qū)段。

28、 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第六十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月穿梭質粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體。第六十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母ARSARS (autonomously replicating sequence自主復制序列)-染色體自主復制序列,是從酵母中克隆的真核細胞DNA復制起點序列。酵母每條染色體

29、由多個復制子組成,復制子平均長度為36kb。整個基因組約由400多個復制子組成。第七十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5-XTTXATXTXTX-3B1 B2B3ACS:能被復制起始位點蛋白ORC專一性識別也是ORC識別序列是轉錄因子ABF1的識別位點且B3可以遠在1kb以外同樣促進復制CA元件決定哪一段DNA序列作為復制起始位點，B元件可以增加復制起始位點的效率。 可能參與DNA雙鏈的解旋第七十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母整合質粒(YIps)酵母整合質粒(YIps)：細菌質粒含有一個酵母基因。是在p

30、BR322的基礎上插入了一個URA3基因，這個基因編碼乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶，可以作為選擇標記。YIp不能像質粒一樣復制，其復制依賴于整合到酵母的染色體上。URA3AMPr第七十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母附加質粒(YEps) YEps可以含有完整的2m質粒，也可以只含有2m質粒的復制起點；因為在載體中作為選擇標記的基因與突變體主染色體DNA同源性很高，可以獨立的復制也可以整合到酵母的染色體內。來自于2m質粒的載體稱為酵母附加載體或者YEps。第七十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 YEp克隆載體（酵母游離型質粒） 2m質粒的oriEcoR酶切 pB

31、R322質粒 酵母染色體URA3基因Hind酶切 YEp24 （圖3-11）第七十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月特征（1）保留了pBR322的和篩選大腸桿菌克隆子（2）含URA3標記篩選酵母菌克隆子 （3）URA3基因補償酵母菌ura3突變優(yōu)點（1）是一種穿梭質粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復制（2）轉化率高，1gDNA可獲得約104105個克隆子（3）穩(wěn)定高拷貝復制 故可用酵母菌高水平表達外源目的基因第七十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月含有酵母的篩選標記ura3和DNA的自主復制序列ARS在真核細胞中獨立自主的復制，拷貝數高但不穩(wěn)定。酵母復制質粒（YRp）UR

32、A3AMPrARS第七十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月在復制質粒中再插入酵母著絲粒(centromer)的一個DNA片段(CEN)，幫助染色體能等量地分配到子代細胞中。所以，含有CEN序列的質粒也將以同樣的機制穩(wěn)定地維持在細胞中，并保證了穩(wěn)定質粒在子代細胞中的等量分布。酵母穩(wěn)定質粒 (YCp)URA3AMPrARSCENYCP1000bpAMPrARSURA3CEN第八十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月質 粒大 小大腸桿菌復制子酵母復制子大腸桿菌選擇表型酵母選擇表型轉化頻率gDNA-1YIP5整合型5541bpPMB1無AprTetrUra+1100YRP17復

33、制型7002bpPMB1ARS1AprTetrTrp+Leu+103105YEp13附加體型10.7kbPMB12mAprTetrLeu+103105YCp 9著絲粒型10.1kbPMB1ARS1AprTetrTrp+Ura+103104酵母菌穿梭質粒特性第八十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體載體第八十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的生活周期： 第八十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、噬菌體克隆載體（一） 噬菌體性質DNA + 外殼蛋白1、DNA (48.5kb) 噬菌體中：線

34、性宿主細胞：環(huán)狀(cos位點)第八十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月右側區(qū)內包含所有的調控因子、與DNA復制及裂解宿主菌有關的基因，這個區(qū)域約長12kb。左側區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響噬菌體裂解生長的能力。第八十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA 基因結構 B2區(qū)和重組基因區(qū)是噬菌體進入裂解周期的非必需區(qū)（15kb ，約占噬菌體DNA的1/3 ），可將該區(qū)缺失或用外源DNA片段取代，對噬菌體

35、的感染和生長都不會造成影響。60%區(qū)域為裂解生長所必需。cI基因：溶源過程控制基因第八十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體的缺陷： 基因組太大（49kb）；酶切點太多:有5個BamH位點，6個Bg位點5個 EcoR位點。 野生型只能接納一定長度的DNA。第八十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月構建噬菌體載體的基本原理 切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（2.5kb或更大）； 去掉太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口； 增加標記基因:噬菌體重組體分子不具抗生素抗性選擇標記，主要是依據X-gal-IPTG顯色反應來篩選重組子和噬菌斑的形態(tài)學特征。第九十張，

36、PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月按照這一基本原理構建的噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：插入型載體（insertion vectors），只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。替換型載體（rePlacement vectors），具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構建。第九十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第九十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.組裝1.連接3.侵染Why?第九十三張，PPT共一百五十八頁，

37、創(chuàng)作于2022年6月 由于噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%105%左右的DNA，要求載體DNA和外源DNA長度之和在3953kb之間。 插入式載體可攜帶的外源DNA片段較替換式為小。 第九十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月插入型載體 gt10 載體 替換了一段來自 434 噬菌體的片段 imm434 ，其中基因 c 內有一個 EcoR 位點。 第九十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月置換型載體 EMBL3 在填充片段兩端帶有對稱的多克隆位點 第九十六張，PPT

38、共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月柯斯質粒載體 cosmid vectors第九十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一類由人工構建的含有DNA的 cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內?？滤官|粒載體 cosmid vectors “cosmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點（cos）的質粒，又稱其為粘粒載體。第九十八張，PPT共一百五十

39、八頁，創(chuàng)作于2022年6月人工構建的含有DNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。粘粒載體 cosmid第九十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月能容納大片段（45kb）的小分子（4kb6kb）載體。組成：質粒復制原點，抗性基因，多克隆位點，已連接的cos位點。第一百張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月具有噬菌體的特性：cosmid vector的特點 克隆外源DNA后可以體外包裝成噬菌體顆粒。在寄主細胞內形成環(huán)化DNA（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌）。具有質粒載體的特性方便選擇高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于30kb）。第一百零一張，PPT共一百五

40、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 凡具有cos位點的任何DNA分子只要其長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質?？上袷删w一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。第一百零二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月柯斯克隆理論依據是:1）在線性噬菌體DNA分子的每一端，都具有一段彼此互補的單鏈突出序列（cos位點)。2）在噬菌體的正常生命周期中，會產生出由數百個DNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個DNA基因組之間都是通過cos位點連接起來的。3）噬菌體具有的一種位點特異的切割體系(site-

41、specific cutting system),又叫Ter體系，能識別兩個相距適宜的cos位點(38-45kb)，將多連體分子切割成單位長度的片段，并將它們包裝到噬菌體頭部中去。 第一百零三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2022/8/4104南京農業(yè)大學 生命科學學院第一百零四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百零五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月人工染色體載體第一百零六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月人工染色體載體人工染色體載體（artificial chromosome vecter) :又叫大分子DNA克隆載體，利用染色體的復

42、制元件來驅動外源DNA片段復制的載體。第一百零七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）自主復制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA復制起始點（ori）染色體復制和遺傳的三個基本組件：TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）端粒（telomeres，tel）第一百零八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月人工染色體載體酵母人工染色體載體（YAC）細菌人工染色體載體（BAC）黏粒載體（cosmid)P1人工染色體載體（PAC）第一百零九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月YAC的

43、組成結構 3.第一百一十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5.YAC載體的選擇標記及篩選標記選擇標記：營養(yǎng)缺陷型基因篩選標記： SUP4宿主酵母菌：trp- 和 ura- 插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色； 不失活的菌落是白色。（赭石突變抑制基因：UAA）ade2-1第一百一十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月轉化Ura-/Tra-YAC工作原理4.第一百一十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆的方法 第一百一十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因的分離基因克?。壕褪抢肈NA重組技術及其它相關技術，獲得目的（外源）基因

44、（DNA片段）并插入適當的載體DNA分子中，并能自我“復制”，獲得大量目的基因（DNA片段）的過程。第一百一十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的基因的制備:構建基因組文庫構建cDNA基因文庫利用聚合酶鏈式反應技術基因的化學合成第一百一十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因文庫基因文庫基因組文庫cDNA文庫 基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結構和組織形式等。 cDNA文庫：來源于細胞表達出的RNA，反映基因組表達的基因序列信息，用于研究特定細胞中基因的表達狀態(tài)和表

45、達基因的功能等。 第一百一十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百一十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組文庫構建 用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構成了這種生物的基因組文庫。第一百一十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月文庫能夠覆蓋整個基因組；插入的片段比較大；文庫比較穩(wěn)定，且容易保存和操作?；蚪M文庫必須符合的基本條件第一百一十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組文庫的大小：N=ln(1-P)/ln(1-f)N：文庫必需的克隆數P：文庫中目的DNA片段的出現概率 f：插入片段大小/全基因組大小

46、的比值第一百二十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 期望值為0.99，插入片斷為20kb的 E.coli (4.6106 bp) 和 human (3109 bp) 基因組的克隆數的計算N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 這個例子說明用質粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。第一百二十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百二十二張，PP

47、T共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月有一些序列不能被克隆Example: 1.序列缺乏酶切位點; 2.目的基因包容在一個其大小范圍超出載體承載能力的DNA片段上。Too long for the vector used第一百二十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月植物基因組文庫構建的基本步驟：大片段DNA克隆載體的準備；大分子質量的植物基因組DNA制備；大片段DNA分子的部分酶切；載體與外源片段的連接；載體的遺傳轉化。第一百二十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的選擇 根據基因組的大小選擇合適的載體構建DNA文庫。 載 體 Plasmid phage cosmi

48、d BAC YAC 插入片斷 (kb) 5 23 45 350 1000第一百二十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用質粒載體 構建基因組文庫該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。第一百二十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月利用噬菌體構建基因組文庫第一百二十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月利用考斯質粒構建基因組文庫第一百二十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月利用YAC構建基因組文庫第一百二十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA文庫 cDNA文庫(completement DNA Libra

49、ry)：某生物基因組轉錄的全部或部分mRNA經反轉錄產生的各種cDNA片段，分別與載體重組而存在于一種受體的群體，即cDNA基因(部分)文庫。第一百三十張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組文庫 包含該生物基因組DNA全部的序列； 是具有生物種屬特異性的。cDNA文庫 已經過剪接、去除了內含子的cDNA； 具有組織細胞特異性。第一百三十一張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA文庫的構建載體cDNA片段的制備 分離細胞總RNA； 以mRNA為模板，合成cDNA第一鏈； 雙鏈cDNA的合成。第一百三十二張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA純化的方法：

50、 以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效。原理： 利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫。第一百三十三張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA與oligo(dT)雜交而被吸附，其它RNA仍處于游離狀態(tài)洗脫rRNA和tRNA收集洗脫下來的mRNA用纖維素柱純化mRNA的流程示意圖第一百三十四張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百三十五張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月以已知序列為基礎的克隆方法獲取基

51、因序列的途徑：從文獻中查取 EMBL:設在歐洲分子生物學實驗室的基因庫 網址: http:/www.ebiac.uk/ebi-home. html Genbank:設在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫 網址: http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/web/search/index.html 第一百三十六張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百三十七張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第一百三十八張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月測 序部分氨基酸序列簡并引物 部分cDNA作為探針基因組文庫cDNA文庫目的片段RACE-PCR目的片段部分RNA第一百三十九張，PPT共一百五十八頁，創(chuàng)作于2022年6月RAC