白蛋白超負(fù)荷通過CHOP依賴途徑引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡研究課件

1、白蛋白超負(fù)荷通過CHOP依賴途徑引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡第1頁，共35頁。 腎間質(zhì)纖維化是慢性腎病進(jìn)展的共同途徑，腎小管上皮細(xì)胞凋亡是慢性腎病腎小管間質(zhì)纖維化的重要病理生理基礎(chǔ)，其發(fā)生機(jī)制一直是腎臟病領(lǐng)域關(guān)注的重要科學(xué)問題。 蛋白尿是慢性腎病進(jìn)展的獨(dú)立危險因素。蛋白超負(fù)荷可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡與腎間質(zhì)纖維化呈顯著正相關(guān)關(guān)系。但蛋白尿誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并未完全解析。研究背景第2頁，共35頁。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是一種進(jìn)化保守的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的需求超過其自身能力，出現(xiàn)錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)在

2、腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài),稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。 ERS對決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡有重要作用。第3頁，共35頁。ERS雙刃劍內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制重建正常ER功能細(xì)胞損傷、凋亡損傷效應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂ERSERS誘發(fā)因素研究背景ER伴侶蛋白第4頁，共35頁。 PERK/Ire1 /CHOP途徑 Ire1/TRAF2/Ask1/JNK途徑 Caspase 12 /BCL-2 途徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑研究背景CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞，ERS活化CHOP是細(xì)胞凋亡最重要的信號途徑。 Bando Y,et al.FASEB,2004研究證實，

3、CHOP活化是多種損傷因素作用下平滑肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞以及肝臟細(xì)胞凋亡最重要的信號途徑。 Chenf WP,et al.Cardiovasc Res,2008 Lawrence MC,et al.Prco Natl Acad Sci USA,2007 Ikeyama S,et al.L Biol Chem,2003第5頁，共35頁。蛋白尿未折疊蛋白反應(yīng)PERK/CHOP途徑ROS，胞漿Ca2+超載腎小管上皮細(xì)胞凋亡腎小管萎縮ERS？研究思路Q：第6頁，共35頁。技術(shù)路線體外實驗研究HKCHKCDMEM對照白蛋白DMEM內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK表達(dá)及磷酸化腎小管上皮細(xì)胞凋亡H

4、KCHKCCHOP SiRNAPERK SiRNA實效和量效關(guān)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)體內(nèi)實驗研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78，ORP150表達(dá)蛋白尿CKD患者（n 21）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞凋亡腎組織非蛋白尿患者（n 7）科學(xué)問題？機(jī)制解析！第7頁，共35頁。入選患者基本情況1.750.27 #0.740.31血甘油三酯（mmol/L)6.800.85 #4.150.7726.775.60 #45.964.783.061.64 #0.070.04蛋白尿（g/24h）84.2910.4771.579.03血清肌酐（mol/L）886806舒張壓（mmHg）12491167收

5、縮壓（mmHg）3810419年齡（歲）10/114/3性別（男/女）CKD組（n=21）對照組（n=7）# p0.01,與對照組比較.血漿白蛋白（g/L）血總膽固醇（mmol/L）第19頁實驗結(jié)果第8頁，共35頁。（對照組）對照組pAdEasy-CUB組空載體組pAdEasy-ACUB組模型組 ORP150GRP78 CKD患者腎小管細(xì)胞ORP150、GRP78表達(dá)上調(diào)且隨尿蛋白水平增加而增強(qiáng)（200），提示CKD患者腎小管細(xì)胞有ERS發(fā)生。對照組中度蛋白尿輕度蛋白尿重度蛋白尿?qū)φ战M輕度蛋白尿重度蛋白尿中度蛋白尿研究結(jié)果第9頁，共35頁。（對照組）對照組pAdEasy-CUB組空載體組pAd

6、Easy-ACUB組模型組 CHOP凋亡細(xì)胞 CKD患者腎小管上皮細(xì)胞CHOP表達(dá)上調(diào)且發(fā)生核轉(zhuǎn)位，細(xì)胞凋亡亦增加，且隨尿蛋白水平增加而增強(qiáng)（200）對照組對照組重度蛋白尿輕度蛋白尿中度蛋白尿中度蛋白尿輕度蛋白尿重度蛋白尿研究結(jié)果第10頁，共35頁。*#*#*#*#*#*#*#*#研究結(jié)果*：P0.01,與正常對照組比較；#：P0.01,與輕度蛋白尿組比較；：P0.01.與中度蛋白尿組比較第11頁，共35頁。ORP150表達(dá)與24h尿蛋白量相關(guān)性分析GRP78表達(dá)與24h尿蛋白量相關(guān)性分析CHOP表達(dá)與24h尿蛋白量相關(guān)性分析細(xì)胞凋亡與24h尿蛋白量相關(guān)性分析研究結(jié)果第12頁，共35頁。CHO

7、P表達(dá)與腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)與腎小管上皮細(xì)胞凋亡呈非常顯著性正相關(guān)研究結(jié)果第13頁，共35頁。技術(shù)路線體內(nèi)實驗研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78，ORP150表達(dá)蛋白尿CKD患者（n 21）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)腎小管上皮細(xì)胞凋亡腎組織非蛋白尿患者（n 7）科學(xué)問題？PERK SiRNA體外實驗研究HKCHKCDMEM對照白蛋白DMEM 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶PERK表達(dá)及磷酸化腎小管上皮細(xì)胞凋亡HKCHKCCHOP SiRNA實效和量效關(guān)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)機(jī)制解析！第14頁，共35頁。體外實驗 白蛋白超負(fù)荷對腎小管上皮細(xì)胞GRP7

8、8、CHOP、 PERK表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡影響12 CHOP基因沉默對PERK表達(dá)和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響2 PERK基因沉默對CHOP表達(dá)和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響3第15頁，共35頁。GRP78、PERK、p-PERK及CHOP表達(dá)隨白蛋白濃度的增加而上調(diào)，提示它們與白蛋白存在量效關(guān)系A(chǔ)ctinGRP78 HSA (mg/ml ) 0 5 10 20CHOPActinTubulinPREKTubulinp PREK研究結(jié)果 Part1第16頁，共35頁。ActinGRP78CHOPActinTubulinPREKTubulinp-PREK研究結(jié)果 Pa

9、rt1 HSA (h) 0 6 12 24 36GRP78、PERK、p-PERK表達(dá)隨白蛋白作用時間的延長在6h即上調(diào)，而CHOP表達(dá)則在12h才增加，提示它們與白蛋白存在時效關(guān)系，但是GRP78、PERK、P-PERK的表達(dá)上調(diào)要先于CHOP。第17頁，共35頁。HKC凋亡與白蛋白刺激具有量效關(guān)系2.15%0mg/ml5mg/ml7.70%10mg/ml15.52%20mg/ml25.82%研究結(jié)果 Part1第18頁，共35頁。隨著白蛋白作用時間的延長，HKC凋亡在12h明顯增加，提示HKC凋亡與白蛋白刺激具有時效關(guān)系0h1.58%6h1.79%12h16.04%39.15%36h24h

10、26.15%研究結(jié)果 Part1第19頁，共35頁。體外實驗 白蛋白超負(fù)荷對腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP、 PERK表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡影響12 CHOP基因沉默對PERK表達(dá)和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響2 PERK基因沉默對CHOP表達(dá)和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響3第20頁，共35頁。CHOP基因沉默抑制HKC CHOP mRNA表達(dá)圖 A: 擴(kuò)增曲線 B：熔解曲線 AB*#研究結(jié)果 Part2*：P0.01， #：P0.05，與對照組比較；： P0.01，與HSA刺激組比較第21頁，共35頁。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA

11、+CHOPsiRNAHSAActinCHOP *#*CHOP基因沉默抑制CHOP蛋白表達(dá) *：P0.01， 與對照組比較； #：P0.01，與HSA刺激組比較 研究結(jié)果 Part2第22頁，共35頁。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA+CHOPsiRNAHSAPERKTubulin *CHOP基因沉默對PERK表達(dá)無影響研究結(jié)果 Part2*：P0.01， 與對照組比較第23頁，共35頁。ControlcontrolsiRNACHOPsiRNAHSA+CHOPsiRNAHSAP-PERKTubulin *#CHOP基因沉默上調(diào)PERK磷酸化研究結(jié)果 Part2 *：

12、P0.01， 與對照組比較； #：P0.01，與HSA刺激組比較 第24頁，共35頁。對照組2.24%control siRNA2.39%CHOP siRNA2.45%CHOP siRNA+HSA15.76%HSA26.40%*#*：P0.01， 與對照組比較; #：P0.01 ，與HSA刺激組比較CHOP基因沉默抑制白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)的HKC凋亡研究結(jié)果 Part2第25頁，共35頁。體外實驗 白蛋白超負(fù)荷對腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP、 PERK表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡影響12 CHOP基因沉默對PERK表達(dá)和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響2 PERK基因沉默對CHOP表達(dá)

13、和白蛋白誘導(dǎo)腎小管 上皮細(xì)胞凋亡的影響3第26頁，共35頁。PERK基因沉默抑制HKC PERK mRNA表達(dá)圖 A: 擴(kuò)增曲線 B：熔解曲線BA*#*：P0.01， #：P0.05，與對照組比較；： P0.01，與HSA刺激組比較 研究結(jié)果 Part3第27頁，共35頁。PERK基因沉默抑制HKC CHOP mRNA表達(dá)圖1 A: 擴(kuò)增曲線 B：熔解曲線 AB圖 A: 擴(kuò)增曲線 B：熔解曲線#*研究結(jié)果 Part3*：P0.01， #：P0.05，與對照組比較；： P0.01，與HSA刺激組比較 第28頁，共35頁。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsi

14、RNAHSAActinCHOP #*PERK基因沉默抑制CHOP表達(dá)研究結(jié)果 Part3 *:P0.01,#:P0.05,與對照組比較；：P0.01，與HSA刺激組比較 第29頁，共35頁。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsiRNAHSAPERKTubulin *#*PERK基因沉默抑制PERK表達(dá)研究結(jié)果 Part3*:P0.01,#:P0.05,與對照組比較；：P0.01，與HSA刺激組比較 第30頁，共35頁。ControlcontrolsiRNAPERKsiRNAHSA+PERKsiRNAHSAP-PERKTubulin *#PERK基因沉默抑制

15、PERK磷酸化*：P0.01， 與對照組比較； #：P0.01，與HSA刺激組比較 研究結(jié)果 Part3第31頁，共35頁。第70頁對照組2.29%control siRNA2.55%PERK siRNA2.41%PERK siRNA+HSA17.16%HSA25.16%*#*：P0.01， 與對照組比較; #：P0.01 ，與HSA刺激組比較PERK基因沉默抑制白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)的HKC凋亡研究結(jié)果 Part3第32頁，共35頁。蛋白尿ERS(未折疊蛋白反應(yīng))p-PERKROS，胞漿Ca2+超載腎小管細(xì)胞凋亡腎小管萎縮結(jié) 論CHOP第33頁，共35頁。 蛋白尿可引發(fā)慢性腎病患者腎小管上皮細(xì)胞ERS，雖然ERS標(biāo)志物GRP78和ORP150表達(dá)上調(diào)，但CHOP表達(dá)也顯著增多，腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加，提示蛋白尿