地中海貧血的分子基礎和產前診斷課件

1、地中海貧血的分子基礎和產前診斷徐湘民南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University北海， 2013年 8月23-25日第1頁，共79頁。遺傳性血紅蛋白病Inherited disorders of hemoglobin 異常血紅蛋白 Abnormal hemoglobin, Structural variants 地中海貧血 (地貧) Thalassemias -thalassemia -thalassemia 遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白 Hereditary persistence of feta

2、l hemoglobin(HPFH)第2頁，共79頁。血紅蛋白病是世界上最常見的出生缺陷之一 全球每年約有790萬出生缺陷患兒出生 5中常見的疾病占7000種出生缺陷的25% 血紅蛋白病的發(fā)病率位于第三位204060801001200全球5種常見的出生缺陷第3頁，共79頁。地中海貧血全球分布區(qū)域中國南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率3%-24%Blood Rev, 2012.第4頁，共79頁。全球血紅蛋白病人群負荷Blood, 2011; WHO Statistics, 2012.第5頁，共79頁。中國異常血紅蛋白調查Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.第6頁，共79

3、頁。中國地中海貧血調查Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.第7頁，共79頁。Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.中國地中海貧血調查第8頁，共79頁。廣東省地中海貧血的流行病學調查珠海 3140韶關 3444廣州 2604汕頭 1049湛江 316013,397人份J Clin Pathol, 2004. 西北東南第9頁，共79頁。8.53%2.54%地貧地貧正常人群88.93%11種突變12種突變地貧攜帶者約1000萬廣東地中海貧血流行病學調查J Clin Pathol, 2004. 第10頁，共79頁。防城港市 22

4、4百色市 834柳州市 790賀州市 1033玉林市 1349南寧市 1559廣西地區(qū)地中海貧血的流行病學調查5,789人份Clin Genet, 2010.北東南西 漢族：3361 壯族：1670 瑤族： 619 其它： 139第11頁，共79頁。正常人群75.86%17.55%-地貧6.43%地貧地貧0.16%正常人群75.86地貧17.55%9種突變13種突變廣西地中海貧血流行病學調查地貧攜帶者約1000萬Clin Genet, 2010.第12頁，共79頁。高發(fā)區(qū)人群遺傳負荷評估第13頁，共79頁。中國南方血紅蛋白病人群負荷第14頁，共79頁。和地中海貧的分子基礎 常染色體隱性遺傳病

5、致病基因：地貧 - 珠蛋白基因（16p13.3） 地貧 - 珠蛋白基因（11p15.3） 突變純合子：重型地貧 - 致死 中間型地貧 - 致殘 病理學基礎： / 鏈比例失衡第15頁，共79頁。和地貧的病理學機制和臨床分類-珠蛋白基因表達 -地中海貧血臨床綜合征 正常 正常 -地中海貧血特征 -地中海貧血特征Hb H 病 中間型-地中海貧血 Barts胎兒水腫綜合征 重型-地中海貧血 -地中海貧血臨床綜合征 -珠蛋白基因表達珠蛋白鏈不平衡16p13.311p15.3第16頁，共79頁。地中海貧血的臨床特征小細胞低色素性溶血型貧血 (中、重度)黃疸肝脾腫大 (脾大明顯)骨髓擴增發(fā)育遲緩合并感染Ba

6、rts 水腫胎(地貧,宮內或出生后半小時內死亡)第17頁，共79頁。地貧血象：紅細胞著色不足、異形紅細胞和骨髓成紅血細胞增多癥第18頁，共79頁。地中海貧血的血液學表型特征 RBC 參數 MCV MCH 細胞形態(tài)變化 Hb 成分分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts Hb H () Hb E () 第19頁，共79頁。1 2 3 4 5Normal AA2 AE Barts AF HA+-500V, 25min血紅蛋白電泳圖譜1. 正常人Hb2. 輕型地貧 3. 異常Hb E雜合子4. 新生兒Hb Barts (4, 地貧標準型）5. Hb H第20頁，共79頁。中間型地貧的臨床特

7、征 輕度黃疸 肝脾腫大(脾大明顯) 骨髓擴增 合并感染不需進行常規(guī)輸血治療血紅蛋白水平維持在60-100g/L水平 發(fā)病年齡在2歲以后, 或成年期發(fā)病第21頁，共79頁。中間型地貧的臨床特征 輕度黃疸 肝脾腫大 (脾大明顯) 骨髓擴增 合并感染不需進行常規(guī)輸血治療血紅蛋白水平維持在60-100g/L水平發(fā)病年齡在2歲以后, 或成年期發(fā)病第22頁，共79頁。重型地貧重型地貧中間型地貧地貧是嚴重致死、致殘性遺傳性血液病第23頁，共79頁。 地中海貧血的防治對策 重癥地貧患兒的出生是世界公認的公共衛(wèi)生問題 通過產前診斷阻止重癥患兒出生是首選預防措施 WHO優(yōu)先推薦在發(fā)展中國家實施預防的遺傳性疾病 預

8、防地貧是中國南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求 第24頁，共79頁。地中海貧血的預防控制TIF Publication, 2003.第25頁，共79頁。地中海貧血的研究策略建立一系列診斷標準和診斷技術遺傳流行病學調查大人群監(jiān)控和預防用于基因分型用于產前診斷指導制定計劃第26頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧: 復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第27頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧:復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第28頁，共79頁。13種導致中國人-地中海貧血的缺失突變地中海貧血預防控制操作指南. 人民軍醫(yī)出版社, 2011.

9、 第29頁，共79頁。 2 1 2 1 3HVRinterHVR534個功能性的基因3個功能性的基因2個功能性的基因0個功能性的基因1個功能性的基因正常靜止型地貧輕型地貧HbH病Hb Barts胎兒水腫綜合征地中海貧血表型和基因型的關系第30頁，共79頁。12種見于中國人群的導致2/1珠蛋白基因表達降低的突變 CD59 錯義突變小缺失或插入終止密碼突變移碼突變 IVS IIVS II UTRUTR53CD13CD31CD125 CD122 CD142 CD4445CD49CD30CD78 CD74 CD118 21EXON IIEXON I EXON III地中海貧血預防控制操作指南. 人民軍

10、醫(yī)出版社, 2011. 第31頁，共79頁。中國南方人群不同基因型Hb H病的分布Unpublished Data, 2012.第32頁，共79頁。 / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ 中國人主要-珠蛋白基因型與血液學表型的關系Unpublished Data, 2012.第33頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧:復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第34頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧:復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第35

11、頁，共79頁。 50 種見于中國南方的導致 珠蛋白基因表達降低的突變 地中海貧血預防控制操作指南. 人民軍醫(yī)出版社, 2011. 第36頁，共79頁。導致中國人群中間型的+地貧突變 第37頁，共79頁。6種引起地中海貧血的基因缺失地中海貧血預防控制操作指南. 人民軍醫(yī)出版社, 2011. 第38頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧:復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第39頁，共79頁。和地貧發(fā)生的分子遺傳學機制 -珠蛋白基因缺失 中間型地貧:復雜變異 -珠蛋白基因點突變 第40頁，共79頁。產前基因診斷：地貧預防的技術基礎 人群攜帶者篩查發(fā)現高風險家庭 基于DNA

12、分析的胎兒基因型診斷 胎兒取樣 家系分析第41頁，共79頁。產前基因診斷：地貧預防的技術基礎 人群攜帶者篩查發(fā)現高風險家庭 基于DNA分析的胎兒基因型診斷 胎兒取樣 家系分析第42頁，共79頁。 用于攜帶者檢測的表型分析方法 全血細胞計數 MCV (80fL) MCH ( 5% 第52頁，共79頁。中國南方發(fā)現的5種占人群90%的常見地中海貧血基因突變第53頁，共79頁。地中海貧血的DNA診斷 -地貧:基因缺失分析技術 -地貧:基因點突變分析技術 Reverse Dot Blot （RDB）: 反向點雜交 probe melting curve-based genotyping assay （

13、PMCA）: 基于探針熔解曲線的基因分型 Gap-PCR : 缺口PCR Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification （MLPA）: 多重連接探針擴增 檢測基因拷貝數的熒光定量PCR第54頁，共79頁。第55頁，共79頁。目前已獲準或正在申報產品注冊證的檢測中國人地貧突變的分子診斷技術 3種缺失型地貧檢測試劑盒：單管多重gap-PCR法 17種地貧突變檢測試劑盒：反向點雜交法 多位點缺失型地貧檢測試劑盒： PCR熒光探針法 25 種地貧突變檢測試劑盒：熒光PCR熔解曲線法第56頁，共79頁。- HW-THAI- FIL - SEA-11Kb

14、 4.2 3.7211 3HVRHVR1210kb0kb20kb 30kb 40kb 50kb53檢測基因拷貝數的熒光定量 PCR第57頁，共79頁?？截悢迪鄬Χ吭\斷模型 1 基因2個拷貝 看家基因2個拷貝 1 基因1個拷貝 看家基因2個拷貝 1 基因0個拷貝 看家基因2個拷貝Ct值Ct33334No 01482844848無擴增 3個循環(huán) 3個循環(huán) 3個循環(huán) 4個循環(huán)16161616048 3個循環(huán)16PCR擴增第58頁，共79頁。三個靶基因拷貝數定量分析結果J Mol Diagn. 2013. 第59頁，共79頁。864例樣品定量診斷特異性評價第60頁，共79頁。-SEA/, -3.7/

15、-4.2/等基因分型-SEA, -3.7, -4.2 等單倍型分析珠蛋白基因拷貝數-地貧分子診斷: 臨床表型與基因分型基因缺失基因缺失基因缺失Gap-PCR定性檢測基因缺失待檢人基因組DNA-地貧定量與定性檢測的比較基因缺失基因缺失基因重復第61頁，共79頁。PMCA檢測原理及流程圖J Mol Diagn, 2011. 第62頁，共79頁。25種地貧突變熔解曲線圖譜第63頁，共79頁。與傳統(tǒng)RDB檢測方法的比較SamplesVariant IdentifiedPCR/melting analysisHybridizationMembrane WashingPCRRDBMeltProSignal

16、 DevelopmentPCRDirect SequencingPCR Clean-UpSequencing PCRCapillary Electrophoresis(260 min)Variant IdentifiedVariant Identified(370 min)(160 min)30 min3 reactions100 min15 min100 min120 min45 min120 min2 reactions160 min1 reaction100 min第64頁，共79頁。 和地中海貧血的預防計劃 目前基于人群篩查的預防模式 擴展家系篩查計劃 基于醫(yī)院水平的預防計劃 基于社區(qū)

17、或行政區(qū)的預防計劃第65頁，共79頁。人群干預可以降低出生缺陷發(fā)生率 世界衛(wèi)生組織的出生缺陷“三級預防”策略 一級：婚前檢查 二級：產前篩查和產前診斷 三級：患兒治療 孕前和孕期干預是我國出生缺陷預防的重點 探索基于社區(qū)的出生缺陷預防模式 第66頁，共79頁。 斗門區(qū) 金灣區(qū) 香洲區(qū) 統(tǒng)一調度 質量控制 轉診病例確診 高風險對象建檔 產前診斷一級技術中心 宣傳教育 攜帶者篩查 病例轉診 遺傳咨詢 隨訪二級檢測站斗門市婦幼保健院唐家鎮(zhèn)醫(yī)院香州區(qū)婦幼保健院珠海市婦幼保健院橫琴醫(yī)院金灣區(qū)婦幼保健院珠海市地中海貧血預防現場的二級網絡模式第67頁，共79頁。珠海市1998-2005人群篩查及產前診斷結果

18、 第68頁，共79頁。1998-2005珠海市地貧婚前/產前篩查及產前診斷結果產前診斷：98 例地貧 44 例地貧 14 例重型地貧 27 例Barts水腫兒和Hb H病 篩查發(fā)現的陽性孕婦或陽性夫婦 地貧 地貧 地貧 地貧 4.5% 2.3% 1.6% 0.7%篩查陽性對象數: 6563對 4312 2251 103對 45對中華醫(yī)學遺傳學雜志, 2008. 第69頁，共79頁。2010年，衛(wèi)生部與廣西政府合作開展由政府買單為民服務的“地中海貧血防治” 省部共建惠民工程該工程計劃在5年內將廣西地貧患兒出生率下降50%衛(wèi)生部與廣西共建衛(wèi)生惠民工程：廣西地中海貧血防治計劃 第70頁，共79頁。政

19、府組織第71頁，共79頁。公益宣傳第72頁，共79頁。技術培訓 南方醫(yī)科大學：地貧實 驗室技術骨干培訓基地 衛(wèi)生部舉辦9省市地貧防 控適宜技術師資培訓班第73頁，共79頁。廣西地中海貧血防治計劃培訓教材第74頁，共79頁。廣西地區(qū)地貧人群預防三級網絡第75頁，共79頁。地貧預防項目的社會效益可為國家和家庭節(jié)約巨額的社會消耗第76頁，共79頁。研究基金： 國家自然科學基金 國家科技計劃項目 衛(wèi)生部行業(yè)科研專項基金 廣東省科技計劃項目 軍隊醫(yī)學重點課題基金致 謝合作單位：廣東省人口和計劃生育委員會廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院廣州市婦女兒童醫(yī)療中心珠海市婦幼保健院柳州市婦幼保健院中國

20、人民解放軍第三0三醫(yī)院深圳益生堂生物企業(yè)有限公司“973”計劃 “863”計劃國家科技支撐計劃第77頁，共79頁。樹立質量法制觀念、提高全員質量意識。8月-228月-22Friday, August 5, 2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。02:36:0002:36:0002:368/5/2022 2:36:00 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。8月-2202:36:0002:36Aug-2205-Aug-22加強交通建設管理，確保工程建設質量。02:36:0002:36:0002:36Friday, August 5, 2022安全在于心細，事故出在麻痹。8月-22

21、8月-2202:36:0002:36:00August 5, 2022踏實肯干，努力奮斗。2022年8月5日2:36 上午8月-228月-22追求至善憑技術開拓市場，憑管理增創(chuàng)效益，憑服務樹立形象。05 八月 20222:36:00 上午02:36:008月-22嚴格把控質量關，讓生產更加有保障。八月 222:36 上午8月-2202:36August 5, 2022作業(yè)標準記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/8/5 2:36:0002:36:0005 August 2022好的事情馬上就會到來，一切都是最好的安排。2:36:00 上午2:36 上午02:36:008月-22專注今天，好好努力，剩下的交給時間。8月-228月-2202:3602:36:0002:36:00Aug-22牢記安全之責，善謀安全之策，力務安全之實。2022/8/5 2:36:00Friday, August 5, 2022相信相信得力量。8月-222022/8/5 2:36:008月