植物細胞工程教學(xué)課件第一章實驗室基本技術(shù)

1、第一章 實驗室基本技術(shù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細胞工程電子課件實驗室設(shè)置基本技術(shù)培養(yǎng)基及其配制細胞培養(yǎng)環(huán)境控制外植體接種培養(yǎng) 主要內(nèi)容1.1 實 驗 室 設(shè) 置實驗室組成基本設(shè)備配置培養(yǎng)容器與用具細胞工程實驗室的基本要求實驗準備 包括培養(yǎng)基配制， 洗滌與滅菌等無菌操作控制培養(yǎng)Culture roomPreparation roomSterili- zing roomSterile operationCytology roomTransi- tion area實驗室布局示意圖基 本 實 驗 室準備室 準備室的功能就是進行一切與實驗有關(guān)的準備工作。要求寬敞明亮，通風(fēng)條件好。 培養(yǎng)室 培養(yǎng)室的功

2、能是對離體材料進行控制培養(yǎng)。其首要要求是要能控制光照和溫度，其次為防止微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔。 接種室 接種室的功能是進行無菌操作。要求封閉性好，干燥清潔，能較長時間保持無菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)防止空氣對流。輔 助 實 驗 室細胞學(xué)實驗室 其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。 生化分析室 在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室中，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗實驗室，以便于對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。 攝影室及暗室 其功能是進行培養(yǎng)材料的攝影記錄和膠片沖印。在有條件的情況下可建立此實驗室。 基本設(shè)備配置基本設(shè)備滅菌設(shè)備光照培

3、養(yǎng)室與設(shè)備無菌操作設(shè)備細胞學(xué)鑒定設(shè)備培養(yǎng)容器與用具1.2 基本技術(shù)洗滌技術(shù)滅菌技術(shù)洗 滌 劑合成洗滌劑鉻酸洗滌液 常用的鉻酸洗滌液配方 成 分 強酸溶液 中酸溶液 弱酸溶液 重鉻酸鉀 (g) 63 120 100 硫 酸(ml) 1000 200 100 蒸 餾 水(ml) 200 200 1000 注意事項 在蒸餾水中緩慢加入濃硫酸，加熱的同時分次加入磨碎的重鉻酸鉀至其完全融解。 重鉻酸鉀加蒸餾水后加熱溶化，冷卻后再緩慢加入濃硫酸。 玻璃器皿洗滌 新的玻璃器皿、已使用過的試管、燒杯、三角瓶 、吸管、滴管等內(nèi)徑狹小的玻璃制品。 塑料用品洗滌 一般用合成洗滌劑洗滌，因其附著力較強，因此沖洗時必須

4、反復(fù)多次，最后用蒸餾水沖洗。 金屬用品洗滌 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌， 需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 培養(yǎng)基濕熱滅菌，即高壓高溫蒸汽滅菌。 玻璃器皿濕熱滅菌或干熱滅菌，即在烘箱中加熱至15040min，或1202h。 金屬器皿干熱滅菌。 接種室接種室常采用定期熏蒸，熏蒸劑常用甲 醛加高錳酸鉀，一般每100ml甲醛加5g高錳酸鉀。 培養(yǎng)基體積與滅菌時間的關(guān)系培養(yǎng)基體積 （ml）滅菌溫度 （） 滅菌時間（min.） 2050 121 20 50500 121 25 5005000 125 35 1.3 培養(yǎng)基及其配制 植物細胞培養(yǎng)基及其配制動物細胞培養(yǎng)基及其配制 植物細胞培養(yǎng)

5、基及配制 培養(yǎng)基基本成分 培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配制無 機 鹽 類大量元素 培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P, K、Ca、Mg、 S。 微量元素 微量元素的用量一般低于10-510-7克分子濃度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、 Mo、Mn、Co。 有 機 成 分糖 維生素 肌醇 氨基酸 其它 植 物 激 素生長素 細胞分裂素其它其它附加成分瓊脂 活性炭 附加復(fù)合成分 常用培養(yǎng)基配方常用培養(yǎng)基配方： MS（Murashing and Skoog, 1962） White（White, 1934） B5 (Gambor et al, 1968)

6、N6 (朱至青，1974) 培 養(yǎng) 基 配 制 大量元素配制成10-20 的母液 微量元素配制成100-200 的母液 激素單獨配制成mg/ml的母液 培養(yǎng)用培養(yǎng)基按需要按比例加入動物細胞培養(yǎng)基及配制動物細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求特點培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基配制動物細胞培養(yǎng)液的成分及性質(zhì)氨基酸類（1）必需氨基酸Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Cys、Ser等（2）非必需氨基酸維生素類鹽類葡萄糖緩沖系統(tǒng)大多數(shù)平衡液采用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。HEPEs現(xiàn)被廣泛使用，常用濃度為25mmol/L。礦物類有機補充物如核苷類、TCA中間產(chǎn)物、丙酮酸鹽、類脂化合物等。激素類如insulin、生長激素、

7、氫化可的松等。生長因子類如血小板衍生出來的生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）、內(nèi)皮生長因子及增殖刺激活性因子（MsA）等。培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)基選擇平衡液溶液（BSS）天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液無血清培養(yǎng)基其他常用液RingerPBSTyrodeEarleHanksDulbeccoD-hanksNaCl9.008.008.006.808.008.008.00KCl0.420.200.200.400.400.200.40CaCl20.250.200.200.140.10MgCl2.6H2O0.100.10MgSO4.7H2O0.200.20Na2HPO4.H2O1.

8、560.060.06NaH2PO4.2H2O0.050.141.42KH2PO40.200.060.200.06NaHCO31.002.200.350.35葡萄糖1.001.001.00酚紅0.020.020.02表1幾種常用的BSS（g/L）天然培養(yǎng)液血漿血清胚胎浸出液鼠尾膠原合成培養(yǎng)液人工方法模擬合成如TC199、MEM、RPM-1640、DMEM、Hams F12等。主要成分是氨基酸、vitamin、碳水化合物、無機鹽和其他一些輔助物質(zhì)等。無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和附加成分?；A(chǔ)培養(yǎng)基：一般用人工合成的培養(yǎng)液，常用Ham F12和DMEM，1：1混合，加含15mmol/L HEPEs的

9、1.2g/L NaHCO3作基礎(chǔ)培養(yǎng)液。附加成分：培養(yǎng)基質(zhì)（纖維連結(jié)素、多聚物、膠原等。）營養(yǎng)成分（轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒酸鈉、胰島素、生長因子等）酶抑制劑（ 0.1%0.5%大豆胰酶抑制劑）其他常用液消化液1.胰蛋白酶液適用于消化細胞間質(zhì)較少的組織，常用濃度0.25%、0.125%，T：370C或室溫，pH7.4左右。2.Na2EDTA溶液 3.膠原蛋白酶液pH調(diào)整液1.NaHCO3液2.10%HAc液3.HEPEs液一種H緩沖劑，可長時間保持較強的緩沖作用，維持恒定的pH值。200mmol/LGln抗菌液青霉素、鏈霉素（雙抗）液 卡那霉素液、制霉菌素液肝素抗凝劑培養(yǎng)基配制BSS配制方法以Hanks液

10、為例：按配方表準確稱量試劑；將CaCl2先溶解在100ml 水中；其它成分依次溶解在750ml水中；用數(shù)滴5.6%NaHCO3溶解酚紅；將2緩慢倒入3中，攪動；將4加入5中；將6移入容量瓶中，補足水混勻；分裝鹽水瓶中，高壓滅菌，40C冰箱保存。1.血漿：選用生長1年左右的健康雄雞，從雞翼血管處抽取血液，在有肝素時離心（3000rpm,10min）。取上清分裝入若干小瓶，低溫冰箱保存。2.血清：從出生1周內(nèi)的小牛動脈采血，每頭小牛放血15002000ml。取血瓶內(nèi)預(yù)先放置30ml生理鹽水，以便于血凝塊和瓶壁的分離。采血后，血瓶傾斜放置2-4h（室溫），待血液充分凝結(jié)后移入40C冰箱過夜，讓血清析

11、出。次日吸取上清，以4000rpm離心30min，收集血清。血清用蔡氏濾器過濾除菌，分裝，細菌培養(yǎng)檢查無菌后于低溫冰箱保存。天然培養(yǎng)基配制方法3.胚胎浸出液：將911d胚齡的雞胚磨碎和，加等量緩沖液，離心收集上清，即為雞胚浸出液，于200C700C保存。1.4 細胞培養(yǎng)環(huán)境控制 植物細胞培養(yǎng)環(huán)境控制動物細胞培養(yǎng)環(huán)境控制1.4.1 植物細胞培養(yǎng)環(huán)境控制光照 溫度pH氣體溫度光照包括：光周期、光量和光質(zhì)三方面。 光量指的是光照強度，因植物類型不同而異。離體培養(yǎng)條件下常用的光量一般為10004000lx。 光質(zhì)即是光的波長的影響。離體培養(yǎng)下一般用白熾熒光燈進行光照，光譜成分主要是藍光，光譜波長為41

12、9nm。在離體培養(yǎng)中，根、芽分化的依賴光譜成分不同。光周期指的是光照和黑暗交替的時間，影響細胞脫分化和再分化的效應(yīng)。 溫度控制主要依據(jù)植物物種的起源和生態(tài)類型來決定。依植物生活習(xí)性可將其分為喜溫性植物和冷涼性植物兩大類型。喜溫性植物培養(yǎng)溫度一般控制在26-280C，冷涼性植物培養(yǎng)溫度一般控制在18-220C或低于250C為宜。 在大多數(shù)情況下，適溫有利于細胞分裂，即可以提高細胞分裂速率，而適當(dāng)提高溫度則有利于細胞生長，在一定范圍內(nèi)降低培養(yǎng)溫度則使細胞分裂和生長速度均減緩，而且使細胞的質(zhì)量增加。 濕度條件：培養(yǎng)過程對濕度要求并不十分嚴格，因為培養(yǎng)的小環(huán)境中相對濕度常達110%。 周圍環(huán)境的相對濕

13、度低于60%時，培養(yǎng)基容易干涸，會改變培養(yǎng)基的滲透壓；相反，若周圍環(huán)境濕度過高時，培養(yǎng)室易滋生各種細菌和霉菌。周圍環(huán)境較適宜的相對濕度為7080%。 植物培養(yǎng)通常使用的pH值范圍是5.56.5。 pH在4.0以下或7.0以上培養(yǎng)物就不能正常生長。 由于外植體的吸收，引起培養(yǎng)過程中的pH變化；高壓滅菌引起pH 變化。 總體上講，動物細胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強。如哺乳低溫細胞在45下只能存活1小時，但在25條件下仍然能慢速生長，并維持長時間不死，甚至在4下數(shù)小時后，再置于適宜溫度下細胞仍然可以正常生長。 1.4.2 動物細胞培養(yǎng)環(huán)境控制2. pH動物細胞培養(yǎng)適宜的pH一般在7.2-7.4

14、，低于6.8或高于7.6都不利于細胞生長，嚴重時會導(dǎo)致細胞死亡。 培養(yǎng)細胞對pH的要求因培養(yǎng)時間長短有關(guān)，一般原代細胞要求較嚴格，而永久細胞系對pH具有較強的忍耐性。 3. 溶氧及氣體環(huán)境一般細胞在培養(yǎng)初期要求較低的溶氧水平，而在對數(shù)生長期或培養(yǎng)后期，對溶氧水平要求增加，如果供氧不足，將導(dǎo)致細胞缺氧而死亡。 除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)注意培養(yǎng)基的氧氣和CO2的平衡。 4. 滲透壓動物細胞培養(yǎng)滲透壓包括兩個方面的問題： 一是培養(yǎng)基的滲透壓維持； 二細胞體內(nèi)的滲透壓維持。 大多數(shù)動物細胞對滲透壓的忍耐程度較強，只要培養(yǎng)基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對培養(yǎng)物不會造成致命傷害。 動物細胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。1.5 外植體接種培養(yǎng)植物離體培養(yǎng)類型： 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng) 細胞培養(yǎng) 原生質(zhì)體培養(yǎng)植物材料的培養(yǎng)與外植體選取 外植體滅菌接種培養(yǎng)及培養(yǎng)條件的控制植物離體培養(yǎng)基本程序外植體的來源 外植體（explant）是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。 用于外植體分離的母體植物材料一般有三種來源： 一是生長在自然環(huán)境下的植物； 二是有目的地培育在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物； 三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物。 外植體取材 a. 根據(jù)培養(yǎng)需求選擇植物部位 b. 多年生植物注意樹齡和季節(jié) c. 在不影響培養(yǎng)目的的前提下盡可能選擇自然繁殖器官作外植體外植體滅菌外植體清洗整理殺菌劑