生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十二章基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù)

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十二章 基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù) The Analysis Technology for Gene Structure and Function人類的多種疾病都與基因的結(jié)構(gòu)或功能異常有關(guān)，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機(jī)制和進(jìn)行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結(jié)構(gòu)與功能。一、基因結(jié)構(gòu)分析：DNA序列測(cè)定、基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)及其啟動(dòng)子的分析、基因編碼序列的分析、基因拷貝數(shù)分析二、基因表達(dá)產(chǎn)物分析：轉(zhuǎn)錄水平（RNA)、翻譯水平（蛋白質(zhì)）三、基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)基因功能獲得和/或缺失策略隨機(jī)突變篩選策略第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù) 一、基因一級(jí)結(jié)構(gòu)解析技術(shù) 基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指脫氧核苷

2、酸的排列順序，解析一級(jí)結(jié)構(gòu)最精確的技術(shù)就是DNA測(cè)序（DNA sequencing）。 （一）雙脫氧法和化學(xué)降解法是兩種常規(guī)的DNA測(cè)序方法 Sanger雙脫氧測(cè)序（dideoxy sequencing）法 利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。 1977年，A.M.Maxam和W.

3、Gilbert首先建立了DNA片段序列的測(cè)定方法，其原理為：將一個(gè)DNA片段的5端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而5端被標(biāo)記的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA的堿基序列。 （二）全自動(dòng)激光熒光DNA測(cè)序技術(shù)的原理基于Sanger雙脫氧法 1. 四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標(biāo)記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結(jié)果均相當(dāng)于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個(gè)樣品的4個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物可在同一個(gè)泳道內(nèi)電泳。2. 單色熒光法：采用單一熒光染料標(biāo)記引物5-

4、端或dNTP，所有產(chǎn)物的5-末端均帶上了同一種熒光標(biāo)記，一個(gè)樣品的四個(gè)反應(yīng)必須分別進(jìn)行，相應(yīng)產(chǎn)物也必須在四個(gè)不同的泳道內(nèi)電泳（三）焦磷酸測(cè)序是一種基于發(fā)光法測(cè)定焦磷酸的測(cè)序技術(shù) 焦磷酸測(cè)序技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）分析、等位基因頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關(guān)基因序列中的突變點(diǎn)等領(lǐng)域。該方法的測(cè)序長(zhǎng)度一般短于Sanger法。 是一種新型的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)后可以滿足上百個(gè)核苷酸序列的測(cè)序工作，焦磷酸測(cè)序技術(shù)的原理是：引物與模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(

5、ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA序列的目的。 反應(yīng)過(guò)程在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結(jié)合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。通

6、過(guò)微弱光檢測(cè)裝置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測(cè)峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，則上述反應(yīng)不會(huì)發(fā)生，也就沒有檢測(cè)峰。反應(yīng)體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發(fā)生降解。待上一輪反應(yīng)完成后，加入另一種dNTP，使上述反應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的DNA序列信息。 該技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何特殊形式的標(biāo)記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點(diǎn)。與Sanger測(cè)序法相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)有其特定的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。優(yōu)點(diǎn)：1.不需要制膠，不需要毛細(xì)管，也不需

7、要熒光染料和同位素。分鐘內(nèi)可分析96個(gè)樣品的SNP,可滿足高通量分析的要求。3.每個(gè)樣品孔都可進(jìn)行獨(dú)立的測(cè)序或SNP分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活。4.序列分析簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。（四）循環(huán)芯片測(cè)序被稱為第二代測(cè)序技術(shù) 循環(huán)芯片測(cè)序（cyclic-array sequencing） 可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模并行化分析 不需電泳，設(shè)備易于微型化 樣本和試劑的消耗量降低，降低了測(cè)序成本 優(yōu)勢(shì)：技術(shù)平臺(tái)：454測(cè)序、Solexa測(cè)序（Illumina測(cè)序）、SOLiD測(cè)序等。 基本流程： 將基因組DNA隨機(jī)切割成為小片段DNA； 在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫(kù)； 將帶接頭的單鏈小片段DNA文

8、庫(kù)固定于固體表面； 對(duì)固定片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，從而制成polony芯片。 針對(duì)芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進(jìn)行一系列循環(huán)反應(yīng)，通過(guò)讀取堿基連接到DNA鏈過(guò)程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定堿基序列。（五）單分子測(cè)序技術(shù)被稱為第三代測(cè)序技術(shù) 主要策略： 通過(guò)摻入并檢測(cè)熒光標(biāo)記的核苷酸，來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序，如單分子實(shí)時(shí)技術(shù)（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成時(shí)的天然化學(xué)方式來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序； 直接讀取單分子DNA序列信息。 二、基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)分析技術(shù) 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（transcription start site，TSS）

9、（一）用cDNA克隆直接測(cè)序法鑒定TSS 以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，同時(shí)利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上polyC尾，并以此引導(dǎo)合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過(guò)對(duì)克隆cDNA的5-末端進(jìn)行測(cè)序分析即可確定基因的TSS序列。 該方法比較簡(jiǎn)單，尤其適于對(duì)特定基因TSS的分析。但可導(dǎo)致5-末端部分缺失，從而影響對(duì)TSS的序列測(cè)定。 （二）用5-cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)鑒定TSS 常用的技術(shù)包括5-末端基因表達(dá)系列分析（5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）和帽分析基因表達(dá)（ca

10、p analysis gene expression，CAGE）技術(shù)。 巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通 PCR相似。第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。巢 式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。（三）用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索TSS 利用對(duì)寡核苷酸帽法構(gòu)建的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)5-末端測(cè)序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個(gè)TSS數(shù)據(jù)庫(kù)（data

11、base of transcription start sites，DBTSS），并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)將寡核苷酸帽法和大量平行測(cè)序技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一種TSS測(cè)序法，從而實(shí)現(xiàn)了一次測(cè)試可產(chǎn)生1107 個(gè)TSS的數(shù)據(jù)。 三、基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析技術(shù) （一）用PCR結(jié)合測(cè)序技術(shù)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) 該方法最為簡(jiǎn)單和直接，即根據(jù)基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，然后以PCR法擴(kuò)增啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序分析啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)。 （二）用核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu) 1. 用足跡法分析啟動(dòng)子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn) 足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點(diǎn)判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域，

12、它是研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的方法。 分類：酶足跡法化學(xué)足跡法 （1）用核酸酶進(jìn)行足跡分析 酶足跡法（enzymatic footprinting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過(guò)電泳分析蛋白質(zhì)結(jié)合序列。常用的酶有DNA酶I（DNase I）和核酸外切酶III。 （2）用化學(xué)試劑進(jìn)行足跡分析 化學(xué)足跡法（chemical footprinting）是利用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于化學(xué)試劑無(wú)法接近結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置就是DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。最常用的化學(xué)足跡法是羥自由基足跡法

13、（hydroxyl radical footprinting）。 2. 用電泳遷移率變動(dòng)分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)鑒定啟動(dòng)子 電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）只能確定DNA序列中含有核蛋白結(jié)合位點(diǎn)，故尚需結(jié)合DNA足跡實(shí)驗(yàn)和DNA測(cè)序等技術(shù)來(lái)確定具體結(jié)合序列。 （三）用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子 1. 用啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)和啟動(dòng)子預(yù)測(cè)算法定義啟動(dòng)子 在定義啟動(dòng)子或預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)時(shí)應(yīng)包括啟動(dòng)子區(qū)域的3個(gè)部分 核心啟動(dòng)子（core promoter）； 近端啟動(dòng)子（proximal promoter）：含有幾個(gè)調(diào)控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及TSS上游幾百個(gè)堿基； 遠(yuǎn)端啟動(dòng)子（dis

14、tal promoter）：范圍涉及TSS上游幾千個(gè)堿基，含有增強(qiáng)子和沉默子等元件。 2. 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的其他結(jié)構(gòu)特征 啟動(dòng)子區(qū)域的其他結(jié)構(gòu)特征包括GC含量、CpG比率、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、堿基組成及核心啟動(dòng)子元件等。 用于啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫(kù)：EPD（eukaryotic promoter databases）數(shù)據(jù)庫(kù)，主要預(yù)測(cè)真核RNA聚合酶型啟動(dòng)子，數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有啟動(dòng)子數(shù)據(jù)信息都經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；TRRD（transcription regulatory region databases）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)來(lái)源于已發(fā)表的科學(xué)論文。 四、基因編碼序列分析技術(shù) （一）用cDNA文庫(kù)法分析基因編

15、碼序列 cDNA克隆測(cè)序或構(gòu)建cDNA文庫(kù)是最早分析基因編碼序列的方法。全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)可以通過(guò)mRNA的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行判斷，mRNA的序列基本都由3部分組成，即5-UTR、編碼序列和3-UTR。 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從cDNA文庫(kù)中獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆。（二）用RNA剪接分析法確定基因編碼序列 高通量分析RNA剪接的方法： 基于DNA芯片的分析法 交聯(lián)免疫沉淀法 體外報(bào)告基因測(cè)定法選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過(guò)基因表達(dá)序列標(biāo)簽（expression sequence tag, EST）的比較進(jìn)行鑒定，但這種方法需進(jìn)行

16、大量的EST序列測(cè)定；同時(shí)由于大多數(shù)EST文庫(kù)來(lái)源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。 （三）用數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因編碼序列在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)各種方法所獲得的cDNA片段的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，通過(guò)染色體定位分析、內(nèi)含子外顯子分析、ORF分析及表達(dá)譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對(duì)其編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)進(jìn)行分析。利用有限的序列信息即可通過(guò)同源性搜索獲得全長(zhǎng)基因序列，然后，利用NCBI的ORF Finder軟件或EMBOSS中的getorf軟件進(jìn)行ORF分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，便可確定基因的編碼序列。 五、基因拷貝數(shù)分析技術(shù) 分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實(shí)質(zhì)

17、上就是對(duì)基因進(jìn)行定性和定量分析，常用的技術(shù)包括DNA印跡（Southern印跡）、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等。 DNA印跡是根據(jù)探針信號(hào)出現(xiàn)的位置和次數(shù)判斷基因的拷貝數(shù) 實(shí)時(shí)定量PCR是通過(guò)被擴(kuò)增基因在數(shù)量上的差異推測(cè)模板基因拷貝數(shù)的異同DNA測(cè)序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法第二節(jié) 基因表達(dá)產(chǎn)物分析技術(shù) 一、通過(guò)檢測(cè)RNA而在轉(zhuǎn)錄水平分析基因表達(dá) 根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因轉(zhuǎn)錄水平分析分為封閉和開放性系統(tǒng)研究方法。 封閉性系統(tǒng)研究方法（如DNA芯片、RNA印跡、實(shí)時(shí)RT-PCR等）的應(yīng)用范圍僅限于已知基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物

18、PCR指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。 （一）用核酸雜交法檢測(cè)RNA表達(dá)水平 1. 用RNA印跡分析RNA表達(dá) RNA印跡被廣泛應(yīng)用于RNA表達(dá)分析，并作為鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標(biāo)準(zhǔn)方法。 2. 用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)分析RNA水平及其剪接情況 RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assay，RPA）是一種基于雜交原理分析RNA的方法，既可進(jìn)行定量分析，又可研究其結(jié)構(gòu)特征。 3. 用原位雜交進(jìn)行RNA區(qū)域定位 原位雜交（ISH）是通過(guò)設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測(cè)RNA的技術(shù)，其可對(duì)細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的RNA進(jìn)

19、行區(qū)域定位，同時(shí)也可作為定量分析的補(bǔ)充。 （二）用PCR技術(shù)檢測(cè)RNA表達(dá)水平 1. 用逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行RNA的半定量分析 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽(yáng)性參照，則可對(duì)待測(cè)RNA樣品進(jìn)行半定量分析。2. 用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行RNA的定量分析 實(shí)時(shí)定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡(jiǎn)便的方法，該方法是對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有很高的靈敏度和特異性。 （三）用基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)分析RNA表達(dá)水平 1. 基因芯片已成為基因表達(dá)譜分析的常用方法 基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于對(duì)不同狀態(tài)下的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的規(guī)律，對(duì)探索

20、發(fā)病機(jī)制、評(píng)價(jià)治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。 2. 用循環(huán)芯片測(cè)序技術(shù)分析基因表達(dá)譜 運(yùn)用循環(huán)芯片測(cè)序技術(shù)，可對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行高通量分析，一次可完成幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)DNA分子片段的序列測(cè)定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌。 二、通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)/多肽而在翻譯水平分析基因表達(dá) （一）用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)/多肽 （二）用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)/多肽 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)/多肽分析方法，其主要用于測(cè)定可溶性抗原或抗體， （三）用免疫組化實(shí)驗(yàn)原位檢測(cè)組織/細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)/多肽 免疫組化實(shí)驗(yàn)包括免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，二者原理

21、相同，都是用標(biāo)記的抗體在組織/細(xì)胞原位對(duì)目標(biāo)抗原（目標(biāo)蛋白質(zhì)/多肽）進(jìn)行定性、定量、定位檢測(cè)。 （四）用流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽(yáng)性細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）通常利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析熒光信號(hào)，根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對(duì)某種蛋白質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞做出判斷。 （五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)水平 1. 用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)/多肽的表達(dá)譜 根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質(zhì)檢測(cè)和功能芯片兩大類。蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針?lè)肿庸潭ㄔ诨?，用以識(shí)別生物樣品溶液中的

22、目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來(lái)研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-DNA蛋白質(zhì)-RNA，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、蛋白質(zhì)-小分子等的相互作用。 蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)組織細(xì)胞來(lái)源的樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。 2. 用雙向電泳分析蛋白質(zhì)/多肽表達(dá)譜 雙向電泳可同時(shí)分離成百上千的蛋白質(zhì)，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。SDSPAGE 是在要走電泳的樣品中加入含有SDS和巰基乙醇的樣品處理液SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 丙烯

23、酰胺 A 單體 甲叉雙丙烯酰胺 B 交聯(lián)劑 TEMED(四甲基乙二胺) 加速劑 過(guò)硫酸銨 催化劑網(wǎng)孔的大小取決于丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度及兩者的比例。一般使用的凝膠濃度為7.5%（該實(shí)驗(yàn)根據(jù)低相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定為12%）丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）1512431016687.536945.0572121、制備的凝膠具有通過(guò)調(diào)節(jié)單體和交聯(lián)劑比例，控制孔徑大小。2、SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)。這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質(zhì)本身電荷上的差異。 蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度完全取決于其分子質(zhì)量。特別是在強(qiáng)還原劑

24、，如巰基乙醇存在下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原劑打開，不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠，孔徑大，Tris-HCi緩沖液，分離膠，孔徑小，Tris-HCi緩沖液，Tris-甘氨酸緩沖液，慢離子蛋白質(zhì)快離子三個(gè)不連續(xù)：緩沖液組成，緩沖液pH值，凝膠孔徑三個(gè)效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)混合樣品帶孔膠 按分子大小分離電泳方向 電泳 小分子大分子SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測(cè)定，在同一凝膠上對(duì)一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白及未知蛋白進(jìn)行電泳，測(cè)定各個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳距離（或遷移率），并對(duì)各自分

25、子量的對(duì)數(shù)（log Mr）作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定未知蛋白質(zhì)的電泳距離（或遷移率），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以求出未知蛋白的分子量。低相對(duì)分子質(zhì)量 相對(duì)分子質(zhì)量 移動(dòng)距離/cm 相對(duì)遷移率（Rm）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 溴酚藍(lán)兔磷酸化酶B 97000牛血清白蛋白 66200兔肌動(dòng)蛋白 43000牛碳酸酐酶 31000胰蛋白酶抑制劑 21100雞蛋清溶菌酶 14400待測(cè)樣品1待測(cè)樣品2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過(guò)程中純度的檢測(cè)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度。等電聚焦電泳(IEF)等電點(diǎn)是每一種蛋白質(zhì)都具有的一個(gè)特征性參數(shù)。概念：等電聚焦電泳是根據(jù)兩性物質(zhì)等電點(diǎn)（pI）的不同而進(jìn)

26、行分離的電泳技術(shù)。純化后的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)可通過(guò)等電聚焦電泳測(cè)定。等電聚焦電泳具有很高的分辨率，可以分辨出等電點(diǎn)相差的蛋白質(zhì)，是分離兩性物質(zhì)如蛋白質(zhì)的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過(guò)加入兩性電解質(zhì)形成一個(gè)pH梯度，兩性物質(zhì)在電泳過(guò)程中會(huì)被集中在與其等電點(diǎn)相等的pH區(qū)域內(nèi)，從而得到分離。固相pH梯度膠條（IPG）：不同pH范圍的商業(yè)化膠條Bio-Rad公司的專門配合IPG膠的等電聚焦設(shè)備，其編程自動(dòng)化二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2DPAGE）二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離）以及SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離）。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形

27、成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。通常第一維電泳是等電聚焦，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。第二維電泳是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電聚焦電泳分離好的蛋白樣品進(jìn)入SDS聚丙烯酰胺凝膠，依據(jù)其分子量大小被分離。這樣各個(gè)蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。二維方向排列的呈“滿天星”狀排列的小圓點(diǎn)。 熒光染色FLA-5000-image: Sypro Ruby stained 2 D-gel, brain proteins 二維電泳熒光檢測(cè)紫外熒光檢測(cè)Anal. Chem. 2003,75,157-159（20cm20cm）凝膠分辨到3000個(gè)點(diǎn)已是相當(dāng)不錯(cuò)二

28、維電泳分離所得到的實(shí)質(zhì)上是構(gòu)成蛋白質(zhì)的各個(gè)亞基，而非完整的功能蛋白質(zhì)第三節(jié) 基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)一、用功能獲得策略鑒定基因功能 基因功能獲得策略的本質(zhì)是將目的基因直接導(dǎo)入某一細(xì)胞或個(gè)體中，使其獲得新的或更高水平的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞或個(gè)體生物性狀的變化來(lái)研究基因功能。 方法： 轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因敲入技術(shù) （一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能 轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technology）是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉?xì)胞（embryonic stem cell），即ES細(xì)胞，通過(guò)隨機(jī)重組使外源基因插入細(xì)胞染色體DNA，隨后將受精卵或ES細(xì)胞植入假孕受體動(dòng)物的子宮，使得外源基因能夠隨細(xì)胞分裂遺傳

29、給后代。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動(dòng)物，其制備步驟主要包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建、外源基因的導(dǎo)入和鑒定、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得和鑒定、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系的繁育等。轉(zhuǎn)基因小鼠最為常見。 （二）用基因敲入技術(shù)獲得基因的功能 基因敲入（gene knock-in）是通過(guò)同源重組的方法，用某一基因替換另一基因，或?qū)⒁粋€(gè)設(shè)計(jì)好的基因片段插入到基因組的特定位點(diǎn)，使之表達(dá)并發(fā)揮作用。通過(guò)基因敲入可以研究特定基因在體內(nèi)的功能；也可以與之前的基因的功能進(jìn)行比較；或?qū)⒄；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到靶向基因治療的目的。 基因敲入是基因打靶（g

30、ene targeting）技術(shù)的一種。基因打靶是一種按預(yù)期方式準(zhǔn)確改造生物遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。除基因敲入外，基因打靶還包括基因敲除、點(diǎn)突變、缺失突變、染色體大片段刪除等。基因打靶與轉(zhuǎn)基因技術(shù)均可用于基因功能研究，但二者的最大區(qū)別就是基因打靶能去除和/或替換生物體內(nèi)的固有基因，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)則未去除或替換固有基因。目前，基因打靶已成為研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 二、用功能失活策略鑒定基因功能 基因功能失活策略的本質(zhì)是將細(xì)胞或個(gè)體的某一基因功能部分或全部失活后，通過(guò)觀察細(xì)胞生物學(xué)行為或個(gè)體遺傳性狀表型的變化來(lái)鑒定基因的功能。 方法： 基因敲除基因沉默 基因敲除（gene knock-o

31、ut）屬于基因打靶技術(shù)的一種，其利用同源重組的原理，在ES細(xì)胞中定點(diǎn)破壞內(nèi)源基因，然后利用ES細(xì)胞發(fā)育的全能性，獲得帶有預(yù)定基因缺陷的雜合子，通過(guò)遺傳育種最終獲得目的基因缺陷的純合個(gè)體。 （一）用基因敲除技術(shù)使基因功能完全缺失 條件性基因敲除（conditional gene knock-out）可以更加明確地在時(shí)間和空間上操作基因靶位，敲除效果更加精確可靠，理論上可達(dá)到對(duì)任何基因在不同發(fā)育階段和不同器官、組織的選擇性敲除。 （二）用基因沉默技術(shù)可使基因功能部分缺失 1. 用RNA干擾技術(shù)研究基因功能 2. 用miRNA技術(shù)研究基因功能 3. 用反義RNA技術(shù)研究基因功能 4. 核酶（ribo

32、zyme）技術(shù) 利用RNAi能在短時(shí)間內(nèi)高效特異地抑制靶基因表達(dá)的特點(diǎn)，可以很方便地研究基因的功能。 通過(guò)與mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合而抑制翻譯，一種miRNA可沉默多個(gè)靶基因。 通過(guò)反義RNA與細(xì)胞中的mRNA特異性結(jié)合，從而抑制相應(yīng)mRNA的翻譯。 核酶通過(guò)剪切靶RNA分子而抑制基因的表達(dá)。 是一大家族小分子非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約20-25個(gè)堿基，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為7090個(gè)堿基的單鏈RNA 前體(pre-miRNA)經(jīng)Dicer酶剪切后形成。這些成熟的miRNA 與其他蛋白質(zhì)一起組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC），通過(guò)與其靶mRNA 分子的3 端非翻譯區(qū)域（3 UTR）互補(bǔ)匹配，再以目前尚不清楚的機(jī)制抑制該