流式細(xì)胞儀原理 與臨床應(yīng)用

1、流式細(xì)胞儀8/6/20221中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 流式細(xì)胞儀就是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進(jìn)的檢測(cè)儀器。8/6/20222中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個(gè)細(xì)胞分析同時(shí)多參數(shù)分析速度快：10000個(gè)細(xì)胞/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞8/6/20223中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀的應(yīng)用流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)處理8/6/20224中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的工作原理8/6/20225中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,

2、簡(jiǎn)稱FCM,又名FACS）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時(shí)檢測(cè)單個(gè)微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時(shí)可以對(duì)特定群體加以分選研究對(duì)象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量工作原理8/6/20226中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)8/6/20227中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid8/6/20228中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 細(xì)胞被

3、戴上特殊的標(biāo)記。所用的標(biāo)記細(xì)胞的探針是能夠同待分選細(xì)胞表面特征性蛋白(抗原)結(jié)合的抗體，而這種抗體又能夠同某種熒光染料結(jié)合。被結(jié)合的細(xì)胞帶上了熒光標(biāo)記。當(dāng)稀釋的細(xì)胞進(jìn)入超聲波振蕩器時(shí)，極稀的細(xì)胞懸浮液形成很小的液滴，一個(gè)液滴中只含有一個(gè)細(xì)胞。液滴一旦形成并通過激光束時(shí)，激光束激發(fā)結(jié)合在細(xì)胞表面抗體分子。8/6/20229中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心熒光染料及其發(fā)射波長(zhǎng)FITC 525nmPE 575nmPI 630nm自發(fā)熒光與特異熒光8/6/202210中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子 PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記：一般不

4、提倡用8/6/202211中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL陰性對(duì)照：常用同型抗體對(duì)照 單色分析：設(shè)同型抗體對(duì)照 多色分析：同型對(duì)照，單陽性對(duì)照（用于儀器校正）陽性對(duì)照：檢測(cè)陰性時(shí)8/6/202212中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體8/6/202213中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的樣品要求單細(xì)胞懸液被檢細(xì)胞或顆粒大小0.280um樣品中至少20000個(gè)細(xì)胞，濃度105-107個(gè)/毫升8/6/202214中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的

5、光學(xué)系統(tǒng)激光 (Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長(zhǎng)、單一方向、同步的穩(wěn)定光照激光波長(zhǎng): 臺(tái)式機(jī)為固定波長(zhǎng)488nm, 635nm ，大型機(jī)波長(zhǎng)譜線寬包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成，將產(chǎn)生的光信號(hào)引導(dǎo)至檢測(cè)器8/6/202215中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Forward Angle Light ScatterFALS SensorLaser8/6/202216中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心90 Degree Light ScatterFALS S

6、ensor90LS SensorLaser8/6/202217中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Dichroic Filter/MirrorFilter placed at 45oReflected lightTransmitted LightLight Source8/6/202218中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心LaserFluorescence DetectorsFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue University Cytometry Laboratories8/6/202219中國(guó)科技大學(xué)生

7、命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)8/6/202220中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小；熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。8/6/202221中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心1 流式細(xì)胞儀的散射光信號(hào)FSC:表示細(xì)胞大小SSC：表示細(xì)胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度8/6/202222中國(guó)科技大學(xué)

8、生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖（紅細(xì)胞溶解后）8/6/202223中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心2，熒光信號(hào)熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動(dòng)能和熱能釋放較入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)8/6/202224中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的電子系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物, 通過激光照射區(qū)時(shí), 受到激發(fā), 產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的、代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號(hào)熒光信號(hào)由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度電脈沖信號(hào)經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)數(shù)字信號(hào)傳送到計(jì)算機(jī)，進(jìn)行儲(chǔ)存、 作

9、圖、 統(tǒng)計(jì)分析8/6/202225中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 當(dāng)含細(xì)胞的液滴逐個(gè)通過激光束時(shí)，受到兩種檢測(cè)器的檢測(cè):如果液滴中含有細(xì)胞就會(huì)激活干涉檢測(cè)器(interference detector)，只有帶有熒光標(biāo)記細(xì)胞的液滴才會(huì)激活熒光檢測(cè)器(fluorescence detector)。當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的液滴通過激光束時(shí)，將兩種檢測(cè)器同時(shí)激活，引起液滴充電信號(hào)使鞘液帶上負(fù)電荷。由于液滴帶有負(fù)電荷，移動(dòng)時(shí)就會(huì)向正極移動(dòng)，進(jìn)入到熒光標(biāo)記細(xì)胞收集器中。細(xì)胞分選的原理8/6/202226中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)488 nm laser+-Charged PlatesSingl

10、e cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector8/6/202227中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的應(yīng)用8/6/202228中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的科研應(yīng)用細(xì)胞表型分析胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)染色體分類研究細(xì)胞周期和DNA倍體分析流式標(biāo)準(zhǔn)小球定量分選細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)量8/6/202229中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心8/6/202230中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心How to analyze soluble proteins in FCM?+Antigen (cytokines)Fluorescence D

11、etector antibodyCapture beads Capture antibodyBeads8/6/202231中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.8/6/202232中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Beads Pro

12、vide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different intensities8/6/202233中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector Antibod

13、iesWashAnalyze on flow cytometer8/6/202234中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心CBA Standard curves8/6/202235中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27: 強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)8/6/202236中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)處理8/6/202237中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心數(shù)據(jù)處理 檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯示視測(cè)量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá)，其X軸為測(cè)量強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞數(shù)目。

14、對(duì)于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點(diǎn)圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。8/6/202238中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（1）直方圖分析8/6/202239中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（2）點(diǎn)圖分析8/6/202240中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（3）等高圖和密度圖分析8/6/202241中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Gating8/6/202242中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Compensation8/6/202243中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心compensation8/6/202244中國(guó)科技大學(xué)

15、生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心8/6/202245中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心G0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation8/6/202246中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)1 幾個(gè)概念2 技術(shù)和方法8/6/202247中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心1 熒光信號(hào)的面積：對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分 2 DNA指數(shù)(DI)：相對(duì)DNA含量3異倍體：非二倍體，包括近二倍體，四倍體，多倍體，非整倍體8/6/202248中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變?。患?xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC降低，SSC增加。細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC增大，SSC也增大8/6/202249中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心Annexin V/PI雙染活細(xì)胞為（Annexin V-/PI-） 壞死細(xì)胞為（Annexin