流式細胞儀原理 與臨床應(yīng)用

1、流式細胞儀8/6/20221中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心 流式細胞儀就是進行流式細胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測儀器。8/6/20222中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的特點單個細胞分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細胞/秒統(tǒng)計學(xué)意義：提供細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞8/6/20223中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的原理流式細胞儀的應(yīng)用流式細胞儀的數(shù)據(jù)處理8/6/20224中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的工作原理8/6/20225中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞術(shù)（Flow Cytometry,

2、簡稱FCM,又名FACS）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量工作原理8/6/20226中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀儀器結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)8/6/20227中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid8/6/20228中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心 細胞被

3、戴上特殊的標(biāo)記。所用的標(biāo)記細胞的探針是能夠同待分選細胞表面特征性蛋白(抗原)結(jié)合的抗體，而這種抗體又能夠同某種熒光染料結(jié)合。被結(jié)合的細胞帶上了熒光標(biāo)記。當(dāng)稀釋的細胞進入超聲波振蕩器時，極稀的細胞懸浮液形成很小的液滴，一個液滴中只含有一個細胞。液滴一旦形成并通過激光束時，激光束激發(fā)結(jié)合在細胞表面抗體分子。8/6/20229中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心熒光染料及其發(fā)射波長FITC 525nmPE 575nmPI 630nm自發(fā)熒光與特異熒光8/6/202210中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光分子 PE最強，適用于弱表達抗原 FITC最便宜，適用于強表達抗原間接標(biāo)記：一般不

4、提倡用8/6/202211中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心實驗對照的設(shè)計空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設(shè)同型抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時8/6/202212中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心實驗標(biāo)本的處理單細胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體8/6/202213中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的樣品要求單細胞懸液被檢細胞或顆粒大小0.280um樣品中至少20000個細胞，濃度105-107個/毫升8/6/202214中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的

5、光學(xué)系統(tǒng)激光 (Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照激光波長: 臺式機為固定波長488nm, 635nm ，大型機波長譜線寬包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成，將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)至檢測器8/6/202215中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Forward Angle Light ScatterFALS SensorLaser8/6/202216中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心90 Degree Light ScatterFALS S

6、ensor90LS SensorLaser8/6/202217中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Dichroic Filter/MirrorFilter placed at 45oReflected lightTransmitted LightLight Source8/6/202218中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心LaserFluorescence DetectorsFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue University Cytometry Laboratories8/6/202219中國科技大學(xué)生

7、命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)8/6/202220中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心 流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。8/6/202221中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心1 流式細胞儀的散射光信號FSC:表示細胞大小SSC：表示細胞內(nèi)顆粒的復(fù)雜程度8/6/202222中國科技大學(xué)

8、生命科學(xué)實驗中心外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）8/6/202223中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心2，熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動能和熱能釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強8/6/202224中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的電子系統(tǒng)進行信號檢測和分析當(dāng)細胞攜帶熒光素標(biāo)記物, 通過激光照射區(qū)時, 受到激發(fā), 產(chǎn)生不同波長的、代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進行儲存、 作

9、圖、 統(tǒng)計分析8/6/202225中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心 當(dāng)含細胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢測器的檢測:如果液滴中含有細胞就會激活干涉檢測器(interference detector)，只有帶有熒光標(biāo)記細胞的液滴才會激活熒光檢測器(fluorescence detector)。當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的液滴通過激光束時，將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液帶上負電荷。由于液滴帶有負電荷，移動時就會向正極移動，進入到熒光標(biāo)記細胞收集器中。細胞分選的原理8/6/202226中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀分選系統(tǒng)488 nm laser+-Charged PlatesSingl

10、e cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector8/6/202227中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的應(yīng)用8/6/202228中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的科研應(yīng)用細胞表型分析胞內(nèi)細胞因子的檢測染色體分類研究細胞周期和DNA倍體分析流式標(biāo)準(zhǔn)小球定量分選細胞內(nèi)鈣離子測量8/6/202229中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心8/6/202230中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心How to analyze soluble proteins in FCM?+Antigen (cytokines)Fluorescence D

11、etector antibodyCapture beads Capture antibodyBeads8/6/202231中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Multiplexed BeadsShades of a colorAntibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensitiesVarious analytesAntibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.8/6/202232中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Beads Pro

12、vide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensitiesDifferent colors with different intensities8/6/202233中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Example 6-bead assayIL-8IL-1bIL-6IL-10TNFIL-12Capture BeadsLysate or SupernatantSampleDetector Antibod

13、iesWashAnalyze on flow cytometer8/6/202234中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心CBA Standard curves8/6/202235中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27: 強直性脊柱炎淋巴細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網(wǎng)織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗8/6/202236中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀的數(shù)據(jù)處理8/6/202237中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心數(shù)據(jù)處理 檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數(shù)目。

14、對于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。8/6/202238中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀數(shù)據(jù)分析（1）直方圖分析8/6/202239中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀數(shù)據(jù)分析（2）點圖分析8/6/202240中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心流式細胞儀數(shù)據(jù)分析（3）等高圖和密度圖分析8/6/202241中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Gating8/6/202242中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Compensation8/6/202243中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心compensation8/6/202244中國科技大學(xué)

15、生命科學(xué)實驗中心8/6/202245中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心G0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation8/6/202246中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心細胞凋亡檢測技術(shù)1 幾個概念2 技術(shù)和方法8/6/202247中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心1 熒光信號的面積：對熒光光通量進行積分 2 DNA指數(shù)(DI)：相對DNA含量3異倍體：非二倍體，包括近二倍體，四倍體，多倍體，非整倍體8/6/202248中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心凋亡細胞的特點在形態(tài)上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變??；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞凋亡細胞的FSC降低，SSC增加。細胞壞死時，細胞腫脹，F(xiàn)SC增大，SSC也增大8/6/202249中國科技大學(xué)生命科學(xué)實驗中心Annexin V/PI雙染活細胞為（Annexin V-/PI-） 壞死細胞為（Annexin