醫(yī)學資料7新4ES胚胎干細胞

1、胚 胎 干 細 胞王 鋒 王 子 玉逸夫樓3084 84395381南京農業(yè)大學動物胚胎工程技術中心動物胚胎工程之2021/7/18 星期日內 容個體發(fā)生過程干細胞的概念胚胎干細胞概念應用前景面臨的問題及解決辦法2021/7/18 星期日一 、個體發(fā)生過程 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚 滋養(yǎng)層胎盤及胎兒附屬結構囊胚 內胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。 內細胞群 中胚層結締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng) 外胚層體表結構；神經系統(tǒng)2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日囊 胚ICM2021/7/18 星期日2021/7/

2、18 星期日二、干細胞的概念1、干細胞：具有自我復制的能力，在一定條件下能分化成各種功能細胞。2021/7/18 星期日2、分類 （1）全能干細胞，包括：胚胎干細胞（embryonic stem cells, ES細胞）生殖干細胞（embryonic germ cells, EG細胞） 具有全能性，能夠分化成所有細胞類型， 進一步形成機體的任何組織和器官。（2）多能干細胞：具有分化成多種細胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力。（3）專能干細胞：只能向一種或密切相關的兩種類型的細胞分化。2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日干細胞是一種能夠分裂成與自身一致的細胞或幾種特殊

3、分化的細胞型的細胞。動物體內干細胞的正常作用是在發(fā)育的過程中可提供不同的細胞型,以生長成不同的組織和器官。它們也提供替代細胞以修復身體不同部分的損傷。2021/7/18 星期日干細胞療法就是利用已特殊分化的干細胞,通過特殊的途徑提供細胞去替代那些在退行性過程和損傷中失去的細胞。使用未分化干細胞也存在畸胎瘤和其他腫瘤形成的風險。2021/7/18 星期日目前人干細胞的主要來源或者潛在來源如下: 胚泡,可以提供多能干細胞; 胎兒組織,可以提供多能或者專能干細胞; 臍帶血,可以提供專能干細胞; 成人組織,可提供專能干細胞或單能干細胞。 2021/7/18 星期日三、胚胎干細胞1、概念胚胎干細胞 (e

4、mbryonic stem cells,ESC)是一種從早期胚胎內細胞團或原始生殖細胞經分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細胞。ES細胞可不斷保持增殖而不分化且在連續(xù)培養(yǎng)后仍能具有發(fā)育成三個胚層的潛能。 這種細胞具有與早期胚胎相似的分化潛能和正常二倍體核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及體細胞的某些特性。 2021/7/18 星期日ES細胞的全能性（totipotenty），是指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細胞發(fā)育成完整動物體的能力。其實質是細胞基因組中決定蛋白質編碼的所有基因按一定的時空順序依次表達。ES細胞是能在體外大量增殖的全能性細胞

5、，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的實驗材料。2021/7/18 星期日ES細胞全能性的檢測方法是以胚胎干細胞進行細胞核移植。如果ES細胞能和去核的細胞融合發(fā)育成重構胚，而且經過胚胎移植，重構胚能發(fā)育形成個體，則表明ES細胞具有全能性。例如，將綿羊的類ES細胞注射到去核卵母細胞中，獲得重構胚。重構胚經過胚胎移植，有活的羔羊產生，證明了綿羊的類ES細胞具有發(fā)育全能性。2021/7/18 星期日2、ES細胞研究發(fā)展史1981年，英國劍橋大學的Evans和Kaufman用囊胚內細胞團(ICM)建立小鼠ES細胞系1998年美國Thomson從人的體外受精囊胚中分離得到了ES細胞。同年約翰霍普

6、金斯大學的Shamblott等從人的PGC細胞中分離得到人的全能性干細胞。人ES細胞的分離成功給人類的基因治療和器官移植打下了基礎。其他動物只獲得了類ES細胞。2021/7/18 星期日1999年12月，美國科學雜志公布了當年世界科學進展的評定結果，干細胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學進展首位。2002年3月，美國麻省理工學院的科學家宣布，他們首次利用人體胚胎干細胞培育出毛細血管，證明了胚胎干細胞技術在治療心血管疾病等領域的應用潛力。目前已有報導ES細胞能在適當條件下分化為心肌細胞，胰島細胞，血管內皮細胞，肝細胞等。2021/7/18 星期日衍生自囊胚的內細胞

7、團或原始外胚層的細胞；永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結構；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程； 3、胚胎干細胞的性質2021/7/18 星期日4、胚胎干細胞系的建立過程4.1 概述2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日4.2 胚胎干細胞的分離酶消化后培養(yǎng)免疫方法去處滋養(yǎng)層細胞流式細胞儀分離法2021/7/18 星期日4.3 培養(yǎng)條件：(1) 特殊的培養(yǎng)液：用DMEM培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質量很重要，加非必須氨基酸；-巰基乙醇。(2) 以人或胚鼠的成纖維細胞為飼養(yǎng)層細胞。(3) 必須加入LI

8、F，抑制細胞分化。2021/7/18 星期日早期胚胎及PGCs的培養(yǎng)將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、3739度條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEEM+15%FCS。培養(yǎng)液中可添加多種細胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF. 3-巰基乙醇等。2021/7/18 星期日傳 代進行體外培養(yǎng)時，當ICM增殖后或PGCs出現ES樣克隆后即可傳代。ESC的增殖速度很快，小鼠ESC每78h倍增一次;豬類ESC每20h倍增一次;羊類ESC，每4050h倍增一次;牛類ESC每1824h倍增一次。傳代時一般是用胰酶EDTA消化，再用微吸管或撥針將其打散成單個細胞，然后移入新的飼

9、養(yǎng)層上，培養(yǎng)幾天后，即可出現新的克隆點，在其分化之前可以再進行傳代。2021/7/18 星期日 5. 胚胎干細胞的鑒別 （1）細胞形態(tài)與結構 ES細胞形態(tài)表現為胞體小、泡狀、核大 (核質比高)、細胞聚集成集落生長（鳥巢狀）、細胞排列緊密、無細胞界限、能連續(xù)穩(wěn)定傳代且不分化。（2）細胞功能（3）細胞表面的特殊標志：AKP陽性（4）細胞內特異基因的表達2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日胚胎干細胞檢測指標(1) 細胞內堿性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色(4) 細胞膜表面有特殊的標記：SSEA-3, SSEA-4,

10、 TRA-1-60, TRA-1-81。(5) 能分化成三個胚層的細胞，將胚胎干細胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可產生畸胎瘤(6) 可誘導分化為各種成體干細胞2021/7/18 星期日ICM細胞 EG細胞 來源 附置前早期胚胎內細胞團 早期胎兒生殖嵴原始生殖細胞 形態(tài)學 直徑一般為1215m直徑一般1518m胰島素樣生長因子受體(Insulin-likereceptor,Igf2r)基因甲基化狀態(tài) 印記基因Igf2r包含1個母系甲基化位點和1個父系非甲基化位點 印記基因Igf2r兩個位點均處于非甲基化狀態(tài) 體內分化 形成畸胎瘤 不形成 6. 兩種來源的ES細胞的區(qū)別2021/7/18 星期日7. E

11、S細胞的誘導分化2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日干細胞誘導分化的常用方法（1）加入誘導細胞分化的因子或化學物質， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等（2）將ES細胞與特定的細胞共培養(yǎng) （3）將某種分化誘導因子的基因轉入ES細 胞內 2021/7/18 星期日四、 ES細胞的應用前景胚胎干細胞（ES）成為當今生命科學和生物技術研究的熱點。這與它具有“發(fā)育全能性”的神奇功能密切相關。干細胞是未分化的原始細胞。其中，全能干細胞能分化成人體200多種細胞類型，形成機體的任何細胞、組織和器官。2021/7/18 星期日倘能掌握其分化發(fā)育的規(guī)律，在人工條件下定向分化為所需的細胞、

12、組織乃至器官，就可以用來治療目前還難以或無法治愈的帕金森氏病、早老性癡呆、白血病、糖尿病等頑癥，并且解決十分緊缺的組織和器官移植的來源問題嗎？進一步，與克隆技術相結合，運用體細胞核轉移技術來得到ES，還能解決細胞治療以及組織和器官移植的免疫排異難題。2021/7/18 星期日1. 胚胎干細胞研究的意義 ES細胞特有的生物學特性,決定了其在生物學領域有著不可估量的應用價值。 在進行ES細胞建系和定向分化的同時,以ES細胞為材料，在核移植、嵌合體、轉基因動物研究等方面也進行了廣泛的嘗試,已經充分體現出ES細胞在加快良種家畜繁育、生產轉基因動物、哺乳動物發(fā)育模型、基因和細胞治療等方面有著廣闊的應用前

13、景。 2021/7/18 星期日 近幾年來，胚胎工程技術、基因工程技術、組織工程技術與ES細胞研究的結合已經成為現實，將使相關的基礎學科研究以及醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等發(fā)生重大變化，走向一個新的時代。2021/7/18 星期日2. 胚胎干細胞的用途為在細胞和分子水平研究研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育規(guī)律提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手段。細胞分化機制，細胞癌變機理用于新藥的發(fā)現、篩選及安全性實驗：如藥物機理及毒性實驗重要的臨床價值，可作為組織移植、細胞治療和基因治療的細胞來源：制造細胞、組織和器官；人ES定向誘導分化為人體器官；生產用于人類器官移植的動物器官：無免疫排斥；豬可以作為人異種器官移

14、植的器官供體來源。2021/7/18 星期日生產克隆動物：由于ES細胞是具有全能性、未分化的細胞，因此是制作克隆動物很好的核供體。 生產轉基因動物：建立轉基因細胞系，抗病育種；藥用蛋白2021/7/18 星期日ES細胞可作為基因打靶的靶細胞，經打靶引入定點整合外源基因，提高轉基因動物的整合率和表達效果。 ES細胞也可進行基因敲除，獲得基因敲除動物，如豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。 2021/7/18 星期日在發(fā)育生物學基礎研究中，利用ES細胞研究細胞分化的機埋，有助于闡明細胞分化調節(jié)的機制。 ES細胞的多能性可以在一定培養(yǎng)條件下轉化為特定的細胞。試驗證明，體外誘導小鼠ES細胞的分化，

15、可形成內臟卵黃囊、心肌層，也可以得到神經元樣細胞和成纖維樣的細胞。2021/7/18 星期日使人的ES細胞與豬等動物的胚胎結合，可得到人-豬嵌合體動物，由于ES細胞具有全能性，可分化形成不同胚層，包括某些器官，這樣的器官與人的器官具有相同的免疫特性，因此它不會對人產生排異反應。 2021/7/18 星期日人的ES細胞也可在體外定向誘導培養(yǎng)，生產人的肌肉、神經和造血細胞的細胞組織，在治療人的某些疾病上有重要的應用價值?？茖W家們一直試圖誘導各種干細胞定向分化為特定的組織來替代那些受損的體內組織，比如把產生胰島素的細胞植入糖尿病患者體內。2021/7/18 星期日科學家們已經能夠使豬ES細胞轉變?yōu)樘?/p>

16、動的心肌細胞，使人ES細胞生成神經細胞和間充質細胞，并能使小鼠ES細胞分化為內胚層細胞。這些結果為細胞和組織替代療法開辟了道路。目前，科學家已成功分離到人ES細胞，而體細胞克隆技術為生產患者自身的ES細胞提供了可能。2021/7/18 星期日治療性克隆：體細胞核移植（SCNT）去核卵細胞 + 體細胞核 克隆 囊胚 分離內細胞群 ES細胞2021/7/18 星期日把患者體細胞移植到去核卵母細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚，然后從囊胚內分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型 (如神經細胞、肌肉細胞和血細胞)，用于替代療法。這種核移植法的最終目的是用于干細胞治療，而非

17、得到克隆個體，科學家們稱之為“治療克隆”。生殖性克隆2021/7/18 星期日2.2021/7/18 星期日ES細胞研究的倫理問題ES研究也引發(fā)了當前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個問題而展開：一是如何看待胚胎。ES主要有三個來源：（1）（自然和人工）流產的胚胎；（2）輔助生殖剩余的胚胎；（3）通過體細胞核轉移術得到的胚胎。2021/7/18 星期日不管哪一個來源，提取ES必定會損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”，很自然地成為爭論的焦點。國內認為：與“胚胎”的生命相比，“人”的生命具有優(yōu)先權，可以殺死胚胎來救“人”的生命。2021/7/18 星

18、期日另一焦點在于，是否必然滑向生殖性克隆。2003年10月，聯(lián)合國大會以80票贊成、79票反對、15票棄權的表決結果，將禁止人的克隆生殖國際公約推遲一年。世界各國都表示反對生殖性克隆，為什么這一國際公約通不過呢？因為79個國家認為治療性克隆必然滑向生殖性克隆，主張二者同時禁止。治療性克隆是ES研究的主要目的。封殺治療性克隆，實際上就是要封殺ES研究。2021/7/18 星期日ES細胞技術的發(fā)展方向ES細胞維持自我更新和定向分化的分子機理ES細胞治療技術的研究ES細胞作工具探討基因功能和個體的發(fā)生發(fā)育ES細胞治療中的免疫排斥問題治療型克隆技術分離ES細胞新途徑的研究用ES細胞生產轉基因家畜202

19、1/7/18 星期日 ES細胞具有可以無限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現型的特點。 如果以ES細胞作為核供體進行核移植,可以在短時間內獲得大量基因型和表現型完全相同的個體。 而且用ES細胞與胚胎進行嵌合克隆動物,可以解決哺乳動物遠緣雜交的困難,生產出珍貴的動物,也可以進行異種動物克隆,有助于保護珍惜野生動物。ES細胞與動物克隆2021/7/18 星期日盡管體細胞克隆與ES細胞克隆相比有著易于取材的特點，但是體細胞克隆也存在著不少缺點，如生理和免疫缺陷，目前體細胞克隆還不能完全代替ES細胞克隆。2021/7/18 星期日 ES細胞作基因載體 目前常用的生產轉基因動物的方法是向受精卵中注射D

20、NA，外源基因的整合、表達和篩選工作是在個體水平上進行的，不僅工作繁瑣，周期長成功率低，產生的后代的遺傳性狀也常出現分離；2021/7/18 星期日而利用ES細胞作為基因載體，得到基因整合的細胞，將載體ES細胞直接進行核移植或者通過與胚胎嵌合獲得嵌合動物，ES細胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細胞，即可以得到攜有目的基因的轉基因動物。2021/7/18 星期日因為一個優(yōu)良的ES細胞系不僅可以用于各種目的基因轉化，用各種方法將外源DNA導入細胞，而且外源基因的整合數目、位點、表達程序以及穩(wěn)定性等都可以在細胞水平上進行加工，篩選，在很大程度上加快了動物遺傳工程的進程。2021/7/18 星期日2

21、021/7/18 星期日改善ES細胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡便的獲得ES細胞的方法。定向誘導分化成特定類型細胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細胞的比較，成體干細胞能否替代胚胎干細胞？2021/7/18 星期日嵌合體實驗和克隆動物實驗是將ES細胞與正常的胚胎融合制作嵌合體或將ES細胞作為核供體進行核移植，產生克隆動物后代。這兩者是檢驗ES細胞的最有效、最有說服力的方法。 2021/7/18 星期日人的ES細胞可以高水平地表達端粒酶活性，二倍體的人體細胞不表達端粒酶，并且隨著年齡的增長端粒變短，而在組織培養(yǎng)達到一定增殖壽命時，

22、就開始衰老。與此相反，端粒酶在生殖系和胚胎組織中都有很高的活性。ES細胞中的高水平端粒酶活性證實了它的壽命將超過體細胞。2021/7/18 星期日ES細胞系的分離效率低ES細胞定向誘導分化的理論和技術水平低：隨機的，運氣。2021/7/18 星期日解決胚胎來源有限的途徑： 未成熟卵的體外成熟2021/7/18 星期日避免免疫排斥的方法（1）Knock-out 胚胎干細胞的組織相 容性抗原（2）Knock-in 受者的組織相容性抗原（3）與同一來源的造血干細胞一同移植（4）受者的體細胞核移植2021/7/18 星期日2021/7/18 星期日胚胎嵌合技術研究概況嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。中國的“龍”：九似 圖騰在