細(xì)胞骨架的觀察

1、細(xì)胞骨架的觀察1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?熟悉免疫化學(xué)方法的原理及操作步驟。掌握掌握考馬斯亮藍(lán)R250染色法及觀察細(xì)胞內(nèi)微絲的方法。掌握用間接免疫熒光法顯示細(xì)胞內(nèi)微管的方法。2. 實(shí)驗(yàn)原理2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù) 2.2 細(xì)胞骨架的觀察 2.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)(Immunochistochemistry) 是利用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的原理，用帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)特定抗原進(jìn)行定性、定位和定量研究的一項(xiàng)新技術(shù)，又稱(chēng)免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)。 免疫組織化學(xué)技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定位準(zhǔn)確和簡(jiǎn)便快速等優(yōu)

2、點(diǎn)，又能夠同形態(tài)、功能及代謝等研究結(jié)合起來(lái)，用以研究其它技術(shù)（如化學(xué)、生化、免疫及生理等）難以深入的領(lǐng)域。 免疫組織化學(xué)的過(guò)程（1）抗原的提取與純化；（2）免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體 的純化；（3）將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體；（4）標(biāo)本的制備；（5）免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng)；（6）觀察結(jié)果。 免疫熒光法 免疫熒光法分為直接法和間接法。直接法：將熒光素（最常用異硫氰酸熒光素、FITC）標(biāo)記在特異性抗體上，使其直接與細(xì)胞上相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察即可鑒定未知抗原。間接法：將熒光素標(biāo)記在第二抗體上，待一抗與細(xì)胞抗原結(jié)合后，再用標(biāo)記了的二抗與一抗相接，從而顯示未知抗原。

3、間接免疫熒光法中具有2對(duì)抗原、抗體系統(tǒng)。2.2 細(xì)胞骨架的觀察 細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中錯(cuò)綜復(fù)雜的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)，按纖維直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同分為微絲(microfilaments，MF，57nm)、微管(microtubule，MF，2025nm)和中等纖維(intermediate filaments，IF，811nm)。 目前觀察細(xì)胞骨架的手段主要有電鏡、間接免疫熒光技術(shù)、酶標(biāo)、組織化學(xué)等。 微絲的觀察考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)R250是一種普通的蛋白質(zhì)染料，它可以使各種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細(xì)胞骨架纖維在該實(shí)驗(yàn)條件下不夠穩(wěn)

4、定，例如微管；還有些類(lèi)型的纖維太細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的張力纖維，直徑約40nm左右。實(shí)驗(yàn)中用1Triton X100可抽提掉胞質(zhì)中除骨架蛋白以外的其他蛋白，能清晰地顯示微絲束。微絲的觀察熒光法用熒光染料甲基羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽處理后，可在熒光顯微鏡下看到微絲動(dòng)態(tài)變化的圖象。 微管的觀察免疫組織化學(xué)法 用抗管蛋白的免疫血清(一級(jí)抗體，例如兔抗管蛋白抗體)與體外培養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，該抗體將與胞質(zhì)中的微管(抗原)特異結(jié)合，然后再加熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體（二級(jí)抗體），例如異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔抗體共同溫育，該二級(jí)抗體與一級(jí)抗體結(jié)合，從而使微管間接地標(biāo)

5、上熒光素。置熒光顯微鏡下用一定波長(zhǎng)激發(fā)光照射即由熒光所在顯示出微管的形態(tài)和分布。2.實(shí)驗(yàn)材料 、用品實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)的Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用品： 實(shí)驗(yàn)器材：光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡，冰箱(20及4)，小型振蕩器，溫箱，細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備；平皿，直徑30mm小染缸，載玻片，蓋玻片，鋁盒等。 主要試劑 M緩沖液，1%Triton X100（用M緩沖液配制），0.2%考馬斯亮藍(lán)R250，3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制），3.7%甲醛PEMD，甲基羅丹明鬼筆環(huán)肽染液。 PEM緩沖液，PEMP緩沖液，PEMD緩沖液， 兔抗管蛋白血清（一抗），F(xiàn)ITC-羊抗兔抗體（二抗），甘油-PBS(9:1，pH

6、 8.5-9.0)。4.實(shí)驗(yàn)步驟微絲的觀察考馬斯亮藍(lán)法細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片上，生長(zhǎng)密度達(dá)+時(shí)，取出蓋玻片，用PBS洗3次。用1%Triton X100處理2530 min，室溫或37均可。立即用M緩沖液輕輕洗細(xì)胞3次。略晾干后，用3%戊二醛固定細(xì)胞5-15 min。PBS洗數(shù)次，濾紙吸干。用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染片30min-1h。然后小心用水沖洗，蒸餾水沖洗，空氣中略干燥。普通光學(xué)顯微鏡下用40物鏡或油鏡觀察。4. 實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)在平皿中的蓋玻片小條上，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)+(約70%80%)時(shí)取出放進(jìn)小染缸中，用PBS清清沖洗。3.7%甲醛PEMD室溫固定10 min，用PBS洗去

7、固定液后，略干燥再放人預(yù)冷的20丙酮中再固定35 min，取出略干燥。在清潔的載玻片上滴加20l染液，將蓋玻片上的細(xì)胞樣品反扣其上，放人濕盒內(nèi)，置暗處室溫下染色2025 min。然后用PBS洗3次，無(wú)離子水洗2次，略干燥后甘油PBS封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，用綠光激發(fā)。微絲的觀察甲基羅丹明鬼筆環(huán)肽法4. 實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，長(zhǎng)到+時(shí)取出，用37預(yù)溫的PEMP緩沖液輕輕漂洗細(xì)胞。0.5Triton X-100/PEMP溶液預(yù)溫到37，處理細(xì)胞152min。用PEMP緩沖液洗細(xì)胞2次。用3.7%甲醛PEMD溶液室溫下固定細(xì)胞30 min，PBS洗兩次，用濾紙吸干多余的液體?？构艿鞍卓贵w用

8、0.3% Triton X-100/PBS稀釋成1:4、1:8、1:16等不同濃度，分別滴加約40L在細(xì)胞上，將此長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞的蓋玻片反扣在清潔的載玻片上，放在鋪有濕紗布的鋁盒內(nèi)，密閉，37溫育1 h。微管的觀察取出樣品，放35mm小染色缸內(nèi)，按下列順序洗滌，以除去殘余的抗血清：PBS1%Triton X100/PBSPBS。每次洗5min，可以放在小型振蕩器上輕輕振蕩洗滌。然后取出樣品，用濾紙吸去水分，略干燥。在細(xì)胞面上滴加40 L左右FITC-羊抗兔抗體(用前仍以0.3%Triton X100/PBS稀釋成1:4或1:8)。同步驟5放37溫育1 h。同步驟6洗滌細(xì)胞，無(wú)離子水洗樣品二次。略干燥

9、后，用甘油-PBS(9:1)封片。置熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)光激發(fā)，外加阻斷濾片K530。先用低倍鏡觀察，后轉(zhuǎn)油鏡觀察。微管的觀察考馬斯亮藍(lán)顯示細(xì)胞微絲5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果FITC標(biāo)記的細(xì)胞微管（400） 甲基羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的細(xì)胞微絲（ 1000）6.注意事項(xiàng)各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落。用1%Triton X100 抽提雜蛋白要作預(yù)實(shí)驗(yàn)，抽提時(shí)間長(zhǎng)將破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抽提時(shí)間短背景干擾大。甲基羅丹明鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲，染色時(shí)間勿太長(zhǎng)，否則背景發(fā)紅。在沒(méi)有固定液3.7%甲醛PEMD的情況下，也可以用-20冷甲醇代替，但是效果較差。細(xì)胞充分貼壁鋪展時(shí)應(yīng)力纖維較多，形態(tài)挺直。反之，細(xì)胞收縮變圓，應(yīng)力纖維彎曲，甚至部分解聚消失而顯得稀少。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。7.思考題微絲觀察實(shí)驗(yàn)中，1%Triton X100 處理細(xì)胞的作用是什么?此實(shí)驗(yàn)是否能看到微管、