病毒性疾病防治挑戰(zhàn)與我們的對策

1、病毒性疾病防治挑戰(zhàn)與我們的對策Prevention and treatment of viral diseases Challenge and countermeasure通過前邊講課和討論大家了解到，病毒結構簡單，就是核酸外邊包裹一層蛋白一殼，有些病毒最外還有包膜。但病毒與宿主之間的相互作用過程卻很復雜，可造成宿主的各種類型感染。而且病毒的感染非常普遍，?？梢饎游铩⒅参锖腿祟惖母鞣N疾病，并造成危害。這里主要以人類為例說明：在急性傳染病中，絕大多數(shù)是由病毒引起占 70 802病毒性傳染病發(fā)病率很高：據(jù)估計，每人一生中平均有200 次以上的病毒感染。3很多病毒病危害大，例如漢坦病毒引起的流行性

2、出血熱，在我國每年造成數(shù)千人死亡；乙型腦炎病毒感染后可造成后遺癥；風疹病毒、CMV感染胎兒可造成死胎或先天畸形。japaneseencephalitisvirus-乙型腦炎有意識障礙、癡呆、失語、癱瘓等嚴重后遺癥 sequela ，以致造成終身殘疾。4) some viruses -tumor5 新的病毒病不斷出現(xiàn)：Ebola virus1976 首度於非洲的薩伊北部被發(fā)現(xiàn), 1995年，於薩伊南部再次爆發(fā)大規(guī)模感染 , 剛果共和國以前稱為扎伊爾埃博拉河畔的所有村莊中有430 人死于這一最奇異的方式( Ebola VirusHemorrhagic Fever)HIV 1980sAIDS2002

3、-2003SARSAvian Influenza swine Influenza2021 年 蜱叮咬傳播的新型布尼亞病毒在我國河南等地造成上千人死亡由于病毒性疾病流行廣，危害大， 因此病毒性疾病的預防和治療一直是重要的課題，通過長期的努力取得了很大成功，但仍有很多問題尚未解決。一、治療方面：Aspect oftreatment自從抗生素的創(chuàng)造和廣泛應用以來， 治療細菌性疾病取得了巨大成功， 人們試圖也曾想通過創(chuàng)造抗病毒藥的方法來治療病毒性疾病， 從而有效控制病毒感染。 通過幾十年的努力研制出了一些對病毒性疾病有效的藥物，下面介紹幾種具有里程碑性的抗病毒藥物。第一個抗病毒藥物是在 1962 年一

4、個叫碘苷的藥物， 用於抗皰疹 ?結構與胸腺嘧啶核苷相似， 磷酸化后， 與去氧尿嘧啶核苷酸競爭磷酸化酶和 DNA 多聚酶， 從而抑制病毒DNA的 合成； 對 RNA 病毒無效?還可取代胸腺嘧啶核苷摻入病毒 DNA， 導致錯誤編碼， 干擾 DNA 病毒的復制。?脫氧碘化尿嘧啶核苷?競爭性抑制胸苷酸合成酶，阻止局部用于皰疹型淺層上皮角膜炎DNA合成同年也出現(xiàn)一個金剛烷胺也是抗流感病毒的，它的作用在流感病毒一個叫M2， M2的一個離子蛋白上，它是它的抑制劑，選擇性作用于包膜蛋白M2，阻斷該蛋白的通道功能， 從而抑制病毒的復制過程。即干擾病毒進入細胞，抑制病毒脫殼及核酸的釋放。特異性抑制甲型流感病毒；用

5、于甲型流感的預防1966 年批準上市，是第一個上市的抗流感藥物。1976 年出現(xiàn)了一個， 就是廣譜抗病毒藥物就是干擾素，干擾素在1976 年美國 FDA批準上市。作為一個廣譜抗病毒的藥物1982 年無環(huán)鳥苷是第一個發(fā)現(xiàn)特異性的抗病毒酶的抑制劑。它的毒性很低，可以很有效地抑制皰疹病毒作用機制2- 脫氧鳥苷類似物在感染細胞中經(jīng)病毒的胸苷激酶 TK及宿主細胞的激酶催化，生成阿昔洛韋三磷酸，抑制病毒 DNA多聚酶， 又可摻入病毒正在延長的DNA 中，阻斷病毒DNA合成。艾滋病發(fā)生以后，出現(xiàn)了第一個抗艾滋病的，抗它的逆向轉錄酶的藥物叫AZT齊多夫定， 在 1986 年美國第一次使用了這個藥物，這是第一個

6、抗逆向轉錄酶的抑制劑用於艾滋病人治療。?作用機制AZT 經(jīng)細胞內(nèi) TK和胸苷酸激酶作用而磷酸化為三磷酸鹽，競爭性抑制 HI V 逆轉錄酶， 并摻入到正在合成過程中的單鏈中， 終止病毒 DNA 鏈的延伸作用對 HI V 病毒、哺乳類和鳥類的其它逆轉錄病毒均有抑制作用。 用途聯(lián)合用藥療法治療 HI V 感染的不同病期的患者，善病人的臨床病癥，使病毒轉陰， 生存期延長。如 齊多夫定、拉米夫定和阿波卡韋合用；齊多夫定、拉米夫定和蛋白酶抑制劑合用在 1990 年出現(xiàn)了第一個抗艾滋病的蛋白酶抑制劑叫沙奎拉韋，這個藥在1996 年和其它的抗逆向轉錄酶的藥聯(lián)合使用，就是我們大家知道的雞尾酒療法，有效地控制了艾

7、滋病的病情。在國外，在美國和西方和其它興旺國家控制了艾滋病的母嬰傳播率大大下降，死亡率大大下降， 病程延長， 所以這是一個很有效的工作，這個工作實際上是很出色的。這兩種藥都作用在兩個病毒的特異性的酶上， 所以它對這個病毒有特異性的抑制劑作用，也算是醫(yī)學上的一個范例，把艾滋病控制在一個相當?shù)偷乃?，美國這方面做得很出色。在 1999 年的時候，同時出現(xiàn)了兩個抗流感病毒的藥物，一個叫做扎拉米韋中文名字，還有一個叫奧賽米韋。那這兩個藥物呢，它的作用是作用在神經(jīng)氨酸酶，流感病毒神經(jīng)氨酸酶上頭，這也是一個特異性比擬高的藥物。這是 40 多年來， 抗病毒藥物的主要歷史的進程，從這些藥物研發(fā)的歷史看，在艾滋

8、病發(fā)生以后， 抗病毒藥物的研發(fā)特別地得到重視。所以現(xiàn)在抗艾滋病藥物上市了以后，有十七、 八種已經(jīng)用在臨床。所以這類藥物，實際上把抗病毒藥物的研究推到一個高潮。InfectionAntiviral drugsHerpes simplexVaricella-Zosteracyclovir, valacyclovir萬乃洛韋acyclovir, valacyclovirCytomegaloviirus (CMV)ganclclovir,更昔洛韋 , 丙氧鳥苷 foscarnet膦甲酸鈉AIDSZidovudine,齊多夫定lamivudine (3TC), protease inhibitors;

9、incombination無環(huán)苷類藥物主要有阿昔洛韋、更昔洛韋干擾素的發(fā)現(xiàn):1957 年，英國病毒生物學家Alick Isaacs和瑞士研究人員JeanLindenmann ，在利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感干擾現(xiàn)象時了解到，病毒感染的細胞能產(chǎn)生一種因子，后者作用于其他細胞，干擾病毒的復制，故將其命名為干擾素。1966 1971 年，F(xiàn)riedman 發(fā)現(xiàn)了干擾素的抗病毒機制，引起了人們對干擾素抗病毒作用的關注，而后，干擾素的免疫調(diào)控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗腫瘤作用逐漸被人們認識科學家發(fā)現(xiàn)干擾素。干擾素是一種人體內(nèi)自然產(chǎn)生的抵抗細菌和病毒的物質(zhì)，是機體對病毒感染的重要防御系統(tǒng)，它與人體其他免

10、疫系統(tǒng)一起，共同擔負著抵御病毒感染的任務。干擾素可通過加強人體自然殺傷細胞的活性，刺激巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，增強人體的細胞免疫功能，殺死病毒；還可以誘導細胞內(nèi)產(chǎn)生抗病毒蛋白，抑制病毒的制。但為什么每年還有許多人死于病毒性疾病呢？因為有些病毒，如艾滋病病毒、乙肝病毒和 丙肝 病毒等，可以破壞人體天然干擾素，擊毀人體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)。因此， 單單指望人體自身產(chǎn)生的天然干擾素，并不能控制有些病毒所造成的感染和疾病。1976 年 Greenberg 等首先報道用人白細胞干擾素治療4 例慢性活動性乙肝，治療后有 2 例 HBeAg消失。但是由于人白細胞干擾素原材料來源有限，價格昂貴，因此未能大量應用于臨床

11、。發(fā)現(xiàn)干擾素后近 30 年的時間里，人們只能從大量人血液中提取微量干擾素，本錢非常高，那時人們不可能用干擾素治療疾病。直到 1986 年，人們采用基因工程的方法( 用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內(nèi)獲得了干擾素)Gene Engineering-IFNE.coliyeast，才實現(xiàn)了干擾素的大批量生產(chǎn)。自1991 年起，干擾素開始用于乙型和丙型肝炎的治療，并取得了較好效果。長效干擾素half-life干擾素是治療慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首選治療，可以有效地抑制或去除病毒，療效持久，阻止肝硬化或肝癌的發(fā)生。但普通干擾素治療具有自身不可克服的缺點，半衰期短，只有4 個小時，就是說如果今天注

12、射了干擾素，第二天體內(nèi)的干擾素就完全去除了。所以，干擾素不得不每隔一天就注射一次，使用很不方便。另一方面，當體內(nèi)的干擾素去除后，體內(nèi)的病毒又重新復制，不能持久地抑制病毒。為了克服普通干擾素的缺點，1990 年初，美國著名的干擾素研究機構，先靈葆雅公司研究所SPRI開始進行長效干擾素-2b 的研發(fā)。目的是改善普通干擾素-2b 半衰期短的特性。普通過干擾素半衰期短的原因，一是大量干擾素由于分子太小，通過腎臟 “漏了出去， 通過尿液排出體外，另一個原因是被免疫系統(tǒng)去除。聚乙二醇是一種惰性、易溶于水、可以做成任意大小的物質(zhì)，普通干擾素經(jīng)過它的“改造后，分子就會變大，不能或很少由腎臟“漏出，到達了延長在

13、體內(nèi)存在時間的目的。普通干擾素-2b 的半衰期只有4 個小時，而經(jīng)過聚乙二醇化的干擾素-2b 的半衰期達40 個小時，所以，聚乙二醇干擾素又叫長效干擾素。聚乙二醇化后，干擾素與受體的結合可能受到影響，使它的活性下降，而這種影響的大小取決于聚乙二醇分子的大小，聚乙二醇的分子越大，影響就越大。經(jīng)過多年反復的研究，最終確定12KD 分子大小的聚乙二醇是最理想的，它在延長半衰期的同時，對干擾素活性的影響最小，既保證了一周一次給藥，又最大程度地保存其抗病毒活性，這種新型的干擾素換代產(chǎn)品就是長效干擾素-2b 。新型的干擾素長效干擾素-2b 的半衰期為40 個小時， 可以在體內(nèi)持續(xù)作用168 小時， 剛好滿

14、足一周一次給藥。長效干擾素-2b 保存了 30%的腎臟去除率，這樣，當干擾素治療期間發(fā)生嚴重不良反響時，撤藥快速，便于對干擾素不易耐受的病人調(diào)整劑量，大大提高了長效干擾素治療的平安性?？共《舅幈仨殞毎麅?nèi)病毒具有高度選擇性，而對宿主細胞無明顯毒害，才能真正具有臨床實用價值。近年來已研制出有選擇性作用、而對人體低毒或無毒的藥物?？共《舅幬锖芏?， 除介紹的病毒靈、阿昔洛維外，還有皰疹凈、金剛胺、穿心蓮、板藍根等。病毒對抗菌素不敏感，因此，病毒感染性疾病不要濫用抗菌素抗病毒藥物研制和使用存在的問題現(xiàn)在所有這些抗病毒藥不能去除、根治病毒，只能抑制病毒病毒生長受到抑制。和抗菌素的開展相比，抗病毒藥物開展

15、得很緩慢。其原因在于 1病毒是細胞內(nèi)寄生物它在細胞里生活，它跟細胞同樣在生活，所以你很難找到一個藥物把這個病毒殺死，而不把它這個細胞殺死，這是一個很主要的原因。Integrationinto hostcellDNA病毒藥還有很多的困難，一個就是說病毒要整合，有些病毒是整合到細胞里去，所以它很難，現(xiàn)在還沒有藥物能夠把整合的病毒拿出來。還有一種就是病毒它在靜息期細胞，就是在 G0細胞里生長 , 所以這種細胞呢,Grow slowly in G0 cellstate 它里邊藥物濃度很低，所以病毒被保護了還有就是病毒會發(fā)生變異，drug resistancemutations病毒在變異的時候產(chǎn)生耐藥性

16、,包括抗原漂移和抗原轉變，如果這個變異很小的話，一個點或者兩個點的變異，它可能給我們帶來的影響就是對藥物產(chǎn)生耐藥thelackof relevantanimal 、cell models另外一個原因呢就是很多病毒都沒有模型動物模型甚至是適宜的體外細胞模型。toxicity testdifficultpharmacodynamicsobstructdrugsresearchanddevelopment二、預防方面Aspect of prevention天花曾經(jīng)是對人類危害極大的傳染病，死亡率高，而且留有后遺癥。由天花病毒引起，天花病毒屬 痘病毒 科，Poxviridae 病毒中最大的一類 ，病毒

17、粒呈磚形或橢圓形， 大小 300 450納米 170 260納米，天花是一種烈性傳染病感染，無藥可治，病死率為 20-40%，患者在痊愈后臉上會留有麻子， “天花由此得名。痘病毒 Poxviuses 痘病毒 科，學名Poxviridae 病毒粒最大的一類DNA病毒 病毒粒呈磚形或橢圓形，大小300 450納米 170260納米我國古代接種人痘的方法有四種：痘衣法：把 天花病人的衣服或涂有天花膿皰漿的衣服給小兒穿。痘漿法：用棉花蘸天花膿皰液塞入兒童鼻孔。旱苗法：先將天花痂皮陰干研細，而后用銀管吹入鼻孔。水苗法：將天花痂皮研細用水調(diào)濕，以棉花蘸染塞入鼻孔。人痘接種：實際上是人為地選擇毒性小的天花病

18、毒在人體內(nèi)造成一次輕型天花感染，因此難免有一定危險。接種后輕那么留下大塊疤痕，重那么會導致死亡，有的還可能成為新的傳染源。18 世紀英國鄉(xiāng)村醫(yī)生琴納也發(fā)現(xiàn)接觸牛痘病牛的擠牛奶女工不會患“天花，于是他改良了接種方法并取得了人體試驗的成功。由此開始，疫苗學vaccinologywas born誕生了。Edward Jenner developed a smallpox vaccine in 179619世紀巴斯德研制出了狂犬病毒的疫苗狂犬病由狂犬病病毒引起 ， 主要通過病犬咬傷傳播，人被咬傷后發(fā)病率約50%，發(fā)病后死亡率近100%巴斯德并不知道狂犬病是一種病毒 病，但從科學實踐中他知道有侵染性的物

19、質(zhì)經(jīng)過反復傳代和枯燥，會減少其毒性。他將含有病原的狂犬病的延髓提取液屢次注射兔子后，再將這些減毒的液體注射狗，以后狗就能抵抗正常強度的狂犬病毒的侵染。1885 年人們把一個被瘋狗咬得很厲害的9歲男孩Joseph Meister送到巴斯德那里請求搶救， 巴斯德猶豫了一會后，就給這個孩子注射了毒性減到很低的上述提取液，然后再逐漸用毒性較強的提取液注射。巴斯德的想法是希望在狂犬病的潛伏期過去之前，使他產(chǎn)生抵抗力。結果巴斯德成功了，孩子得救了( 巴斯德研究所的看門人) 。Edward Jenner developed a smallpox vaccine in 1796. 1885: Louis Pa

20、steur rabies vaccine animal vaccines近代modern timesthe present day現(xiàn)代1954: Jonas Salk develops a killed polio virus 1961: Alfred Sabin develops an oral polio vaccine史上最著名的一位脊髓灰質(zhì)炎 病人莫過于富蘭克林羅斯福。1921年的夏天，他在一次游泳之后染上了脊髓灰質(zhì)炎，最終造成了下肢癱瘓。1938年羅斯福建立了小兒麻痹癥全國基金會，用于救治脊髓灰質(zhì)炎患者，并促進疫苗的研制。在基金會的扶持下，Jonas Salk醫(yī)生用了近 9年的時間，

21、于 1953年成功研制出第一個成功的脊髓灰質(zhì)炎疫苗，這是繼天花疫苗、 白喉 疫苗和 流感疫苗 后，疫苗研究的又一次重大突破。這種疫苗是一種滅活疫苗IPV，即把病毒殺死后制備成注射使用的疫苗。Jonas Salk也在自己、妻子和孩子身上進行了接種實驗，結果他們體內(nèi)出現(xiàn)了相應的抗體，并且沒有患上脊髓灰質(zhì)炎。這種疫苗保護兒童免受脊髓灰質(zhì)炎侵害的有效率在80%到 90%左右。隨后的很長的一段時間，這種疫苗成為了對脊髓灰質(zhì)炎標準的預防手段。IPV疫苗效果很好，但還不是足夠好，它還不能有效阻斷病毒的傳播。在20世紀 50年代，辛辛那提大學的Albert Sabin同樣也在小兒麻痹癥全國基金會的支持下進行疫

22、苗的研究。與IPV不同， Albert Sabin把脊髓灰質(zhì)炎病毒在猴子的腎臟細胞、Vero細胞及人二倍體成纖維細胞中一代又一代的培養(yǎng)，直到篩選出致病力較弱的毒株。得到的疫苗稱為口服減毒脊髓灰質(zhì)炎疫苗OPV。這種疫苗取得了巨大成功，Albert Sabin的研究小組也因此獲得了1965 年諾貝爾 醫(yī)學獎。1954 年，JohnEnders，ThomasWeller 和 FrederickRobbins被授與諾貝爾生理學或醫(yī)學獎， 以表彰他們發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒能在各種組織培養(yǎng)中增殖。這一發(fā)現(xiàn)首次為生產(chǎn)滅活和活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗提供了時機。通過調(diào)查過去密封的諾貝爾委員會檔案文件，我們回憶了那些獲獎的

23、審議?？磥鞸venGard一位 Karolins ka 學會病毒研究的教授，當時是諾貝爾委員會的會員在那次獲獎評審中起了舉足輕重的作用。 Gard 說服該機構的教師學會不遵循諾貝爾委員會把諾貝爾獎授予 VincentduVigneaud的推薦。1954 年諾貝爾獎的另一個特點是Weller和 Robbins 的獲獎僅僅根據(jù)那一年第一次提交的提名。 Gard在他的諾貝爾獎授獎儀式講話中提到那項發(fā)現(xiàn)對今后生產(chǎn)疫苗的重要作用， 但更強調(diào)了培養(yǎng)許多醫(yī)學上重要的各種病毒的含意。我們只能推測為什么后來提名的科學家如JonasSalk ，HilaryKoprowski，AlbertSabin 在創(chuàng)造脊髓灰質(zhì)

24、炎菌苗的過程中有輝煌的奉獻沒有獲得諾貝爾獎金。20世紀 30年-80 代隨著病毒體外細胞培養(yǎng)的開展，相繼出現(xiàn)了滅活疫苗和減毒活疫苗，進入了疫苗的多產(chǎn)時期，不少病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻疹病毒等疫苗紛紛問世，有效的 控制了一些病毒病的發(fā)病率，1980 年5月 28日WHO宣布全球消滅天花病毒；脊髓灰質(zhì)炎、麻疹病毒也有消滅的希望， 2000年10月29日在西太平洋地區(qū)已經(jīng)消滅了脊髓灰質(zhì)炎病例，同時風疹1969年風疹疫苗問世 、腮腺炎 1966年，流行性 腮腺炎疫苗問世、1963年麻疹 狂犬病的發(fā)病也下降到極低水平。Vaccines - Problems但是對很多病毒，疫苗的研制仍存在諸多問題有些病毒

25、柯薩奇、?？刹《?，腺病毒型別多，各型間無交叉免疫, 使疫苗研制使用難于操作有些病毒外表抗原容易發(fā)生變異流感病毒、輪狀病毒即抗原漂移點突變和抗原轉變 大片段的改變 有些病毒的核酸可整合到細胞的染色體上乙型肝炎病毒、HIV等有些病毒的潛伏感染這種潛伏狀態(tài)的病毒半衰期極長，可達幾十年。潛伏感染的細胞膜上沒有病毒蛋白表達，免疫系統(tǒng)很難識別HBV , HIV 新現(xiàn)病毒感染SARS有些缺少適宜的動物模型使實驗研究困難(HIV)? ? Transmission from cell to cell via syncytia?Recombination of the virulent strain or of

26、the vaccine virusNew Treatment Strategies新的治療策略：RNAi 技 術 ribozyme technique 核酶Ribozyme 是 80 年代初期發(fā)現(xiàn)的具有催化功能的RNA分子。它具有高度專一內(nèi)切核酸酶的活性。經(jīng)過科學家十多年的研究，核酶已被開展成為一項新型技術并廣泛應用動植物抗病， 人類疾病防治等領域的研究，顯示出了廣闊的應用前景。由于核酶具有專一的核酸內(nèi)切酶活性及解離后重復切割相同靶分子的能力，核酶很快就被用來抑制病毒繁殖。最近幾年， HIV-1 序列常被用作核酶攻擊的靶序列來研究，研究頻率要遠遠超過其他病毒，因此， 這就使得HIV-1 成為了

27、抗病毒核酶研究中一個典型的研究例子， 至今為止， 幾乎所有HIV-1 的功能片斷都用核酶切割過，包括編碼區(qū)的基因片斷和非編碼區(qū)的信號序列以及5和 3長末端重復區(qū)long terminal repeat。除了 HIV 外，核酶還用于其它病毒的研究如B 型肝炎病毒的活性、C 型肝炎病毒、免疫缺陷病毒、 T 細胞白血病病毒、B 病毒等。因此，核酶在病毒基因工程中的作用將不可限量，很可能帶來戰(zhàn)勝艾滋病的福音。聯(lián)合用藥 drug combination therapy藥物的靶向制劑的研究開發(fā)：open up and develop TargetedDrug System針對這一問題， 近年來開展了上述藥

28、物的肝靶向制劑的研究。所謂靶向制劑(Targeted Drug System) ，是通過應用一定的生物、化學和物理技術，將治療藥物和靶向載體交聯(lián)制備而成。 機體給藥后靶向制劑能特異性地將治療藥物運送到靶器官或靶細胞，到達高效治療的目的。經(jīng)初步研究顯示，抗病毒藥物的肝靶向制劑具有特異性好、選擇性強、能減少藥物用量和給藥次數(shù)，以及降低毒副作用和提高藥物療效等優(yōu)點，靶向治療有可 1.2 能成為肝炎治療中最有效的方法之一。無唾液酸糖蛋白受體只存在于哺乳動物的肝細胞上，能專一識別并內(nèi)吞半乳糖基的糖蛋白，使其進入肝細胞內(nèi)，因此半乳糖基可作為肝靶向作用的導向基團galactosyed-ACV半乳糖化 無環(huán)鳥

29、苷： ACV是一種新的核苷類抗病毒藥，臨床用于治療 HB，但由于肝藥濃度不高，不能大量進入肝細胞內(nèi)，抑制病毒增殖效果并不理想，且對腎小管有損害作用，以半乳糖基擬糖白蛋白NGA為載體，將ACV與NGA 藕聯(lián)，制備成受體介導肝靶向抗病毒藥，可到達提高肝藥濃度，增強療效( drug effect)， 減少side effect的目的新型疫苗的研制Live Recombinant Vaccinegenetic engineering vaccine一、基因工程疫苗基因工程重組亞單位疫苗是用DNA重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原的基因?qū)朐?prokaryoticcell或真核 Eukaryoti

30、c細胞， 使其在受體細胞中高效表達，分泌保護性抗原蛋白。 提取保護性抗原蛋白， 參加適宜佐劑即制成基因工程重組亞單位疫苗。本疫苗系用基因工程技術將乙型肝炎外表抗原基因片段重組到中國倉鼠卵巢細胞(CHO)內(nèi)，通過對細胞的培養(yǎng)增殖，增殖分泌乙肝外表抗原(H Ag) 于培養(yǎng)液中，經(jīng)純化加佐該類疫苗的優(yōu)點是：(1) 疫苗中只含有產(chǎn)生保護性免疫應答所必需的免疫原成分，不含傳染性材料，平安性好。(2) 疫苗中減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以防止的熱原、變應原、免疫抑制原和其他有害的反響原，副作用小。(3) 穩(wěn)定性好，便于保存和運輸。(4) 可用于外來病原體和不能培養(yǎng)的病原體，擴大了用疫苗控制疫病的范圍。

31、(5) 產(chǎn)生的免疫應答可以與感染產(chǎn)生的免疫應答相區(qū)別，因此更適合于疫病的控制和消滅方 案。其缺點是：(1) 價格昂貴，雖然產(chǎn)品生產(chǎn)本身的費用不一定高，但產(chǎn)品研究和開發(fā)的費用通常都較高。(2) 免疫原性通常比復制性完整病原體差，需要屢次免疫才能得到有效保護。目前， 人類的乙型肝炎基因工程亞單位疫苗已被廣泛應用。獸用口蹄疫基因工程亞單位疫苗、預防仔豬 和犢牛下痢的大腸桿菌菌毛基因工程重組亞單位疫苗已發(fā)揮一定作用。炭疽保護性抗原(PA) 、致死因子 (LF) 和水腫因子 (EF)優(yōu)點是，平安性好，副作用小，穩(wěn)定性好，便于保存和運輸，擴大了用疫苗控制疫病的范圍。價格昂貴， (2) 免疫原性通常比復制性

32、完整病原體差，需要屢次免疫才能得到有效保護。二、重組活載體疫苗重組活載體疫苗是用基因工程技術將病毒或細菌( 常為疫苗弱毒株) 構建成一個載體( 或稱外源基因攜帶者) ，把外源基因 ( 包括重組多肽、 肽鏈抗原位點等) 插入其中使之表達的活疫苗。 該類疫苗免疫宿主后，在體內(nèi)增殖， 并將蛋白抗原的編碼基因表達成相應的蛋白質(zhì)，可誘導產(chǎn)生的免疫比擬廣泛，包括體液免疫和細胞免疫，甚至黏膜免疫。如果載體中同時插入多個外源基因， 就可以到達一針防多病的目的。 簡言之， 病毒活載體疫苗兼有常規(guī)活疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點。 它具有活疫苗的免疫效力高、 本錢低及滅活疫苗的平安性好等優(yōu)點。 是當今與未來疫苗研制與開發(fā)的

33、主要方向之一。 國外已研制出以腺病毒為載體的乙肝疫苗、 以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。 當然， 這類疫苗有時因機體對活載體的免疫反響性質(zhì)，可限制再次免疫的效果。目前，主要的病毒活載體有牛痘病毒、 禽痘病毒、 金絲雀痘病毒、 人2型和 5型腺病毒、火雞皰疹病毒、偽狂犬病病毒、水痘帶狀皰疹病毒、微?簡言之， 病毒活載體疫苗兼有常規(guī)活疫苗和滅活疫苗的優(yōu)點。它具有活疫苗的免疫效力高、本錢低及滅活疫苗的平安性好等優(yōu)點。是當今與未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一。國外已研制出以腺病毒為載體的乙肝疫苗、以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。當然， 這類疫苗有時因機體對活載體的免疫反響性質(zhì)，可限制再次免疫的效果。目

34、前，主要的病毒活載體有牛痘病毒、人 2 型和 5 型腺病毒等轉基因植物疫苗Transgenic plant用轉基因方法，將編碼有效免疫原的基因?qū)肟墒秤弥参锛毎幕蚪M中，免疫原即可在植物的可食用局部穩(wěn)定的表達和積累， 人類和動物通過攝食到達免疫接種的目的。常用的植物有蕃茄、 馬鈴薯、香蕉等。農(nóng)桿菌介導的核轉化，將攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染植物細胞后，導人的外源基因通過同源重組整合到細胞染色體上，含整合外源基因染色體的植物細胞在一定條件下長成 新的植株，此植株在生長過程中表達外源基因并將這種性狀傳給子代；1 DNA 疫苗簡介DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質(zhì)

35、粒DNA(有時也可是RNA)，它可經(jīng)一定途徑進入動物體內(nèi)，被宿主細胞攝取后轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產(chǎn)生非特異性和特異性2 種免疫應答反響，從而起到免疫保護作用。系指將靶 抗原編碼基因 置于 真核表達 調(diào)控元件的調(diào)控下，將該質(zhì)粒DNA直接進行動物體內(nèi)接種，并以與自然感染 類似的方式呈遞抗原，誘生特異性體液和細胞免疫應答的新理論和技術。DNA疫苗具有許多優(yōu)點：DNA接種載體 ( 如質(zhì)粒 ) 的結構簡單，提純質(zhì)粒DNA的工藝簡便，因而生產(chǎn)本 錢較低，且適于大批量生產(chǎn)；DNA分子克隆比擬容易，使得DNA疫苗能根據(jù)需要隨時進行更新；DNA分子很穩(wěn)定，可制成 DNA疫苗凍干苗，使用時

36、在鹽溶液中可恢復原有活性，因而便于運輸和保存；比傳統(tǒng)疫苗平安，雖然 DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當?shù)拿庖咴?，能激活細胞毒性T淋巴細胞而誘導細胞免疫，但由于DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，根本沒有毒性逆轉的可能，因此不存在減毒疫苗毒力上升的危險(Davis 等， 1999) ，而且由于機體免疫系統(tǒng)中DNA疫苗的抗原相關表位比擬穩(wěn)定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現(xiàn)表位喪失(Donnelly等， 1999) ；質(zhì)粒本身可作為佐劑，因此使用DNA疫苗不用加佐劑，既降低本錢又方便使用(Babiuk 等， 1999) ；將多種質(zhì)粒DNA簡單混合，就可將生化特性類似的 抗原(

37、如來源于相同病原菌的不同菌株) 或1種病原體的多種不同抗原結合在一起，組成多價疫苗，從而使1種DNA疫苗能夠誘導產(chǎn)生針對多個抗原表位的免疫保護作用，使DNA疫苗生產(chǎn)的靈活性大大增加。1 DNA疫苗簡介DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關的真核表達質(zhì)粒DNA(有時也可是RNA)， 它可經(jīng)一定途徑進入動物體內(nèi)，被宿主細胞攝取后轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產(chǎn)生非特異性和特異性 2 種免疫應答反響，從而起到免疫保護作用。DNA疫苗免疫機制DNA疫苗常用于表皮，肌肉和靜脈接種DNA，均可產(chǎn)生保護性免疫應答。皮膚接種常用于表皮或皮下接種方式。皮膚及黏膜組織大多首先

38、與外來抗原接觸。在皮膚相關的淋巴組織中含有多種促進免疫應答的專一細胞。 其中角質(zhì)細胞為主要表達細胞。 它可產(chǎn)生 IL-1,TNF-a ，可激活表皮中的 APC如樹突狀細胞， 巨噬細胞，朗罕細胞 ，將攝取和加工處理的抗原轉運到淋巴結。 這些細胞除可直接攝取和表達質(zhì)粒 DNA外，還可攝取， 表達由死細胞釋放的外源 DNA。在外源基因啟動子作用下，使外源基因表達，產(chǎn)物在細胞內(nèi)水解酶的作用下分解成長短不一的多肽。其中一局部轉移至內(nèi)侄內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 腔內(nèi)，與新組裝的 MHC-I類分子結合形成抗原肽： MHC-I類分子復合物，逼供內(nèi)提呈給 CD8+T細胞，誘發(fā)特異性細胞殺傷效應。 另一局部轉移到溶酶體和

39、內(nèi)體， 經(jīng)加工處理降解為多肽， 與 MHC-II 類分子形成抗原肽： MHC-II 類分子復合物，將抗原提呈給 CD4+T細胞，活化的 Th1 型 CD4+T細胞分泌細胞因子，并使巨噬細胞活化，活化的巨噬細胞能吞噬胞內(nèi)寄生病原生物，如結核桿菌，麻風桿菌等，也能吞噬所中胞外細菌?；罨?Th2 型 CD4+T細胞分泌 IL-4,IL-5,IL-6,IL-10, 與 B 細胞增殖，成熟，促進抗體生成有關，可增強 抗體介導的免疫應答。骨骼肌細胞是目前所知攝取外源DNA效率最高的組織。但無MHC-II 類分子，只表達較少的MHC-I類分子，缺乏共刺激分子 B7 的專職 APC，但非專職 APC也可有效

40、地將抗原提呈給T 細胞。由 T 細胞接受肌肉細胞表達的抗原肽：MHC-I類分子復合物的第一信號，同時接受炎癥反響吸引的來自血液免疫細胞所帶的共刺激信號而活化。提示抗原提呈與共刺激新并不是要由同一細胞提供，此外，肌肉細胞表達的抗原可通過某些途徑轉移到專職APC 內(nèi)，由專職 APC將抗原加工處理后，提呈給CD4+T細胞,CD8+T細胞，誘導出細胞免疫和體液免疫。盡管肌細胞本身缺乏以誘導CTL, 但肌細胞通過表達多種細胞因子，當表達IFN-a,TNF-a 時可誘導 MHC-I,MHC-II 類分子 ICAM-1/CD54, LFA-1,LFA-2,LFA-3 的表達，由此可誘導產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫

41、。DNA疫苗的注射途徑l直接肌肉注射注射的 DNA在肌肉細胞中以環(huán)型分子存在，不能復制，并不能整合到宿主細胞染色體中。肌肉細胞中特有的橫管系統(tǒng)與細胞外空間有直接交通， 因而可能介導質(zhì)粒DNA的內(nèi)吞作用。 而且橫紋肌中溶酶體和DNA酶的含量較低， 可能也是質(zhì)粒 DNA能在細胞中存在較長時間的原因。l微離子轟擊介導的 DNA免疫即基因槍。 其技術依據(jù)是亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將包裹有金粉或鎢粉的DNA 質(zhì)粒，借助高能電場以極快的速度轟擊動物表皮組織，能獲得滿意的免疫效果。影響 DNA疫苗免疫效果的主要因素接種方式Leitner等將編碼瘧原蟲環(huán)子孢子抗原的質(zhì)粒通過肌注途徑和基因槍介導的表皮途徑免疫BALB/C小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，基因槍皮內(nèi)接種比肌肉內(nèi)直接注射的免疫效果要好。免疫效果前者比后者高600-6000 倍，且所用 DNA劑量也減少。由肌肉注射的 100-200ugDNA疫苗減至用 0.04-0.4ug純化的 DNAS。接種途徑Fynan 等發(fā)現(xiàn)骨骼肌注射接種免疫效果最正確。真皮，表皮，靜脈注射效果較好。腹腔內(nèi)注射效果較差。接種部位的預處理Davis 等對小鼠免疫前肌肉注射100ul 10mmol/L 心肌毒素，然后接種HbsDNA疫苗，結果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗Hbs抗體水平比對照組高 10 倍以上。另有實驗說明，在注射部位用25%高滲蔗糖進行預處理