XXXX0809-膠體金快速免疫診斷技術(shù)

1、Colloidal Gold Lateral-Flow Diagnostic Technology膠體金免疫層析快速診斷技術(shù)-1快速檢測(cè)快速檢測(cè)是一種廉價(jià)的、一次性的、基于膜的檢測(cè)方法，它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據(jù)。這種檢測(cè)可以以獨(dú)立的試紙條，也可以以裝在塑料盒 中的形式進(jìn)行?？偟膩碚f，做此項(xiàng)檢測(cè)至少需要200ul 的液體標(biāo)本，可在2至5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢測(cè)中，樣品可能有尿、血液、血清、唾液或其他體液。在非臨床檢測(cè)中，樣本可能是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液， 它們同樣可以直接應(yīng)用膜試紙條檢測(cè)。這種檢測(cè)方法無需儀 器操作，可應(yīng)用于臨床、實(shí)驗(yàn)室、室外或者家庭通常為無操作經(jīng)驗(yàn)

2、人員使用。 2快速膜檢測(cè)需求廣泛，可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域（見下表）。隨著靈敏度和特異性 的提升，大量的潛在應(yīng)用可能是作為替代昂貴儀器檢測(cè)方法的低成本選擇。 34為何使用金標(biāo)記早期的快速檢測(cè)使用有色膠乳形成可視信號(hào)，目前的某些檢測(cè)仍使用此手 段。 過去和現(xiàn)在，乳膠法一直是凝集反應(yīng)主要的標(biāo)記方法，這是因?yàn)樗诮Y(jié)合 成分的存在下易于凝集。對(duì)于快速檢測(cè)而言，交聯(lián)物的穩(wěn)定性是避免假陽(yáng)性的關(guān) 鍵，而易于凝集可能就是其產(chǎn)生假陽(yáng)性的主要問題。 因?yàn)榫哂懈玫臐撛诜€(wěn)定性，20 世紀(jì) 80 年代末，金標(biāo)記被引入膜快速檢測(cè) 中。在適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)條件下，任何被精確大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來。 不同的大小可用于不同的用途

3、。其優(yōu)良的穩(wěn)定性、敏感性、精確性及可重復(fù)生產(chǎn) 性等特點(diǎn)使得金適合于在快速檢測(cè)中的應(yīng)用。金本性屬惰性元素，被適當(dāng)加工可 形成完整的球形顆粒。當(dāng)正確連接時(shí)，蛋白質(zhì)能牢固地結(jié)合在金顆粒表面，無論 是液態(tài)或固態(tài)都能保持長(zhǎng)久的穩(wěn)定性。而且，若是在制造過程中蛋白被精確固定， 其與金交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零。 5膠體金技術(shù)起源及現(xiàn)狀6起源1971年,Faulk 和Taytor引入7原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀

4、態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。8現(xiàn)狀層析法(Lateral-Flow)滲濾法(Through)免疫金銀染色法膠體金的作用: 指示劑9與常規(guī)診斷方法相比 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)快速：全部檢測(cè)過程僅需 3-10分鐘。簡(jiǎn)便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡(jiǎn)單

5、，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時(shí)隨地進(jìn)行。廉價(jià)：?jiǎn)蝹€(gè)測(cè)試條成本極低可單份檢測(cè)：對(duì)標(biāo)本既能成批檢測(cè)，又可單份檢測(cè)，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。穩(wěn)定性好：金標(biāo)試劑穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。檢測(cè)標(biāo)本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題10技術(shù)應(yīng)用類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測(cè)的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級(jí)醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染?。ㄒ腋挝屙?xiàng),HIV, SARS等）標(biāo)志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站, 商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染病

6、（禽流感,獸瘟疫等）病毒（煙草花葉病毒、犬細(xì)小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測(cè)部門,研究機(jī)構(gòu)有害物質(zhì)超標(biāo)食品安全食品安全檢測(cè)中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素11膠體金層析法一個(gè)快速檢測(cè)的底層一般是硝酸纖維素膜，在它上面固 定了檢測(cè)蛋白，通常是抗體或抗原。 連接著膜的是包含有干燥金標(biāo)的金標(biāo)墊（通常是玻璃 纖維）。對(duì)于目前大多數(shù)可做的檢測(cè)項(xiàng)目，這種結(jié)合墊含有吸附了針對(duì)待檢分析 品的特異性抗體或抗原的 金粒子。樣品墊通常為紙 質(zhì)，附著著結(jié)合墊。當(dāng)使用 樣品墊時(shí)，液體樣品通過 毛 細(xì)擴(kuò)散作用穿移過結(jié)合 墊，再水化金交聯(lián)物，使待 分析樣品與交聯(lián)物相互作 用。然后金交聯(lián)物與待分析 樣

7、品復(fù)合物轉(zhuǎn)移至膜條帶上再移向蛋白結(jié)合物，復(fù)合物在此處被固定后以一條細(xì) 細(xì)的紅線的形式產(chǎn)生明顯的信號(hào)。第二條線是控制線，由余下的金交聯(lián)物形成于 膜上，表明測(cè)試完成。 12試紙條組成結(jié)構(gòu)測(cè)試線 （T線）控制線（C線）膠體金墊吸水濾紙樣品墊NC膜（硝酸纖維素膜）層析方向PVC底板13層析法技術(shù)優(yōu)勢(shì):簡(jiǎn)單現(xiàn)場(chǎng)快速1.打開包裝取出試紙條2.直接插入待測(cè)樣品中3. 目測(cè)讀出結(jié)果（3-10分鐘內(nèi)）14免疫層析法檢測(cè)原理分類介紹（雙抗體夾心）（以HCG檢測(cè)為例）15免疫層析法檢測(cè)原理分類介紹（競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)）（以嗎啡檢測(cè)為例）16免疫層析法檢測(cè)原理分類介紹（應(yīng)用proteinA金標(biāo)）（以HIV檢測(cè)為例）17膠體金滲

8、濾法將蛋白質(zhì)抗原直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，在硝酸纖維膜下墊有吸水性強(qiáng)的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原（抗體）后，迅速加抗體（抗原），再加金標(biāo)記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應(yīng)很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反應(yīng)。此方法已成功地應(yīng)用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測(cè)。18膠體金銀染色法膠體金銀染色法（DotIGSIGSS）是將斑點(diǎn)ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應(yīng)后，再滴加膠體金標(biāo)記的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體反應(yīng)處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)，此稱為斑點(diǎn)免疫金染色法（DotIGS）。此反應(yīng)可通過銀顯影液增強(qiáng)，即

9、斑點(diǎn)金銀染色法（DotIGSIGSS）。19膠體金免疫層析系統(tǒng)技術(shù)路線20技術(shù)路線膠體金制備技術(shù)標(biāo)記技術(shù)NC膜與溶液噴點(diǎn)膠體金墊與溶液噴點(diǎn)樣品墊吸水紙粘性底板干燥方法溶液體系分析裝配切條包裝21膠體金的制備22制備原理所有的生產(chǎn)方法 都是使用還原劑提供電子給溶 液中帶正電荷的金離子而產(chǎn)生 金原子，如下所示： 氯金酸還原劑膠體金 HAuCl4 + e = Au0 通常使用的還原劑包括檸 檬酸鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰 酸鈉。2324根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1500nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形

10、成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。25以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對(duì)一致、直徑316nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進(jìn)行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時(shí)在溶液中添加0.10.2的H2O2能夠去除這些殘基。雙標(biāo)記或制備5-10 nm的膠體金時(shí)建議使用該方法。利

11、用檸檬酸為還原劑，可以制備12150 nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時(shí)，膠體金粒子的誤差也同時(shí)增加。因此做單標(biāo)記時(shí)，建議使用該方法制備12-16 nm直徑的膠體金。除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進(jìn)一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。26白磷還原法制備5 nm膠體金取250 ml三角瓶一個(gè)，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3將溶液調(diào)至中性（pH7.0）。取0.2 ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5 ml試管中，再加0.8 ml乙醚，混勻。取0.7 m

12、l加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請(qǐng)帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進(jìn)行中和)。室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻。27單寧酸/檸檬酸鈉法制備316 nm膠體金取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1氯化金，預(yù)熱至6070。取一50 ml燒杯，加入4 ml 1檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25 mM K2CO3。預(yù)熱至6070。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5 ml時(shí)，對(duì)pH的影響不大，K2CO3可以省略。將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。

13、檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）4500034200044500641208470104101628檸檬酸三鈉法制備12-30 nm膠體金(Frens, 1973)取250 ml三角瓶一個(gè)，加100 ml雙蒸水及1 ml 1%氯化金，加熱沸騰；取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中。混勻，再保持沸騰30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時(shí)，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時(shí)，則顏色偏向紫色。檸檬酸鈉(ml)膠體金(nm)5124163242.83029制備高質(zhì)量膠體金的注意事項(xiàng)（1）玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理（1雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時(shí)，烘干）的玻璃器皿，

14、或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預(yù)期大小的金顆粒。（2）試劑配制必須保持嚴(yán)格的純凈，所有試劑都必須使用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜（0.45m）過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質(zhì)。（3）配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。（4）氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進(jìn)口的。（5）氯金酸配成1水溶液在4可保持?jǐn)?shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時(shí)，最好將整個(gè)小包裝一次性溶解，暫時(shí)不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20）。30由于使

15、用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。膠體金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個(gè)月。但決不可保存在0以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。31蛋白-金復(fù)合體的制備32必須了解蛋白與膠體金持久結(jié)合的物理及化學(xué)進(jìn)程，僅僅把交聯(lián)物揉合到一起， 雖然成本低廉且簡(jiǎn)易，卻通常會(huì)導(dǎo)致聚集體的形成。一種好的交聯(lián)物表現(xiàn)為蛋白吸附于金的表面上，與膠乳不同的是，蛋白是被 動(dòng)地吸附于交聯(lián)物表面，因而不會(huì)出現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。33一般認(rèn)為膠體金粒子表

16、面為一層AuCl2，因此，粒子表面帶有負(fù)電荷，這種負(fù)電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護(hù)這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。膠體金粒子對(duì)蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時(shí)為中性。由于在pH=pI時(shí)蛋白溶解度最小，因此這時(shí)它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在實(shí)際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為pH=PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。在接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，則會(huì)聚集

17、而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。34蛋白通過以下機(jī)制于幾秒之 內(nèi)吸附于金表面金粒子所帶負(fù)電荷與蛋 白內(nèi)氨基酸（如賴氨酸） 所帶陽(yáng)性電荷的最初的 相互吸引 蛋白通過某些氨基酸殘 基包括色氨酸與金粒子 表面之間的疏水吸附作用 蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價(jià)結(jié)合 35金顆粒大小的選擇 檢測(cè)信號(hào)是由金顆粒聚集于測(cè)試線或控制線而出現(xiàn)的信號(hào)。這些粒子必須足 夠大到能被看見，粒子的尺寸越大，這 些粒子聚集后就越容易被看見。隨著粒子尺寸的增大，位阻現(xiàn)象又 成了一個(gè)問題。此外，這些粒子的尺寸越大，它們?cè)诩榷w積溶液中存在的數(shù)量越小。 這種可

18、見度的需要與位阻現(xiàn)象之間的矛盾現(xiàn)象表明，對(duì)于大多數(shù)的免疫檢測(cè) 應(yīng)用而言，最適的粒子大小是 40nm。在某些情況下當(dāng)位阻現(xiàn)象成為較大問題時(shí) （如針對(duì)較小的抗原），20nm 的粒子則更為合適；當(dāng)希望出現(xiàn)更深顏色或當(dāng)分子表面較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用，較大一點(diǎn)的粒子則更為可 取。應(yīng)該由實(shí)驗(yàn)決定確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度、淺背景色和高穩(wěn)定性。 3637蛋白必須要經(jīng)過前處理（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，

19、可同時(shí)與多個(gè)膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。（3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。蛋白分子量過小（30 kD），形成的金-蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時(shí)間內(nèi)失活。而分子量過大時(shí)，被認(rèn)為影響金-蛋白復(fù)合體的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對(duì)活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長(zhǎng)金-蛋白復(fù)合體壽命（防止凝集）的有效辦法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的金-蛋白復(fù)合體。38抗體 Antibody來源差異: 鼠抗,兔抗和羊抗種類差異: 單抗,多抗腹水的處理: 飽和硫酸銨沉淀法特異性:親和層析柱濃度: 濃縮溶解液:不含鹽,例如

20、PB抗原抗體生物原料抗原 Antigen偶聯(lián)抗原物質(zhì): BSA, OVA等毒品檢測(cè)來源: 合成抗原39待標(biāo)記蛋白溶液的制備 將待標(biāo)記蛋白預(yù)先對(duì)0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。40確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值對(duì)于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的金-蛋白復(fù)合體。在高濃度電解質(zhì)（如NaCl）作用下不會(huì)凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。一般選擇最小適宜pH值為最佳pH值。但有些金-蛋白復(fù)合體的實(shí)際情況并不完全如此，最穩(wěn)

21、定金-蛋白復(fù)合體并不完全代表活性最好。這要靠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時(shí)，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定變化。41由于膠體金溶液可能損壞pH計(jì)的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時(shí)，采用精密pH試紙測(cè)定為宜。由于鹽類成分能影響金溶膠對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應(yīng)先對(duì)低離子強(qiáng)度的水透析。必須注意，蛋白質(zhì)溶液應(yīng)絕對(duì)澄清無細(xì)小微粒，否則應(yīng)先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應(yīng)避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因?yàn)樗鼈兌伎晌接陬w粒表面而減弱膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。42蛋白質(zhì)最適用量的選擇加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)

22、象；而加入蛋白量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標(biāo)記蛋白質(zhì)的最低用量，在實(shí)際工作中，可適當(dāng)增加1020。能夠形成穩(wěn)定金-蛋白復(fù)合體的蛋白的最小量。如果在制備金-蛋白復(fù)合體時(shí)加入太多的蛋白，不僅造成浪費(fèi)，而且更為嚴(yán)重的是容易造成金-蛋白復(fù)合體凝聚，并嚴(yán)重影響標(biāo)記活性。因?yàn)榻?蛋白復(fù)合體溶液中的游離蛋白容易搶先與標(biāo)記位點(diǎn)結(jié)合，起到“封閉”（Blocking）作用，而標(biāo)記蛋白標(biāo)記不上。在標(biāo)記位點(diǎn)希少、被標(biāo)記物含量較少的情況下要特別注意。43膠體金標(biāo)記蛋白的純化超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標(biāo)記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時(shí)間。凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金