藥用蘭科植物石斛重大病害拮抗真菌的篩選及抑菌機理

1、藥用石斛重大病害拮抗真菌的篩選及抑菌機理生物技術（非師范）專業(yè) 丁春燕指導老師 王慧中摘要：為探討拮抗真菌對病原菌的抑菌作用，我們用藥用石斛進行內(nèi)生真菌分離、鑒定，篩 選出對鐮刀菌有拮抗作用的木霉菌。對其進行平板對峙培養(yǎng)，從而研究其拮抗作用，研究結 果為生物防治的應用提供實踐基礎。Abstract:關鍵詞：石斛；鐮刀菌；拮抗菌；生物防治Key words:引言）石斛又名石斛蘭，為蘭科（Orchidacea。石斛屬（Dendrobiun）多年生附生草本植物， 全球約有1500種，主要分布于亞洲的熱帶和太平洋島嶼，既是觀賞植物，又是十分重要的 藥用植物，我國有76種，其中作藥用的約有40種，具有益

2、胃生津、滋陰清熱、明目健體、 抗癌和增強免疫力等多種功效。植物內(nèi)生菌作為生活在植物組織內(nèi)部的一大類微生物，在其生活史的一定階段或全過程 中對宿主植物不表現(xiàn)出病癥，由于生活環(huán)境的特殊性，在生理生物學作用上與外界環(huán)境微生 物都有所不同。在與植物長期共同進化過程中，植物內(nèi)生菌與宿主之間形成了一種共生關系， 外界環(huán)境條件與宿主植物代謝變化影響著植物內(nèi)生菌的種類及其代謝發(fā)生的相應變化。植物 內(nèi)生菌作為一類特有的微生物資源已得到廣泛的認同。其中植物抗菌內(nèi)生菌能產(chǎn)生多種新的 抗菌活性物質，不但可以幫助人類解決健康問題，也可以解決植物和動物健康問題。但現(xiàn)階 段對植物抗菌內(nèi)生菌的研究剛剛開始，對其特性了解還不夠

3、深入，無法對其充分利用。因此， 對植物抗菌內(nèi)生菌的研究不僅能帶來巨大的社會效益還具有現(xiàn)實的理論意義。如今生物防治出現(xiàn)，生物防治就是利用生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病原體、害蟲和雜草 的方法。它是一門研究利用天敵控的實質就是利用生物種間關系、種內(nèi)關系，調節(jié)有害生物 種群密度，即是生物群治生物群。其中重要的一點是：植物病原菌的生物防治，即利用微 生物或其代謝產(chǎn)物（抗生物質等）防治植物病原菌（包括土壤中的病原菌。本實驗主要選擇了具有藥用功效的植物石斛組織作為抗真菌內(nèi)生菌分離材料，從中分離 到四株具有抗真菌活性的DEB-1、DEB-2、DEB-3、DEB-4菌株，并進行了種屬鑒定。選擇 了其中DEB-2菌

4、株進行了抗真菌作用的初步研究。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1供試材料石斛（哪種？）菌種。用于DNA提取的石斛屬菌根真菌（具體哪種？這個是需要分離的還是直接提供 的？）培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基成分：取去皮的馬鈴薯塊200g，切成小塊，加水1L煮沸30min， 濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1L，加葡萄糖20g，固體培養(yǎng)基加瓊脂4-5g，溶化后分裝， 121 C，濕熱滅菌15min。病原菌：鐮刀菌（具體？直接提供嗎？）1.1.2生化試劑Taq酶、dNTP、IPTG、X-gal等分子生物學試劑購自上海生物工程技術有限公司T4DNA 鏈接酶、DNA片段快速純化/回收試劑盒等購自鼎國生物有限公司。Mar

5、klllMD103購自 奧維生物工程有限公司。1.1.3菌種與載體E.coli DH-5 a菌株由杭州市生物化學與分子生物學重點實驗室保存。Pmd18-T Vector等 購自TaKaRa生物有限公司。1.2方法與步驟1.2.1 rDNA ITS 的獲得1.2.1.1菌株的培養(yǎng)F2 /35接入PDA固體培養(yǎng)基表面，25 C培養(yǎng)35d，轉接入90mm覆蓋有濾紙的PDA平板 上，每皿的中央接入5mm見方的小菌塊一塊于濾紙的表面。25C培養(yǎng)67d（視菌株的生 長速率而定，以菌絲生長覆蓋滿濾紙為標準）。小心取出接種的菌塊，用滅菌的牙簽刮取濾紙 表面菌落邊緣的菌絲體收集于1.5mL的離心管中4C保存?zhèn)溆?/p>

6、。1.2.1.2石斛屬菌根真菌DNA的提?。?）取出約100mg菌絲體，管中立即加入600ML裂解緩沖液（Tris-HCl100mmolL（pH9）；EDTA100mmol/L； NaCl400mmolL； 2%SDS），加入少許石英砂，在研缽中將菌絲進行 充分研磨。將菌體移入1.5mL的離心管中，于65C水浴保溫30min，每10min取出充分混勻1 次。取出，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為24/24/1),輕輕混勻5min, 12000r/min 離心10min。收集上清液，加入2p l RNase(10mg/mL), 37C水浴保溫30min。加入等體積氯仿，輕搖5min，12

7、000r/min離心10min。吸取上清液，用2倍體積的無水乙醇，沉淀DNA，-20C短暫放置后，12000r/min離 心5min，棄上清。用70%的乙醇洗滌沉淀DNA 2次，自然風干后溶于適量TE，貯存于-20C備用。1.2.1.3 DNA 的檢測DNA樣品在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，加入3p l DNA樣品以入DNA-HindIII作為 分子標記，100V電壓下電泳30min，漠化乙啶染色，紫外燈下觀察拍照。1.2.1.4菌株rDNA ITS區(qū)段的PCR擴增石斛屬菌根真菌rDNA ITS區(qū)段PCR擴增引物：P1： 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG3P2： 5 TCCTCCGC

8、TTATTGATATGC3S在200. l的Ep管中依次加入26. l： 表1PCR反應體系組分體積 TOC o 1-5 h z 10 X Ex Taq Buffer(含 Mg2+)2.5.l模板 DNA2.0.ldNTP(2.5mmol/L)1.5.lP1(20. mol/L)1.5.lP2(20. mol/L)1.5.lTaq 酶(2U/. L)0.2.l滅菌 ddH2O16.8. ltotal26. l混勻后，稍離心，放入PCR儀進行下列程序:PCR反應循環(huán)參數(shù)為94C預變性5min；94C變性30s； 52C退火30s； 72C延伸2min；進行33個反應循環(huán)；72C延伸10min。取

9、5p l的PCR產(chǎn)物電泳檢測。產(chǎn)物片段：500750bp1.2.1.5 PCR產(chǎn)物的回收PCR擴增產(chǎn)物回收采用DNA片段快速純化/回收試劑盒操作按說明書。PCR結束后，從PCR反應管中將液體移至1.5ml離心管中，加入5倍體積的Binding Buffer m混勻。65C水溶5-10min,膠完全溶化即可，其間可振蕩助溶2-3次，待溶化后將混合液移至 UNIQ-10離心柱中，室溫靜置2分鐘。離心、12000rpm，1min。注：如果體積大于500. l, 可適當增加溶膠時間。若一次加不完，可分兩次離心。倒掉液體，加入500. l wash solution于離心柱中8000rpm離心1min，

10、棄液體。重復步驟3?？辙D柱12000rpm再次離心2min，甩干剩余液體以除去殘余酒精。(這步對獲得純產(chǎn)物 是關鍵)，自然晾干10min。將柱放入一新的1.5ml離心管，在膜中間加ddH2O 20. l。12000rpm離心2分鐘，管底溶液即為所需DNA0F2TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAA

11、AATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGJTGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAtTTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACC

12、CCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAF35TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACA

13、ACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACTTCGGGAACCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCG

14、TAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA測序結果如下所示2.4初步篩選的拮抗菌比對結果圖2.5平板對峙培養(yǎng)的結果對峙實驗結果表明，內(nèi)生真菌對鐮刀菌（何種鐮刀菌？）之間有明顯的抑菌區(qū)，鐮刀菌的菌 絲十分整齊，表明此內(nèi)生真菌產(chǎn)生的拮抗物質限制了鐮刀菌的進一步生長（圖1）。圖1內(nèi)生真菌對病原真菌鐮刀菌的抑制作用2.6用內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物做抑制病原菌作用的實驗結果3討論如果在幼苗移栽前接入非致病性的內(nèi)生真菌，將會提高幼苗對植物病害的抵抗力，從而減少 農(nóng)藥的使用量。病原菌感染是植物病

15、害的重要原因之一。不少由真菌引起的植物病害用化學農(nóng)藥等方法不能 有效地根治，同時化學農(nóng)藥的使用容易引起環(huán)境污染和土壤酸堿性化及肥力下降。把對病原 菌具有拮抗活性的微生物菌株轉接到植物體內(nèi)進行生物防治成為一種既有效，又環(huán)保，具有 廣闊應用前景的方法。由于內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)自由的分裂繁殖和傳遞的特性，除了對其宿 主植物及取食或感染宿主植物的生物其作用外，對其他生物沒有直接影響的特點，使之有可 能成為生物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌。本研究從石斛中分離到一株內(nèi)生真菌？， 平板對峙實驗表明，它對鐮刀菌存在拮抗活性。木霉菌對病原真菌有多種作用機制，生境競爭、重寄生作用、產(chǎn)生細胞壁降解酶、抗生作用、

16、誘導植物產(chǎn)生抗性、促進植物對營養(yǎng)物質的吸收等作用被認為是木霉發(fā)生生防作用的制藥機 制，自然條件下往往多種機制協(xié)同作用(摘于棉花黃萎病菌拮抗木霉的篩選及其抑菌機制 的研究，是否要具體的寫？)這提示我們屬于什么屬的內(nèi)生真菌什么有具備成為防治這些植物病害的微生物農(nóng)藥的良好 條件。其對植物真菌病害的生物防治效果有待于植物體內(nèi)轉接實驗的進一步研究。參考文獻：1鄧祖軍，曹理想，譚紅銘等，一株秋茄內(nèi)生真菌對植物病原真菌拮抗活性的研究?？萍?論壇，2001，86黎起秦，林緯，陳永寧，蒙姣榮等，植物土傳病害拮抗真菌的篩選，1999, 12(3)81-84. 李滿飛,徐國鈞，徐珞珊等.商品石斛的調查及鑒定(II)

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