熒光物質(zhì)的基本性質(zhì)

1、熒光：熒光，又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì) 經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)， 并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波段）； 而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱 之為熒光。在日常生活中，人們通常廣義地把各種微弱的光亮都稱為熒光，而不 去仔細(xì)追究和區(qū)分其發(fā)光原理。應(yīng)用：采用熒光標(biāo)記的鏈終止劑所得到的DNA測(cè)序圖用于對(duì)DNA進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序的鏈末端終止法：在原初的方法中，需要對(duì) DNA的引物端進(jìn)行熒光標(biāo)記，以便在測(cè)序凝膠板上確定 DNA色帶的位置。在 改進(jìn)的方法中，對(duì)作為鏈終

2、止劑的4種雙脫氧核苷酸（ddTBP ）分別進(jìn)行熒 光標(biāo)記，電泳結(jié)束后不同長(zhǎng)度的DNA分子彼此分開(kāi)，經(jīng)紫外線照射，4種 被標(biāo)記的雙脫氧核苷酸發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光。通過(guò)分析熒光的光譜便可以 分辨出DNA的序列。DNA探測(cè)：漠化乙啶是一種熒光染料，當(dāng)它在溶液中自 由改變構(gòu)型時(shí)，只能發(fā)出很弱的熒光；當(dāng)它嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間與 DNA分子結(jié)合后，便可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。因此在凝膠電泳中，一般加入漠 化乙啶對(duì)DNA染色。DNA微陣列（生物芯片）：需要對(duì)基因組探針進(jìn)行熒光 標(biāo)記，最后通過(guò)熒光信號(hào)確定靶標(biāo)序列。免疫學(xué)中的免疫熒光檢查法：對(duì)抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，從而可以根據(jù)熒光的分布和形態(tài)確定抗原的部位和性 質(zhì)。流

3、式細(xì)胞儀（又稱熒光激活細(xì)胞分選器，F(xiàn)ACS ）:對(duì)樣本細(xì)胞進(jìn)行熒 光標(biāo)記，再用激光束激發(fā)使之產(chǎn)生特定的熒光，然后用光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)并將 信號(hào)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)進(jìn)行分析，從而得到細(xì)胞相應(yīng)的各種特性。熒光技術(shù)還 被應(yīng)用于探測(cè)和分析DNA及蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，尤其是比較復(fù)雜的生物大 分子。水母發(fā)光蛋白最早是從海洋生物 水母（Aequorea victoria ）中分離 出來(lái)的。當(dāng)它與Ca離子共存時(shí)，可以發(fā)出綠色的熒光。這一性質(zhì)已經(jīng)被應(yīng) 用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)Ca離子的流動(dòng)。水母發(fā)光蛋白的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了人們進(jìn)一 步研究海洋水母并發(fā)現(xiàn)了綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein， GFP ）。綠色熒光

4、蛋白的多肽鏈中含有特殊的 生色團(tuán)結(jié)構(gòu)，無(wú)需外加輔助因 子或進(jìn)行任何特殊處理，便可以在紫外線的照射下發(fā)出穩(wěn)定的綠色熒光， 作為生物分子或基因探針具有很大的優(yōu)越性，所以綠色熒光蛋白及相關(guān)蛋 白已經(jīng)成為生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具。螢光顯微成像技術(shù)： 全內(nèi)反射熒光顯微鏡很多生物分子具有內(nèi)稟的熒光性，不需要外加其他化 學(xué)基團(tuán)就可以發(fā)出熒光。有時(shí)侯這種內(nèi)稟的熒光性會(huì)隨著環(huán)境的改變而改 變，從而可以利用這種對(duì)環(huán)境變化敏感的熒光性來(lái)探測(cè)分子的分布和性質(zhì)。 例如膽紅素與血清白蛋白的一個(gè)特殊位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，可以發(fā)出很強(qiáng)的熒光。 又如當(dāng)血紅細(xì)胞中缺少鐵或者含有鉛時(shí)，會(huì)產(chǎn)生出鋅原卟琳而不是正常的 血紅素（血紅蛋白

5、）；鋅原卟琳具有很強(qiáng)的熒光性，可以用來(lái)幫助檢測(cè)病 因。熒光染料：能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見(jiàn)光和紫外光后，能把紫外光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)光波而 反射出來(lái)，呈閃亮的鮮艷色彩。例如，酸性曙紅、熒光黃、紅汞以及某些 分散染料等。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。熒光染料容易用于熒光染料產(chǎn)品，滲漏探測(cè)！用于增白洗衣粉中的增白劑，指示信號(hào)用的各種熒光路標(biāo)漆，熒光標(biāo)志服等。熒光染料用于：滲漏污水系統(tǒng)水和工業(yè)的污染物連接系統(tǒng)測(cè)量發(fā)電廠排 出的液體 洗手間的滲漏 非法的連接污水管監(jiān)察，研究流量和繪圖分析腐敗的 系統(tǒng)，除用于纖維織物印染外，還可用作某些特種標(biāo)志（如暗處符號(hào)）及軍事追 蹤等。常用熒光

6、染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)Fluorescent DyeExcitationEmission（熒光染料）（激發(fā)波長(zhǎng)，nm ）（發(fā)射波長(zhǎng)，nm ）Cy2489506GFP(Red Shifted)488507YO-PRO -1491509YOYO -1491509Calcein494517FITC494518FluorX494519Alexa 488490520Rhodamine 110496520ABL5-FAM494522Oregon Green 500503522Oregon Green 488496524RiboGreen500525Rhodamine Green502527Rhodamine

7、l 23507529Magnesium Green506531Calcium Green506533TO-PRO -1514533TOTO-1514533ABIJOE520548BODIPY 530/550530550Dil549565BODIPY R542568BODIPY 558/568558568BODIPY 564/570564570Cy3550570Alexa 546555570TRITC547572Magnesium Orange550575PhycoerythnndR & B565575Rhodamine Phalloidin55。575Calcium Orange549576P

8、yronin Y555580Rhodamine B555580ABI,TAMRA560582Rhodamine Red570590Cy3.5581596ABI5ROX588608Calcium Crimson590615Alexa 594590615Texas Red595615Nile Red549628YO-PRO -3612631YOYO -3612631R-Phycocyanin618642C-Phycocyanin620648TO-PRO -3642660TOTO-3642660DID DilC(5)644665Cy5649670Thiadicarbocyani ne651671Cy5.5675694熒光探針：與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)非共價(jià)相互作用而使一種或幾種熒光性質(zhì) 發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游镔|(zhì)的性質(zhì)和行為。熒光探針的用途：最常用于熒光免疫法中標(biāo)記抗原或抗體，亦可用于微環(huán)境， 如表面活性劑膠