蛋白質(zhì)和氨基酸

1、第八章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定第一節(jié) 概述1. 蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。1食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測(cè)定總氮量，然后乘一個(gè)蛋白質(zhì)換算系數(shù)。這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮多的要單測(cè)）。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，人體11%13%總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類

2、型不同。蛋白質(zhì)是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)，其含量與分解產(chǎn)物直接影響食品的色、香、味。2蛋白質(zhì)的測(cè)定方法分兩大類： 一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量； 另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測(cè)定蛋白質(zhì)含量。具體測(cè)定方法：凱氏定氮法最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法國外： 紅外分析儀3氨基酸總量酸堿滴定法測(cè)定。各種氨基酸的分離與定量色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。4第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了 5 種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（3

3、種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）5第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測(cè)定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)1. 氨基黑法2. 溴酚藍(lán)法3. 考馬斯亮藍(lán)法4. 酸性品紅法5. 氨基萘酚磺酸法6第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 一般說來，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白質(zhì)含量為 20.0%左右，豬肉 9.5%， 兔肉 21%， 雞肉 20%， 牛乳 3.5%， 帶魚 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黃瓜 1.0%，蘋果 1.4% 測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意

4、義。7一些蛋白質(zhì)的含氮量 一般為 15% 17.6%，有的上下浮動(dòng)可以測(cè)出總氮 N一、凱氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。= N6.25 = 蛋白質(zhì)含量8（一）常量凱氏定氮法1. 原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。9整個(gè)過程分三步

5、：消化、蒸餾、吸收與滴定1. 消化 總反應(yīng)式：加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn) 340，加入硫酸鉀之后可以提高至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用濃硫酸（98%）10 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點(diǎn)指示劑（做蒸餾時(shí)堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī) 物氧化速度。11儀器：要防止爆沸。另外：介紹“自動(dòng)回流消化儀”122. 蒸餾 消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出

6、氨氣。133. 吸收與滴定用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。 指示劑 紅色 綠色 紅色 （酸） （堿） （酸） 用過量的 H2SO4 或 HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用 NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。吸收滴定14 操作方法：121頁，其中講“以奈氏試 劑”檢查氨是否全部蒸完，以奈氏試劑Nessler試劑，K2（HgI4） 檢驗(yàn)NH4+離子，遇銨根，離子析 出黃色或紅棕色沉淀。配制方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必

7、要時(shí)過濾，并存于玻璃瓶中蓋緊口。15方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于適量少許水，后加水稀釋至50 ml,靜置后，取其澄清液，棄去沉淀，儲(chǔ)存于棕色瓶中。結(jié)果計(jì)算：121頁 注意：F氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為 6.25 也可查表。說明： 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。16 消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。 樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱

8、，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。17 若取樣量較大，如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。18 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。氫氧化銅在7090時(shí)發(fā)黑。

9、蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。19二、微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置 。2010-210-221三、自動(dòng)凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前 2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置。可計(jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。22北京福德泰和科

10、技有限公司產(chǎn)品名稱： 凱氏定氮儀 23二、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。241.原理脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色色絡(luò)合物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測(cè)其吸光度，確定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2

11、CONH225注：測(cè)蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化2.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡(jiǎn)單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測(cè)定。 3.主要儀器： 分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000 r/min） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳266說明及注意事項(xiàng)：a. 蛋白質(zhì)的種類不同，對(duì)發(fā)色程度影響不大；b.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完整后，無需每次再做標(biāo)準(zhǔn)曲線；c.含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去；d.樣品中有不溶性成分存在時(shí)，會(huì)給比色測(cè)定帶來困難，此時(shí)可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進(jìn)行測(cè)定；e.當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時(shí)

12、，若有多量糖類共存，則顯色不好，會(huì)使測(cè)定值偏低。27三紫外吸收法 （一）A280nm光吸收法1原理：蛋白質(zhì)及其講解產(chǎn)物（月示 胨 肽 氨基酸）的芳環(huán)殘基R（ NHCHCO）在紫外區(qū)對(duì)一定波長(zhǎng)的光具有選擇吸收作用。280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度（3-8mg/mL）成直線關(guān)系。用凱氏定氮法確定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。282適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3主要儀器： 紫外分光光度計(jì) 離心機(jī)（3000 5000 r/min）4操作：用凱氏法測(cè)定作標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線295說明及注意事項(xiàng)a.測(cè)定牛乳樣品時(shí)的操作手續(xù)：準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2ml與25ml納

13、氏比色管中，用95-97%的冰醋酸稀釋到標(biāo)線，搖勻，以95-97%的冰醋酸為參比液，用1cm比色皿于280nm處測(cè)定吸光度，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣品蛋白質(zhì)含量（標(biāo)準(zhǔn)曲線用凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的牛乳標(biāo)樣繪制）。b.測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)將表皮的顏色去掉。c.溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20-30。30三紫外吸收法 （二）肽鍵紫外測(cè)定法1原理：蛋白質(zhì)溶液在238nm下均有光吸收，其吸收強(qiáng)弱與肽鍵多少成正比，可測(cè)定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液做對(duì)照，求出蛋白質(zhì)含量。本法比280nm法靈敏。醇、酮、醛、有機(jī)酸和過氧化物等都有干擾作用，最好用無機(jī)酸、無機(jī)堿和水作為介質(zhì)溶液。若含有有機(jī)

14、溶劑，可將樣品先蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸或稀堿溶解后再做測(cè)定。50-500mg/L蛋白質(zhì)范圍線性良好。31四、福林-酚比色法1.原理：蛋白質(zhì)與Folin-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。機(jī)理：蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)，由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測(cè)可溶性蛋白含量最靈敏的經(jīng)典方法之一。2.試劑：福林-酚試劑甲、乙、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液3.操作方法：P1274.說明：靈敏度高，實(shí)測(cè)下限較雙縮脲法約小2個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)雙縮脲法有干擾的物質(zhì)對(duì)本法影響更大。酚類、檸檬酸有干擾。32五、考馬斯亮藍(lán)染料比色

15、法1.原理：G-250與蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，蛋白染色，在620nm處有最大吸收。2.特點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，適合大量樣品測(cè)定，靈敏度類福林酚法，不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。3.試劑：牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、G-2500-100mg/L線性關(guān)系良好。33六、水楊酸比色法1.原理：樣品中蛋白經(jīng)硫酸消化轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，一定酸度和溫度條件下與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍(lán)色化合物，660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，計(jì)算Pro含量。2.說明：樣品消化完全后當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性好，樣液放至第二天比色即有變化；溫度對(duì)顯色影響極大，故應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度；對(duì)谷物及飼料等樣品的測(cè)定證明，此法結(jié)果與凱氏定氮法

16、基本一致。34七、紅外光譜法1.原理：食品中不同功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段（6.47m）和NIR波段（如3300-3500nm、2080-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量。2.應(yīng)用：紅外牛乳分析儀、近紅外光譜儀35八、4,4-二羧基-2，2-聯(lián)喹啉【BCA】法1.原理：二價(jià)銅離子在堿性條件下，可被Pro還原成Cu+， Cu+和獨(dú)特的BCA試劑相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)Cu+ ，形成紫色化合物。顏色深淺與一定范圍Pro濃度成正比。2.應(yīng)用：已用于Pro的分離和純化中。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度與福林酚法相

17、似。微量BCA法的靈敏度（0.5-10微克）稍高于福林酚法；一步混合的操作比福林酚法更簡(jiǎn)單；所用試劑比F法簡(jiǎn)單；非離子型表面活性劑和緩沖液不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾；中等濃度的變性劑（4mol/L鹽酸胍或3M尿素）不對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生干擾。缺點(diǎn)：反應(yīng)產(chǎn)生的顏色不穩(wěn)定，需仔細(xì)控制比色時(shí)間；還原糖對(duì)此反應(yīng)產(chǎn)生的干擾比對(duì)福林酚法更大；不同蛋白質(zhì)反應(yīng)引起的顏色變化與福林酚法相似；比色的吸光度與蛋白質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。36九、比濁法1.原理：低濃度（3-10%）的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白質(zhì)沉淀形成蛋白質(zhì)顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過程中的衰減而確定，輻射光傳送過程中的衰減是由于蛋白質(zhì)顆粒

18、的散射造成的，衰減程度與溶液中的Pro濃度成正比。2.應(yīng)用：已用于測(cè)定小麥面粉和玉米的Pro含量。3.優(yōu)點(diǎn)：快速，15min內(nèi)完成；結(jié)果不包括除了核酸外的非蛋白含量。4.缺點(diǎn)：不同Pro沉淀的速率不同；濁度歲酸試劑濃度的不同而變化；核酸也能被酸試劑沉淀。37十、杜馬斯法（燃燒法）1.原理：樣品在高溫下（700-800）燃燒，釋放的氮?dú)庥蓭釋?dǎo)檢測(cè)器（TCD）的GC儀測(cè)定。測(cè)得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的Pro含量。2.操作：p1313.應(yīng)用：適用于所有樣品。AOAC方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品。優(yōu)點(diǎn)：燃燒法是凱氏定氮法的一個(gè)替代方法；不需要任何有害化合物；可在3min內(nèi)完成；

19、最先進(jìn)的自動(dòng)化儀器可在無人看管狀態(tài)下分析多達(dá)150個(gè)樣品。缺點(diǎn)：儀器價(jià)格昂貴；非蛋白氮也包括在內(nèi)。38第四節(jié) 蛋白質(zhì)的末端測(cè)定一、N-末端測(cè)定-丹磺?；?.原理：蛋白質(zhì)的-氨基與丹磺酰氯（DNS-Cl）反應(yīng)，生成DNS-Pro，經(jīng)水解生成DNS-aa。通過分析DNS-aa，可確定Pro的N-末端aa。2.儀器和試劑3.操作方法：P131-13239第四節(jié) 蛋白質(zhì)的末端測(cè)定二、蛋白質(zhì)及多肽C-末端測(cè)定及順序分析（羧肽酶法）1.原理：羧肽酶作用于Pro或多肽，從C-末端aa殘基開始順序降解，并逐個(gè)釋放出游離C端aa。CPACPBCPCCPY CPA使用最廣泛 CPY作用范圍更廣，包括釋放C-末端

20、Pro的特殊功能，適用于降解所有的aa。Aa釋放的種類和數(shù)目隨時(shí)間變化，經(jīng)過一定時(shí)間間隔取出樣品，酸化失活后用自動(dòng)分析儀或HPLC 進(jìn)行快速測(cè)定，初步確定C-末端基為何種aa。若以酶作用時(shí)間為橫坐標(biāo)，以所釋放的各aa量為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)aa釋放的動(dòng)力學(xué)曲線可進(jìn)一步判斷和確定肽鏈C端的aa順序。關(guān)鍵是測(cè)出第一個(gè)釋放的是何種aa，一般采用兩種以上C-末端測(cè)定方法，進(jìn)行比較和驗(yàn)證才穩(wěn)妥可靠。缺點(diǎn)：酶解反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行，難以控制。幾個(gè)aa降解速率相近，及幾個(gè)相同的aa順序毗鄰排列時(shí)，結(jié)果難以確定。2.試劑：P1333.操作方法：P13340第五節(jié) 氨基酸的定性測(cè)定一、氨基酸的一般顯色反應(yīng)（一）茚三酮法（生

21、化試驗(yàn)）（二）吲哚醌法1.原理：各種aa與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，可借此辨認(rèn)aa。氨對(duì)吲哚醌顯色沒有妨礙，但靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在干燥的環(huán)境中才能保存。2.步驟：P13541第五節(jié) 氨基酸的定性測(cè)定（三）鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色aa最靈敏方法之一，可用于aa溶液定量，并推廣應(yīng)用于乙內(nèi)酰苯硫脲aa、多肽和Pro的檢出和定量。aa紙上層析靈敏度0.5moL，硅膠薄層層析上為0.05-0.2 moL1.原理：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中于aa作用產(chǎn)生熒光化合物，最適合的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為340nm和455nm。各種aa顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)

22、度不同，P1352.說明：濾紙上顯現(xiàn)aa時(shí)，鄰苯二甲酸濃度0.1%為宜。顯色須有一定濕度，以便aa溶解，提高碰撞幾率，使極性基團(tuán)解離，促進(jìn)反應(yīng)趨于完全。42第五節(jié) 氨基酸的定性測(cè)定二、個(gè)別aa的顯色反應(yīng)（一）精氨酸的顯色-坂口反應(yīng)（二）胱氨酸和半胱氨酸的顯色（三）甘氨酸的顯色（四）脯氨酸的顯色（五）絲氨酸和羥賴氨酸的顯色（六）羥脯氨酸的顯色（七）色氨酸的顯色（八）酪氨酸的顯色（九）酪氨酸和組氨酸的顯色-Pauly反應(yīng)43 第六節(jié) 氨基酸定量測(cè)定一氨基酸的一般定量測(cè)定（一）甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有堿性 NH2基，又有 酸性 COOH 基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與 NH2 結(jié)合，堿

23、性消失，再用強(qiáng)堿來滴定 COOH 基，用間接方法測(cè)定aa總量。2特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果接近。適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以此了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，為控制發(fā)酵生產(chǎn)指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用產(chǎn)生不穩(wěn)定化合物，結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)會(huì)消耗一些堿使結(jié)果偏高；溶液中有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，結(jié)果偏高。3.說明：適于食品中游離氨基酸的測(cè)定。 固體樣品：粉碎，水萃取，測(cè)定萃取液；液樣直接測(cè)定。 樣品顏色深，可先脫色，再測(cè)定，或電位滴定法進(jìn)行測(cè)定。 單指示劑法，結(jié)果稍低。 雙指示劑法結(jié)果更準(zhǔn)確。44（二）電位滴定法： 40%中性甲醛溶液

24、：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性紅50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4操作：同時(shí)取兩份樣： + 中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和 樣液中其它酸性物質(zhì)。（酸度計(jì)pH8.2） + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總 和。（酸度計(jì)pH9.2） 二者之差可計(jì)算氨基酸含量45（三）茚三酮的比色法原理：氨基酸在堿性溶液中與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物（脯氨酸除外），可比色定量。570nm。操作：p140-141說明:樣品處理方法：活性炭吸附處理； 茚三酮受陽光、空

25、氣、溫度、濕度等被氧化呈淡紅或深紅色，用前需純化。（活性炭處理）46（四）非水溶液滴定法原理：氨基酸在冰醋酸中顯示出堿性，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。適合aa成品的含量測(cè)定。允許測(cè)定范圍幾十mg。操作：p141-142說明:能溶解于冰醋酸的aa，如賴氨酸、精氨酸等。 谷氨酸和天冬氨酸溶解于2mL甲酸中，再加20mL冰醋酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。（五）鄰苯二甲醛法1.原理：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，于堿性溶液中與aa作用產(chǎn)生熒光化合物，合適的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)為340nm和455nm。各種aa熒光強(qiáng)度不同。47（六）三硝基苯磺酸法原理：三硝基苯磺酸（TNBS）在偏堿性條件下與aa反應(yīng)

26、，先形成中間絡(luò)合物，在光譜上有2個(gè)吸收相近的高峰，355nm和420nm附近。溶液一旦酸化，中間絡(luò)合物轉(zhuǎn)化成三硝基苯-aa（TNP-aa），420nm處的吸收值顯著下降，350nm附近的吸收峰移至340nm處。利用這一特性，在420nm處或340nm處對(duì)aa進(jìn)行定量測(cè)定。操作：p145-146說明:p14648（七）乙酰丙酮和甲醛熒光法原理：aa與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)，生成N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙?；?1,4-二氫吡啶，產(chǎn)生黃綠色熒光，用熒光分析法檢測(cè)。P147（各種aa的發(fā)射波長(zhǎng)和檢測(cè)范圍）操作：p14749二個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定（一）賴氨酸的測(cè)定1.原理：用銅離子阻礙游離aa的

27、-氨基，使賴氨酸的-氨基可以自由的與1-氟-2,4-二硝基苯（FDNB）反應(yīng)，生成 DNP-賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取，在波長(zhǎng)390nm處有吸收峰，從而求出樣品中游離賴氨酸含量。2操作：p1483.說明：添加一定量中性aa，如丙氨酸，增加總aa濃度，有助于賴氨酸-HCl濃度具有良好線性關(guān)系。 用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-aa衍生物除去，并把FD-WB的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生干擾。50二個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定（二）色氨酸的測(cè)定1.原理：樣品中的Pro經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生成哈爾滿化合物，具有特征熒光值，可進(jìn)行定量測(cè)定。2操作：p1

28、483.說明：0-10mg/L色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。51原理：苯丙氨酸與茚三酮及銅鹽反應(yīng)生成熒光復(fù)合物，其熒光復(fù)合物在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)490nm處可產(chǎn)生最大熒光強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)aa對(duì)照，可求出樣品中苯丙氨酸的含量，檢測(cè)時(shí)加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增強(qiáng)這一反應(yīng)。（四）酪氨酸的測(cè)定原理：酪氨酸和1-亞硝酸-2-萘酚反應(yīng)，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亞硝酸鈉存在的條件下加熱，產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，可用熒光法定量測(cè)定。（三）苯丙氨酸的測(cè)定52原理：在丙酮溶劑中，脯氨酸和吲哚醌反應(yīng)形成藍(lán)色化合物，能用以測(cè)定蛋白質(zhì)水解液中的脯氨酸含量，一定條件下（包括pH，緩沖液濃度和吲哚醌濃度

29、），可以在其他aa存在下直接測(cè)定，不受羥脯氨酸的干擾。（六）羥脯氨酸的測(cè)定原理：羥脯氨酸在有過量的丙氨酸（減少其他aa的干擾）的條件下，用氯胺T氧化生成（五）脯氨酸的測(cè)定53（八）谷氨酸的測(cè)定原理：L-谷氨酸在大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶作用下脫羧釋放出CO2，由測(cè)壓法測(cè)得CO2釋放量，計(jì)算出谷氨酸含量。（七）胱氨酸的測(cè)定原理：用亞硫酸鹽使胱氨酸還原為半胱氨酸和S-半胱氨酸磺酸，其他含二硫鍵的物質(zhì)也被還原。通過巰基被磷鎢酸還原成鎢藍(lán)的反應(yīng)測(cè)定半胱氨酸，從而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巰基可在加磷鎢酸前先加氯化汞與巰基結(jié)合。因反應(yīng)pH為5，其他還原性物質(zhì)如尿酸、VC也使磷鎢酸還原，通過空白對(duì)照加以去除。5

30、4第七節(jié) 氨基酸的分離與測(cè)定 一薄層色譜法（薄層層析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography簡(jiǎn)介： 近年來發(fā)展起來的一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。55（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf

31、值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。56Rf = a / bab樣點(diǎn)溶劑前沿點(diǎn)樣原點(diǎn)57優(yōu)點(diǎn)： 展開時(shí)間短，一般在2030分鐘，展開距離通常只需10 cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。 能夠使用多種顯色劑。 點(diǎn)樣量少，靈敏度高。（比紙層析高10100倍） 精確到0.01ug。 也可用于大量分離500 mg，作為樣品制備層析。缺點(diǎn)：Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差。分類：按層析的原理可分為：吸附、分配、離子交換、凝膠等。58（三）操作方法： 薄層板制備 樣品液制備 點(diǎn)樣：距薄板底端2c

32、m處，用針畫一標(biāo)記作為 原點(diǎn)。再以點(diǎn)樣距扳子寬窄可點(diǎn)幾個(gè)點(diǎn)同時(shí) 展開，點(diǎn)與點(diǎn)之間間隔12cm。a.可用毛細(xì)玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一個(gè)點(diǎn)干了再點(diǎn)另一個(gè)點(diǎn)。b.用一小直徑3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到 板子上先挖好一個(gè)小洞穴。59 展開：點(diǎn)樣完了，放入密閉容器中（展開槽），傾斜一定角度1030，下端浸入展開劑1cm，千萬別讓溶劑浸過了樣點(diǎn)。到離頂端一部分，取出樣板、晾干、顯色。a.展開劑的有關(guān)情況：主要是低沸點(diǎn)的23種有機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng)，分離效果主要決定于展開劑的選擇，因?yàn)槲絼┰谝欢ㄇ闆r下是恒定的，吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇。60b.展開劑的選擇方法：.微量圓環(huán)法。.用小載波片試驗(yàn)，微量展開劑展開5cm。.圖解法：樣品極性小，選吸附劑活性高，展開劑極性低的。樣品極性大，選吸附劑活性低，展開劑極性高。 有機(jī)溶劑極性由小到大為： 石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有機(jī)酸類等。61c.展開的方式：上行法、下行法、雙向展開、單向多次