DNA的生物合成課件

1、 第十章DNA 的生物合成 中 心 法 則復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 翻譯DNA RNA 蛋白質(zhì) 逆轉(zhuǎn)錄 RNA 復(fù)制 遺傳信息的傳遞途徑第一節(jié) 半保留復(fù)制Messelson 與 Stahl 的實(shí)驗(yàn)以15NH4Cl為氮源培養(yǎng)細(xì)菌若干代，則親代 DNA 鏈為重鏈。換用14NH4Cl為氮源培養(yǎng)細(xì)菌，則新生的子代 DNA 為輕鏈。真核生物細(xì)胞可利用氨甲蝶呤抑制從頭合成，同時以 5-溴尿嘧啶標(biāo)記。利用 CsCl 密度梯度離心，可以鑒定 DNA 分子的密度。 DNA 重鏈與 DNA 輕鏈子一代與子二代 DNA 的密度半保留復(fù)制的生物學(xué)意義第二節(jié) DNA 復(fù)制的酶學(xué)DNA復(fù)制的基本條件：核苷酸單體：dNTP遺傳信息的指導(dǎo)

2、：模板 DNA酶與蛋白因子：DNA 聚合酶 解螺旋酶引物酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶連接酶 單鏈結(jié)合蛋白參與 DNA 復(fù)制蛋白的分析方法純化：分離在邏輯上與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。重建：在體外利用純化蛋白進(jìn)行組合，重建 復(fù)制過程。突變：利用遺傳突變體作為工具，通過各種 突變型的功能缺失，確定特定基因在 活體的功能。 溫度敏感突變型：許可溫度 33 非許可溫度 41一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)反應(yīng)：(dNTP)ndNTP (dNTP)n1Ppi特點(diǎn)：需要引物與模板，有方向性。二、 DNA 聚合酶DNA-dependent DNA polymerase，DDDP.1958 年，Kornberg 首先自大腸桿菌純化了 DNA 聚

3、合酶 I。在具有模板、底物與引物的條件下，可以在體外催化 DNA 新鏈的合成。目前在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了 5 類 DNA 聚合酶，在真核細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了 5 類 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶 I需要模板 (ssDNA) 與引物 (DNA/RNA)。具有 3 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。5， 3，外切活性：切除 RNA 引物。DNA 聚合酶 I 的校讀作用DNA pol I 聚合活性遠(yuǎn)高于 3， 5，外切活性。發(fā)生錯配時聚合活性降低，外切活性起作用。錯誤參入率約 105，校讀后為 1010。DNA 聚合酶 I 的結(jié)構(gòu)109 kDa 單一多肽鏈，在枯草桿菌蛋白酶

4、作用下可被裂解為大片段與小片段。大片段具有聚合與校讀活性，稱 Klenow 片段。DNA 聚合酶 I 的作用DNA pol I 不是 DNA 復(fù)制中起主要作用的酶。延伸速度較慢：20 nt/sec。持續(xù)合成能力約 200 bp。大腸桿菌基因組 DNA 長度為 4106 bp，以 pol I 完成復(fù)制需一天時間。大腸桿菌 20 min 分裂一代，完成復(fù)制只需 40 min。DNA 聚合酶 I 的作用生理功能：DNA 損傷修復(fù)；在復(fù)制過程中起輔助作用。突變株(只有正?；钚缘?1)不致死，只是對紫外線敏感。5， 3，外切活性缺陷則致死。每個大腸桿菌約含有幾百個 pol I，含量相對穩(wěn)定，不受細(xì)胞生長

5、狀態(tài)的影響。DNA 聚合酶 II具有 2 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。延伸速度慢，只有 5 nt/sec，持續(xù)合成能力約 1500 bp，不適應(yīng)于復(fù)制。突變型大腸桿菌能夠正常生長。功能不明，推測可能與 SOS 修復(fù)有關(guān)。DNA 聚合酶 III具有 2 種基本活性：5， 3，聚合活性：合成作用。3， 5，外切活性：校讀作用。延伸速度快，可達(dá) 1000 nt/sec，適用于復(fù)制。聚合酶 III 在細(xì)胞內(nèi)數(shù)目較少 (20)，且只在細(xì)胞生長期間出現(xiàn)，因此最后發(fā)現(xiàn)。是 DNA 復(fù)制主要的酶。溫度敏感突變型是致死突變。DNA 聚合酶 III 的結(jié)構(gòu)核心酶：聚合活

6、性：校讀活性：參與亞基組建：結(jié)合模板并滑動。 復(fù)合物：引導(dǎo)亞基與 模板的結(jié)合。10 種亞基組成的多聚體蛋白，每種亞基 2 個，分子量約 140 kDa。3 種 DNA 聚合酶的比較DNA 聚合酶 IV 和 VDNA pol IV 和 V 是在 1999 年才發(fā)現(xiàn)的，涉及傾向錯誤的復(fù)制機(jī)制。當(dāng) DNA遭受嚴(yán)重?fù)p傷時可誘導(dǎo)兩種酶的生成，完成損傷處的 DNA 復(fù)制。因無完整的模板指導(dǎo)，復(fù)制缺乏準(zhǔn)確性。真核生物 DNA 聚合酶真核細(xì)胞的線粒體 DNA線粒體具有自身的遺傳物質(zhì)。線粒體基因組與細(xì)菌相似，為環(huán)狀雙鏈。人類線粒體 DNA 編碼 37 個基因。13 個基因編碼 ATP 合成相關(guān)蛋白，24 個編碼

7、 tRNA。線粒體 DNA 隨線粒體的分裂而復(fù)制，代謝方式于細(xì)菌類似。有觀點(diǎn)認(rèn)為：真核細(xì)胞是古細(xì)菌在厭氧細(xì)胞中寄生后產(chǎn)生的。三、解鏈相關(guān)蛋白：解螺旋酶模板 DNA 必須是單鏈，因此 DNA 復(fù)制時必須解鏈。解螺旋酶：helicase，水解 ATP 提供能量解開 DNA 雙螺旋。在大腸桿菌中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少于 10 種解螺旋酶。1976 年第一個解螺旋酶被發(fā)現(xiàn)，稱為 helicase I。它參與了 F 因子的復(fù)制(滾環(huán)復(fù)制的方式)。參與復(fù)制的主要解螺旋酶是 dnaB 基因產(chǎn)物，可以表示為 DnaB。解螺旋酶的種類解螺旋酶有六聚體與二聚體兩類。解螺旋酶結(jié)合 DNA 單鏈，有方向性?？煞譃?53 與

8、 35 兩種方向。解螺旋酶 DnaBDnaB ，又稱復(fù)制型 DNA 解螺旋酶，6 亞基同聚體。其突變型 DNA復(fù)制缺陷。 聚合物成為環(huán)狀，結(jié)合于 DNA 單鏈，53 方向滑動解開 DNA 雙鏈。 功能：與 DnaA、DnaC 相互作用，參與復(fù)制起始。與 DnaG 協(xié)同，形成引發(fā)體合成引物。與 DNA pol III 結(jié)合，參與復(fù)制全過程。三、解鏈相關(guān)蛋白：單鏈結(jié)合蛋白Single strand binding protein，SSB。同源四聚體，可結(jié)合單鏈 DNA，并且具有協(xié)同效應(yīng)。作用：防止單鏈回復(fù)其雙螺旋狀態(tài)。保護(hù)單鏈不被損傷因素破壞。突變型致死，說明是復(fù)制所必需。三、解鏈相關(guān)蛋白：拓?fù)洚?/p>

9、構(gòu)酶改變 DNA 雙鏈盤繞的圈數(shù)，解決拓?fù)鋵W(xué)限制。原核生物環(huán)狀 DNA 分子盤繞圈數(shù)無法改變。真核生物線狀 DNA 分子極長，也不能改變。大腸桿菌 DNA 復(fù)制時其 DNA 每秒旋轉(zhuǎn) 100 次。拓?fù)洚悩?gòu)酶：topoisomerase，即能水解又能連接磷酸二酯鍵。拓?fù)洚悩?gòu)酶的種類拓?fù)洚悩?gòu)酶 I：產(chǎn)生瞬間單鏈斷裂，催化負(fù)超螺旋的松弛。在細(xì)菌稱蛋白，突變型不致死，非復(fù)制必需。突變導(dǎo)致負(fù)超螺旋增加，影響轉(zhuǎn)錄活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶 II：產(chǎn)生瞬間雙鏈斷裂，在無 ATP 時松弛超螺旋，在有 ATP 時可引入負(fù)超螺旋。在細(xì)菌稱旋轉(zhuǎn)酶 (gyrase)，結(jié)構(gòu)形式為A2B2。復(fù)制必需。是新生霉素、抗萘啶酮酸等抗生素

10、的作用靶。拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的作用機(jī)理拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 的作用機(jī)理拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 的作用機(jī)理作用：引入或解開超螺旋。松解連環(huán)。四、引物酶與引發(fā)體DNA 聚合酶需要引物，生理?xiàng)l件下以 RNA 作為引物，而 DNA 不可能成為引物。引物由引物酶 (primase) 合成，dnaG 基因的產(chǎn)物是引物酶。引物酶是 RNA 聚合酶，可從頭開始模板鏈互補(bǔ)鏈的合成。引物酶與 DnaB 及 DnaC 蛋白形成引發(fā)體而發(fā)揮作用。BCG53模板鏈 RNA 引物 (5 nt)Primasome Dna B (helicase) Dna C (bind DnaB) Dna G (primase)OH35引發(fā)體：pri

11、mosomeDNA 連接酶Ligase，連接 DNA 雙鏈的單鏈切口，此反應(yīng)需要能量。大腸桿菌 DNA 連接酶利用 NAD提供能量。 OH P3 55 35 3連接酶DNA 連接酶作用機(jī)理第三節(jié) DNA 復(fù)制的過程在真核生物，DNA復(fù)制發(fā)生于 S 期。一、復(fù)制的起始復(fù)制是否具有固定位點(diǎn)？是單一位點(diǎn)還是多位點(diǎn)？同時向兩個方向進(jìn)行還是單向進(jìn)行？需要哪些蛋白的參與？過程如何？原核生物的復(fù)制起始點(diǎn)同位素標(biāo)記，放射自顯影，電鏡觀察，可見復(fù)制期間的 DNA 呈狀。復(fù)制起點(diǎn)是單一的。真核生物的復(fù)制起始點(diǎn)真核生物為多復(fù)制起點(diǎn)。依據(jù)復(fù)制速度推斷： 人類基因組 6109 bp，單一起點(diǎn)需 3 天。事實(shí)上完成 S

12、期只需要 68 小時。電鏡觀察可見多復(fù)制起點(diǎn)。由一個復(fù)制起點(diǎn)引導(dǎo)復(fù)制的區(qū)域是一個復(fù)制子。哺乳動物的復(fù)制子大約在 100200 kb 之間。雙向復(fù)制右圖：對細(xì)菌進(jìn)行一段時間的低放射性標(biāo)記后進(jìn)行短時間強(qiáng)放射性標(biāo)記，然后放射自顯影。下圖：果蠅 DNA，短暫強(qiáng)放射性后弱放射性標(biāo)記。原核生物具有固定復(fù)制起始點(diǎn)細(xì)菌生長同步化后同位素標(biāo)記新生 DNA。用已知位點(diǎn)基因序列進(jìn)行雜交檢測。復(fù)制有單一固定起點(diǎn)，雙向復(fù)制。復(fù) 制 叉兩條 DNA 單鏈的復(fù)制是不對稱的。一條鏈連續(xù)合成，為前導(dǎo)鏈 (leading)。另一條鏈不連續(xù)合成，為隨從鏈 (lagging)。岡崎片段隨從鏈上新生的不連續(xù)片段稱岡崎片段。因?qū)槭紫劝l(fā)

13、現(xiàn)而得名。大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)跨度 245 bp，包含 3 個正向重復(fù)與 2 對反向重復(fù)。13 bp 正向重復(fù)：GATCTCTTATTAG，富含 AT， 易于解鏈。 9 bp 反向重復(fù)：TGTGGATTATTATACACA DnaA 蛋白結(jié)合部位。大腸桿菌復(fù)制起始過程大腸桿菌復(fù)制起始過程 起始復(fù)合物 起始后 1 分鐘的狀態(tài)原核生物復(fù)制起始的調(diào)控Col E1 質(zhì)粒的復(fù)制時，由 RNA II 作為引物。RNA I 可干擾 RNA II 的作用，Pop 蛋白則可促進(jìn) RNA I 與 RNA II 的結(jié)合，均能夠抑制質(zhì)粒復(fù)制。Rop 基因突變可以使質(zhì)粒的拷貝數(shù)大幅度增加。原核生物復(fù)制起始的調(diào)控在大

14、腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)含有 11 個 GATC 回文序列，可被甲基化酶甲基化。半甲基化的新鏈不能復(fù)制，相比與其它部位的甲基化(1.5min)，起始點(diǎn)甲基化需 13 min。原核生物復(fù)制起始的調(diào)控半甲基化 OriC 可與膜結(jié)合，而全甲基化狀態(tài)不能結(jié)合。與膜的結(jié)合對 DNA 在分裂時的分配非常重要。真核生物復(fù)制起始與調(diào)控在酵母細(xì)胞，復(fù)制起點(diǎn)稱為自主復(fù)制序列，autonomously replicating sequences，ARS。ARS 序列長度約 150 bp，其中含有 11 個堿基的保守序列，是 ORC 復(fù)合體結(jié)合的部位。起點(diǎn)識別復(fù)合物，origin recognition complex在一條酵

15、母染色體可能有多個 ARS，酵母的 17 條染色體共有 400 個 ARS。在高等動物細(xì)胞中還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的起始序列，起始區(qū)域有較大的隨機(jī)性。真核生物復(fù)制起始與調(diào)控在 G1 期，Cdc6p 結(jié)合于 ORC。Cdc6p 的結(jié)合促進(jìn) MCM 復(fù)合體的形成。當(dāng)酵母細(xì)胞進(jìn)入 S 期后，兩種蛋白激酶激活轉(zhuǎn)錄。CDK-cyclin BCdc7p-Dbf4p二、復(fù)制的延伸前導(dǎo)鏈與后隨鏈的合成在延伸過程中，前導(dǎo)鏈與后隨鏈的合成平行進(jìn)行。DNA 聚合酶 III 的不對稱性是其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。岡崎片段間的連接滾環(huán)復(fù)制一些單鏈 DNA噬菌體 或 F 因子的復(fù)制方式。在 F 因子復(fù)制時，單鏈產(chǎn)物穿過細(xì)菌間結(jié)合性菌毛進(jìn)行傳遞

16、。滾環(huán)復(fù)制真核生物的延伸過程復(fù)制的主要酶是 DNA 聚合酶。DNA 聚合酶的作用是合成引物。PCNA，增殖細(xì)胞核抗原。功能類似于原核聚合酶 III 的亞基。RFC，類似原核聚合酶 III 的復(fù)合物。RPA，單鏈結(jié)合蛋白。真核生物核小體的復(fù)制在真核生物，DNA 復(fù)制時核小體結(jié)構(gòu)必需首先解離。在復(fù)制完成后，新生的 DNA 鏈迅速與組蛋白結(jié)合，重新形成核小體。真核生物核小體的復(fù)制同位素標(biāo)記新生核小體，通過交聯(lián)劑交聯(lián)，分析后發(fā)現(xiàn)，核小體的重新組裝是半保留的。核小體發(fā)生了解離和重新組裝。三、復(fù)制的終止原核生物具有復(fù)制終止點(diǎn)復(fù)制終止于起始點(diǎn)的對側(cè)，但不是自發(fā)終止。具有兩個復(fù)制終止區(qū)，分別作用于兩個復(fù)制叉。

17、終止區(qū)包含 23 bp 的保守序列，只能單向起作用。Tus 蛋白結(jié)合并終止復(fù)制。線狀 DNA 復(fù)制的末端問題線狀 DNA 復(fù)制時末端將產(chǎn)生小范圍缺失。這段缺失區(qū)域稱為 primer gap。如果不能修復(fù)，則 DNA 將隨復(fù)制的代數(shù)而逐步縮短。端 粒 telomere真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由 DNA 及端粒結(jié)合蛋白組成。作用：保證染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。解決末端問題。結(jié)構(gòu)：短序列重復(fù)多次而成。 人類：TTAGGG，515 kb。端 粒 酶 telomerase細(xì)胞中存在端粒酶，可延長端粒。端粒酶作用于 DNA 的 3，末端，延長端粒的重復(fù)單位。其互補(bǔ)鏈區(qū)域可完成一次新的后隨鏈合成。端粒酶的作用

18、機(jī)理端粒酶由酶蛋白及 RNA 組成。端粒延長的爬行模型：利用自身 RNA 模板指導(dǎo)合成 DNA。酶蛋白具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性。端粒是細(xì)胞壽命的決定因素 體外培養(yǎng)細(xì)胞具有固定的傳代次數(shù)，超過一定代數(shù)細(xì)胞將停止分裂并死亡。端粒的長度是細(xì)胞壽命的限制因素。端粒的長度隨細(xì)胞的分裂而縮短。老齡鼠來源的細(xì)胞端粒較幼齡鼠來源的細(xì)胞端粒短，分裂代數(shù)也少。分化的體細(xì)胞端粒較短，胚胎細(xì)胞與干細(xì)胞端粒較長。端粒酶是細(xì)胞分裂能力的基礎(chǔ) 沒有端粒酶活性的細(xì)胞不能無限分裂。具有端粒酶的細(xì)胞有無限分裂的潛能。胚胎期細(xì)胞以及干細(xì)胞等端粒酶活性較強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞端粒酶活性增強(qiáng)。有可能是腫瘤細(xì)胞獲得無限增殖能力的原因之一。第四節(jié) DNA

19、損傷與修復(fù)DNA損傷損傷因素正確修復(fù)突變細(xì)胞死亡一、DNA 損傷內(nèi)在或外在因素造成的 DNA 結(jié)構(gòu)的破壞。內(nèi)在因素：自發(fā)損傷，如 C 脫氨為 U。 正常代謝物造成的損傷，如 O2。外在因素：物理因素：紫外線 化學(xué)因素：烷化劑 亞硝酸 堿基類似物 羥胺類物質(zhì)紫外線造成的損傷紫外線導(dǎo)致嘧啶二聚體的形成。有 T-T；T-C；C-C 三種形式。其他類型的電磁波或粒子束也可造成損傷。亞硝酸鹽造成的損傷亞硝酸造成 A 或 C 脫氨。AH，H 與 C 配對。CU，U 與 A 配對。C 常發(fā)生自發(fā)脫氨，發(fā)生率 8/hr/cell。DNA 含有 T 而無 U 具有重要意義。烷化劑造成的損傷1942 年，英國人最

20、早發(fā)現(xiàn)軍用毒氣氮芥可造成嚴(yán)重的 DNA 損傷。烷化劑可造成堿基的烷基化，導(dǎo)致堿基脫離或誘發(fā)突變。二、DNA 損傷修復(fù)修復(fù)的前提：信息的完整：DNA 雙鏈只損傷一條鏈。需要能量：ATP 或 光能。修復(fù)的方式：原位的恢復(fù)。損傷部位的切除與再合成。對損傷的耐受。1. 光修復(fù)細(xì)菌紫外線照射避光死亡細(xì)菌紫外線照射可見光照射存活率上升光修復(fù)酶：黃素蛋白，可吸收 370 nm 可見光，直接分解嘧啶二聚體。光修復(fù)是自然界最古老的一種 DNA 修復(fù)方式。在細(xì)菌中普遍存在。在植物中也發(fā)揮重要作用在高等動物中作用有限，哺乳動物不具備光修復(fù)酶。2. 切除修復(fù)切除損傷部位并合成新生 DNA 鏈以替代之。DNA 雙鏈中只

21、有一條受損時可修復(fù)。切除修復(fù)是自然界分布最廣，也是最重要的一種修復(fù)方式。方式：ABC 內(nèi)切酶參與的核苷酸切除修復(fù)。糖苷酶與 Ap 內(nèi)切酶參與的堿基切除修復(fù)。細(xì)菌的核苷酸切除修復(fù)ABC 內(nèi)切酶在損傷處兩側(cè)產(chǎn)生切口，去除 1213 nt 片段。DNA pol I 與 ligase 完成填補(bǔ)。人類的切除修復(fù)缺陷：著色性干皮病Xeroderma pigmentosum, XP患者皮膚對紫外線敏感，易患皮膚癌。共發(fā)現(xiàn)了 9 種基因與此病有關(guān)。機(jī)制：解螺旋酶解鏈 兩種內(nèi)切酶酶切 pol /填補(bǔ)堿基切除修復(fù)尿嘧啶糖苷酶，嘧啶二聚體糖苷酶等可切除堿基，產(chǎn)生無嘌呤無嘧啶位點(diǎn) (Ap 位點(diǎn))。Ap 內(nèi)切酶在 Ap

22、 位點(diǎn) 5，端產(chǎn)生切口。DNA pol I 完成切除與填補(bǔ)。3. 重組修復(fù)損傷部位復(fù)制時無法生成互補(bǔ)鏈，產(chǎn)生大范圍缺失。recA 基因編碼重組蛋白。recA細(xì)菌對紫外線敏感。本身并不能修復(fù)損傷，只是一種對損傷的耐受機(jī)制，保證遺傳信息的完整。損傷可在下一輪復(fù)制前被修復(fù)。損傷可被無限稀釋。4. SOS 修復(fù)在細(xì)菌 DNA 損傷嚴(yán)重時激發(fā)的一種傾向差錯的修復(fù)機(jī)制。雙鏈同時受損，遺傳信息丟失。細(xì)菌中存在特異性較差的復(fù)制系統(tǒng)，正常情況下其基因不活躍，被 Lex A 蛋白所抑制。RecA 蛋白具有蛋白酶活性，可被 DNA 損傷激活。RecA 酶解 Lex A，從而激活 SOS 修復(fù)。LexA 蛋白的作用傾向差錯的復(fù)制體系LexA 的分解導(dǎo)致多種基因的活化：激活切除修復(fù)機(jī)制，如 uvrB 基因。激活特異性低的復(fù)制體系。DNA pol IV 與 V：DNA Pol III 在復(fù)制時受阻，可被 IV 或 V 所替換。RecA可直接酶解并激活 DNA pol V：UmuD2UmuC UmuD，2UmuC三、突 變DNA 堿基序列的異常改變。突變發(fā)生的原因：復(fù)制中的錯誤參入。DNA 損傷的異常修復(fù)或未能修復(fù)。突變的種類：錯配缺失與插入重排DNA 鏈上堿