靜脈移植脂肪來源干細(xì)胞治療大鼠腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究

1、本項(xiàng)目為湖南省衛(wèi)生廳科研基金課題，課題編號(hào)（A2004-002）*通訊作者：劉運(yùn)海，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，410008，E-mail:靜脈移植脂肪來源干細(xì)胞治療大鼠腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究王瑋1 張寧1 楊興東2 劉運(yùn)海1 1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長(zhǎng)沙 410008 2北京海淀醫(yī)院，北京，100083The Therapeutic Effect Of The Intravenous Administration Of Adipose-derived Adult Stem Cells For Treating Transient Focal Cerebral Ischemia In R

2、ats Wang-Wei 1, Zhang-Ning 1, Yang Xingdong 2, Liu Yunhai11Department of Neurology ,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,410008，China2Beijing Haidian Hospital,Beijing, 410008 , ChinaAbstract AIM: TO observe the survival ,migration,differentiation and the recovery of neurological ded

3、icits after transplantation of ADSCs into ischemic rats.And we also explored the effectiveness of ADSCs transplantation in treating the middle cerebral artery occlusion of Sprague-Dawley rats, and the potential therapeutic time window. METHODS: Adult male SD rats were subjected to middle cerebral ar

4、tery occlusion by the monofilament method.DMEM were transplanted to control group at 3,6,12,24,72 hours after MCAo respectively. About 3*106ADSCs in 1ml prelabeled with BrdU were transplanted transplantation group by venous approach at above-mentioned time. These animals were euthanized at 14 days a

5、fter MCAo. Immunofluoresecence for BrdU,NSE,MAP-2,GFAP were processed to assess neurological functions,TTC staining was used to examine the volumes of cerebral infactions. The apoptotic neurons in ischemic areas were observed by terminal deoxynucleotidyl transferrase-mediated d UTP nick end labeling

6、 (TUNEL)staining . RESULTS: 1.After transplantation, ADSCs labeling with BrdU were present in the ischeminc points and surrounding areas ,while very few BrdU positive cells could be found in the counterlateral hemisphere.2.the percentages of BrdU that labeled expressed BrdU/GFAP, BrdU/NSE, BrdU/MAP-

7、2-positive cells were separedtely 6.9%.1.1% and 1.3% in the ischemic points at 14days after ischemia. 3.In ADSCs transplantation group ,neurological functional recocery were improved significantly at 14days compared with untreated group and control group at the same time points, the scores of motor

8、severity of the rats in 3-h postlesion group was the lowest ,the difference was evident between that in 3-h postelesion group and 72-h postlesion group.4. ADSCs transplantation at all of these time ppints resulted in lesion volume reduction,the infarct lesions were the fewest when ADSCs were intrave

9、nously administrated 3h after MCAo,there is obvious difference compared with that of 72h postlesion group .5.TUNEL-positive cells around the ischemic lesions in ADSCs transplantation group were significantly fewer compared with untreated group and control group at the same time points(P0.05),and the

10、 number of TUNEL-positive cells around the ischemic lesions in ADSCs transplantation group at the same time points (P0.05),and the number of TUNEL-positive cells in the rats in 3h postlesion group was the lowest, the difference was evident between that in 3h postlesion group was the lowest ,the diff

11、erence was evident between that in 3h postlesion group and 72h postlesion group. CONCLUSIONS: 1.ADSCs could migrate into ischemic hemisphere by venous approcach in the MCAo model in the rat ,and express the neuron and the glial cell marks.2.The intravenous administration of ADSCs into rats with MCAo

12、 lead to greater functional outcome and fewer lesion size,The therapeutic effects of inravenous administration of ADSCs in rats afer MCAo may contribute to that it can significantly decrease TUNEL-positive neurons in the MCAo model in the rat.3.There is potential therapeutic time window for intraven

13、ous administration of ADSCs in rats after MCAo.The earlier transplantation times after the ischemic insult resuled in more beneficial outcomes ,but the infarct volume in rats transplanted even at 72 h afer MCAo was limited compared with the control lesioned rats ,and that these rats showed improved

14、behavioral function also.Key words adipose-derived stem cells ;focal cerebral ischemia ; therapeutic time window；vein graft；Immunofluorescence摘要 目的：觀察ADSCs移植入腦缺血大鼠后細(xì)胞的存活、遷移、分化以及大鼠的神經(jīng)功能缺損恢復(fù)情況，探討ADSCs移植治療治療大鼠局灶性腦缺血的有效性和潛在的治療時(shí)間窗。方法: 制作成年雄性SD大鼠MCAO模型，未處理組手術(shù)后不作特殊處理，DMEM干預(yù)各組分別在術(shù)后第3、6、12、24、72小時(shí)經(jīng)左側(cè)股靜脈注射DME

15、M lml; ADSCs移植各組分別在上述5個(gè)時(shí)間點(diǎn)靜脈給予ADSCs 1ml，各組大鼠于MCAo術(shù)后14天處死。免疫熒光染色觀察BrdU, NSE, MAP-2和GFAP的表達(dá);第3、7及14天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分;TTC染色法測(cè)定腦梗死體積，TUNEL染色觀察缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡變化。結(jié)果：1、ADSCs移植后主要分布在腦缺血灶周圍，而非缺血側(cè)大腦極少分布;2、ADSCs移植組缺血灶周圍BrdU/GFAP, BrdU/NSE和BrdU/MAP-2雙染陽性細(xì)胞比例分別為6.9%、1.1%和1.3%; 3、7、14天時(shí)各ADSCs移植組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與未處理組或同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有顯著性降

16、低(P0.05)，而3h組神經(jīng)功能評(píng)分最低，與72小時(shí)組相比有顯著性差異(P0.05); 4、ADSCs移植組的腦梗死體積明顯小于未處理組或同時(shí)間點(diǎn)DMEM處理組(P0.05)，而3h組腦梗死體積最小，與72h組相比有顯著性差異(P0.05);5、 ADSCs移植組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯少于未處理組和同時(shí)間點(diǎn)DMEM處理組(P0.01)，而3h組凋亡數(shù)目最小，與72h組相比有顯著性差異(P0.01)。結(jié)論：、靜脈移植在腦內(nèi)能遷移分布到梗死灶周圍，能表達(dá)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物、靜脈抑制能改善大鼠缺血所致的神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積。、靜脈移植治療MCAo大鼠存在治療時(shí)間窗，早期移植改善作用更為

17、明顯，MCAo后小時(shí)移植仍然有效。關(guān)鍵詞 脂肪基質(zhì)干細(xì)胞；腦缺血；治療時(shí)間窗；靜脈移植；免疫熒光中圖號(hào) R743.32O引言腦血管病是嚴(yán)重威脅人類特別是中老年人生命和健康的一類疾病，是目前人類疾病的三大死亡原因之一。而缺血性腦血管病占腦血管病的75%左右，并且面對(duì)缺血性腦血管病的高死亡率和高致殘率，當(dāng)前的治療手段效果甚微。過去認(rèn)為腦神經(jīng)細(xì)胞一經(jīng)壞死則不能再生，當(dāng)前的治療方法亦立足于搶救瀕臨壞死的腦細(xì)胞和通過促進(jìn)其余存留的腦細(xì)胞的代償來改善神經(jīng)功能缺損，而對(duì)于己壞死的腦細(xì)胞則別無良策，這亦是當(dāng)前缺血性腦血管病高死亡率和高致殘率原因的根本所在。脂肪干細(xì) 胞(adipose-derived adul

18、t stem cell, ADSCs)從脂肪組織中獲得，它們具有干細(xì)胞的特性，能夠自我增殖并分化成多種譜系的細(xì)胞1.2.3，新近的研究發(fā)現(xiàn)，ADAS在體外誘導(dǎo)分化后可變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞，并能夠表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特有的信號(hào)4.5.6，我們也在前期的研究中發(fā)現(xiàn)腦梗死側(cè)的腦組織上清液也可以誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞。并且 ADSCs是一種易于獲得、對(duì)病人創(chuàng)傷小、易于產(chǎn)生足夠的細(xì)胞數(shù)目、無需長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、能夠減少移植后的自體免疫應(yīng)答、且無法律和倫理限制的自體細(xì)胞，新近的研究將其推向組織工程和再生醫(yī)學(xué)的前沿。本實(shí)驗(yàn)通大鼠腦缺血模型的ADSCs移植，觀察ADSCs移植入腦缺血大鼠后細(xì)胞的存活、遷移、分化以及大鼠的神

19、經(jīng)功能缺損恢復(fù)情況，探討ADSCs1材料和方法1.1材料 1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠（中南大學(xué)動(dòng)物部, 鼠齡 6 - 8周，體重280-320g），采用SD大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈線拴模型方法,閉塞90分鐘后再通,MCAo術(shù)后隨機(jī)分為11組（每組18只），第一組為未處理組，26組對(duì)照組，711組為移植組。各組動(dòng)物在手術(shù)前均禁食1214小時(shí)，可自由飲水。未處理組手術(shù)后常規(guī)飲食，不作特殊處理，對(duì)照組分別在MCAo術(shù)第3、6、12、24、72小時(shí)后通過左側(cè)股靜脈注射DMEM；移植組分別在上述5個(gè)時(shí)間點(diǎn)靜脈給予ADSCs1ml1.1.2主要試劑：100mL/L水合氯醛（中南大學(xué)藥劑

20、科），型膠原酶，胰酶（Sigma），DMEM低糖（GIBCO/BRL），胎牛血清（Hcylone），小鼠抗MAP-2、抗GFAP單克隆抗體（Neomarkers），小鼠抗NSE(Serotec)、小鼠抗CD34 （Santa Cruz），小鼠抗CD44 （Serotec），小鼠抗CD29 （Biolegend）。 1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 100mL/L 水合氯醛(3 mL /kg) 腹腔注射麻醉SD大鼠，無菌條件下取出腹股溝處脂肪，剔除軟組織和小血管，PBS 緩沖液沖洗3 次，剪成小塊，37下7.5g/L型膠原酶消化30min，含15%FBS 的DMEM 等體積中和，10

21、00 轉(zhuǎn)/min 離心10min 后棄去上清及脂肪組織，160mmol/L 紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞10min，離心棄去上清，含15g/LFBS 的DMEM重懸細(xì)胞及沉淀的組織快，接種至含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。每72h換液1次，810d細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)胰酶消化，離心收集。細(xì)胞融合至80%一90%的ADSCs用含0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶消化(于鏡下控制消化時(shí)間)，細(xì)胞稀釋2-3倍傳至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞基本融合，再用胰酶消化，以上述方法進(jìn)行細(xì)胞傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。取第25代細(xì)胞，漂洗，離心,戊二醛固定，漂洗，鍔酸固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，樹脂浸透，1.2.2

22、 動(dòng)物模型制作以線栓法2制作大鼠MCAO模型。10%的水合氯醛(0.3ml/100mg)腹腔注射麻醉大鼠后，分離右頸總動(dòng)脈并剪一小口，將頭端燒成光滑杵狀的國(guó)產(chǎn)尼龍線(直徑0.235mm，長(zhǎng)6cm)插入，以頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算進(jìn)線深度為180.5mm，至大腦中動(dòng)脈起始部以完全阻斷血供。模型成功的標(biāo)志是麻醉蘇醒后大鼠出現(xiàn)前肢或后肢癱瘓，并在造模24h后行頭部MRI檢查確定造模成功。24hT1 W1顯示MCA區(qū)的稍低信號(hào)（稍長(zhǎng)T1信號(hào)），T2WI及水抑制系列均顯示MCA區(qū)的異常高信號(hào)（長(zhǎng)T2信號(hào)），與周圍正常組織對(duì)比明顯，提示存在缺血損傷病灶。ADSCs懸液1ml（3 106 個(gè)細(xì)胞/mL ）(細(xì)胞移

23、植前與Brdu 共培養(yǎng)24 h)按照0.1ml/秒的速度將1ml細(xì)胞懸液全部推注入大鼠左側(cè)股靜脈內(nèi)。 1.2.3 腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 腦缺血2小時(shí)待動(dòng)物清醒后，參照Chen等的方法進(jìn)行神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。具體評(píng)分:提尾時(shí)：前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，30秒內(nèi)頭部垂直運(yùn)動(dòng)10度1分（以上三項(xiàng)可以累計(jì)）；行走時(shí):正常行走0分，不能走直線1分，向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)2分，倒向癱瘓側(cè)3分。按照上述標(biāo)注于再灌注后3、7和14天對(duì)動(dòng)物行為障礙的程度進(jìn)行評(píng)分，0分作為模型不成功剔除，并在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充前面剔出出組的動(dòng)物，保證每組6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1.2.4 組織學(xué)檢查 按時(shí)間點(diǎn)捕殺動(dòng)物，過量麻醉，40 g/L多聚甲

24、醛灌注固定后取腦組織, 常規(guī)行固定、脫水、透明、浸蠟及包埋，切片，厚度為20微米。TCC染色和腦梗死體積測(cè)定：將切片置于TCC磷酸緩沖液中避光, 37度恒溫孵育30min,正常組織紅染,不顯色部分為腦梗死組織.甲醛固定24小時(shí)后用數(shù)碼相機(jī)拍照,應(yīng)用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定各層面積及腦梗死面積。Brdu染色標(biāo)記其存活及遷移途徑：PBS沖洗，鹽酸，胰酶, TritonX-100,各處理30min,加入小鼠抗Brdu（1:100），4攝氏度過夜，沖洗，加Fitc標(biāo)記IgG（1：200），封片，觀察。按Tunel試劑盒方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：切片脫蠟后用蛋白酶K37 消化20min，沖洗后加

25、入3 g/L H2O2(甲醇溶解)之后，1 g/L TritonX-100處理,PBS洗2次，涼干滴加10 L反應(yīng)液 (1 L酶和9 L反應(yīng)緩沖液混勻)置于濕盒37 60 min。依次加入凋亡試劑盒的Buffer A,顯色劑，bufferB，顯色劑。之后，DAB復(fù)染20 s，水洗,脫水，透明，封固。顯微鏡下1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析全部資料采用SPSS 11.0軟件包分析，各組數(shù)據(jù)均用s 表示：多組樣本均數(shù)間比較先用方差分析，再用q檢驗(yàn)，p0.05表示有顯著性差異。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代細(xì)胞培養(yǎng)3天可見少量細(xì)胞貼壁，6天左右細(xì)胞開始成集落樣生長(zhǎng)，形態(tài)呈梭型及不規(guī)則三角型，9天左右集落

26、相互融合，逐漸形成亞融合態(tài)。電鏡顯示ADSCs核呈分葉狀，染色質(zhì)豐富，胞漿內(nèi)細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，呈低分化狀態(tài)，符合原始細(xì)胞特點(diǎn)。2.2運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià) 各組大鼠在MCAo術(shù)后3天神經(jīng)功能評(píng)分最高,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):14天時(shí)各ADSCs移植組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與未處理組及同時(shí)間對(duì)照組相比有顯著性降低(P 0.05) ,而在各ADSCs移植組中以3小時(shí)組神經(jīng)功能評(píng)分最低,與72小時(shí)組相比有顯著性差異(P0.05),如表1所示.表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響（s）組別例數(shù)3d7d14d未處理（MCAo組）1組243.330.522.80.362.020.43對(duì)照組（DMEM處理組）2（3h）243.

27、450.772.780.63 2.000.223（6h）243.530.452.740.721.920.304（12h）243.420.662.820.431.950.305（24h）243.350.502.450.522.000.386（72h）243.390.592.790.571.950.31ADCS干預(yù)組247（3h）243.500.492.420.341.070.408（6h）243.370.572.450.671.370.219（12h）243.430.512.510.371.400.2610（24h）243.440.622.400.531.470.3311（72h）243.660

28、.562.430.651.560.34與未處理組比較P0.05，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較P0.05，與7組比較P0.05。2.2 TTC染色觀察及腦梗死體積測(cè)定 TCC染色顯示非梗死側(cè)腦組織紅染，而缺血側(cè)發(fā)現(xiàn)有局限的不顯色區(qū)域（白色），與周圍和對(duì)側(cè)非缺血區(qū)腦組織（紅染）界限較分明，后缺血區(qū)主要位于視交叉后2-4mm腦皮質(zhì)，各組用數(shù)碼相機(jī)拍照，在各組腦組織冠狀切面上，TCC染色應(yīng)用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)量各層面積，計(jì)算腦梗死體積（結(jié)果見表2 ）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各移植組大鼠腦梗死體積與未處理組及同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有顯著性降低（P0.05），在各移植組中又以3小時(shí)組腦梗死體積最低，與72小時(shí)

29、組相比有顯著性差異（P0.05）表各組大鼠腦梗死體積的比較（mm3, s）組別例數(shù)腦梗死體積未處理（MCAo組）1組6178.1722.87對(duì)照組（DMEM處理組）2（3h）6147.3337.403（6h）6149.1740.604（12h）6152.1741.105（24h）6169.6733.996（72h）6174.3330.22ADCS干預(yù)組67（3h）696.6723.148（6h）6101.6727.149（12h）6108.0025.4810（24h）6121.5023.4611（72h）6133.3331.68與未處理組比較P0.05，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較P0.05，與7組比

30、較P0.01)，ADSCs移植組的細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯少于未處理組和同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組（p0.01），ADSCs治療各組中以3小時(shí)以至組凋亡細(xì)胞數(shù)最低，與72小時(shí)移植組相比有顯著性差異（P0.01）見表3 。 表各組大鼠梗死周圍區(qū)域凋亡細(xì)胞數(shù)目的比較（個(gè)，s）組別例數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)未處理（MCAo組）1組650.504.84對(duì)照組（DMEM處理組）2（3h）647.505.163（6h）656.006.814（12h）653.336.685（24h）651.174.366（72h）654.334.93ADCS干預(yù)組67（3h）621.673.338（6h）634.175.719（12h）633.175.9

31、810（24h）639.834.9611（72h）641.676.74與未處理組比較P0.05，與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較P0.05，與7組比較P0.05。 3 討論 干細(xì)胞具有自我更新能力,能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化,在局灶性腦缺血性損傷的治療中可能起重要作用。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦內(nèi)出現(xiàn)損傷信號(hào)時(shí),骨髓干細(xì)胞可向腦缺血病灶遷移,將骨髓干細(xì)胞移植入缺血腦組織后,這些細(xì)胞發(fā)生遷移和分化,并減輕卒中后的神經(jīng)功能缺損0。而脂肪干細(xì)胞具有和骨髓干細(xì)胞類似的特性, 日前已經(jīng)證實(shí)脂肪組織來源干細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化11.12，13.14.15，可作為多種組織工程的種子細(xì)胞。新

32、近研究發(fā)現(xiàn)，從大鼠腹部摘取的脂肪組織在體外純化并大量擴(kuò)增后體外定向誘導(dǎo)。大部分ADSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)NSE的神經(jīng)元樣細(xì)胞，并有軸突和樹突樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，多個(gè)神經(jīng)元樣細(xì)胞之間可形成網(wǎng)絡(luò)。顯示在一定培養(yǎng)條件下，來源于脂肪組織提取物的細(xì)胞有分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的能力11,16-20 因此本研究將ADSCs經(jīng)尾靜脈移植入腦梗死大鼠模型，發(fā)現(xiàn)通過靜脈移植的ADSCs能夠穿透血腦屏障并遷移至缺血腦組織周圍,并且ADSCs主要遷移分布在腦梗死區(qū)域，在非梗死區(qū)域可檢測(cè)到極少量的標(biāo)記的ADAS。有研究表明化學(xué)歸巢因子可能促使移植的干細(xì)胞向腦缺血區(qū)域遷移。據(jù)報(bào)道21 ，大鼠局灶性腦缺血后，缺血腦組織內(nèi)的單核細(xì)胞化學(xué)趨化

33、蛋白一1 (monocyto chemoattractant protein-1 , MCP -1)明顯升高;體外研究發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織提取物能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)的遷移而加用抗MCP- 1抗體后，MSCs的遷移明顯受抑。說明炎性化學(xué)趨化因子MCP-1可促進(jìn)MScs的遷移并分布至腦缺血部位。此外，巨噬細(xì)胞炎性蛋白一la(macrophage inflammatory protein-lalpha , MIP-la)， 白介素一8(interleukin-8,IL-8)等炎性化學(xué)趨化因子及炎性細(xì)胞因子也有促進(jìn)MSCs在缺血腦組織內(nèi)的遷移的作用22 。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)ADSCs有著一些與骨髓基質(zhì)細(xì)

34、胞同樣的細(xì)胞粘附分子和受體分子，ADSCs的蛋白表達(dá)譜與。RNA與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相似23 ，表明ADSCs在組織工程學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可能有著與骨髓基質(zhì)細(xì)胞相似的潛力，因此上述化學(xué)因子可能也對(duì)ADSCs同樣有“招募”作用。同時(shí)對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分發(fā)現(xiàn)：各移植組大鼠腦梗死體積與未處理組及同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有顯著性降低（P0.05），在各移植組中又以3小時(shí)組腦梗死體積最低，與72小時(shí)組相比有顯著性差異（P0.05），這說明靜脈移植ADSCs能改善大鼠腦缺血所致的神經(jīng)功能缺損，減小腦梗死體積。ADSCs促使神經(jīng)功能改善及縮小梗死體積的具體機(jī)制目前仍然不十分明確，目前有以下兩種觀點(diǎn):一是移植的細(xì)胞可

35、以遷移至缺血區(qū)域并替代受損的腦組織:二是增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌來實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植后14天雖然有大量的Brdu陽性的細(xì)胞聚集在缺血區(qū)域周圍，但是僅有大約2.4%和6.9%植入干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，不足以完全替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)反射回路起到代償功能;因此盡管ADSC移植治療后表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的蛋白表型，我們?nèi)匀徊荒苷J(rèn)為這些細(xì)胞確實(shí)分化并替代了受損的腦組織，細(xì)胞移植治療產(chǎn)生效果更可能的機(jī)制是減少缺血半影區(qū)的細(xì)胞凋亡、增加神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)前對(duì)ADSCs治療缺血性腦損傷移植時(shí)間點(diǎn)的選擇也頗有爭(zhēng)議，Mampalam等 認(rèn)為移植時(shí)問應(yīng)選擇在MCAo后2-15天進(jìn)行，另一些

36、學(xué)者則認(rèn)為3周時(shí)腦組織較為適合移植物的生長(zhǎng)，也有一些學(xué)者認(rèn)為3周時(shí)再行NSC移植己不能逆轉(zhuǎn)缺血后繼發(fā)的丘腦萎縮24.25。Satoshi等則在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)MCAo動(dòng)物模型移植BMSCs后發(fā)現(xiàn)存在明顯的組織學(xué)和動(dòng)物行為學(xué)上的差異，而以早期移植效果最佳26 。本研究發(fā)現(xiàn)3小時(shí)移植組與其它時(shí)間點(diǎn)移植組相比能夠獲得更明顯的神經(jīng)功能改善，一方面，考慮不同缺血損傷后的不同時(shí)程，神經(jīng)元的活力和狀態(tài)不一樣，隨著時(shí)間的推移，越來越多的神經(jīng)細(xì)胞將發(fā)生不可逆損害，所以早期移植更利于保護(hù)缺血半影區(qū)腦組織，縮小缺血半影區(qū)體積;另一方面，一些凋亡因子，如Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，在凋亡過程中尤

37、其是缺血所致的凋亡過程中起著關(guān)鍵性的作用。值得注意的是我們的研究結(jié)果表明早期移植效果較好，然而即使是72小時(shí)移植組與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比仍然獲得了神經(jīng)功能的改善和缺血體積的縮小。盡管目前多種供體細(xì)胞都作為卒中治療的細(xì)胞來源，脂肪干細(xì)胞仍以更多的優(yōu)勢(shì)吸引著研究者的目光:取材容易，取材量大，能反復(fù)取材，損傷較小，能保持穩(wěn)定的倍增能力和低水平的衰減，體外擴(kuò)增簡(jiǎn)單易行，因此極有可能會(huì)成為多種疾病治療的新替代細(xì)胞源。參考文獻(xiàn)1Huang J I ,Beanes SR ,Zhu M ,et al.Rat extramedullary adipose tissue as a source of osteoc

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