蛋白質結構分析

1、關于蛋白質結構的分析第一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質的結構具有多種結構層次，包括一級結構和空間結構，空間結構又稱為構象。空間結構包括二級結構、三級結構和四級結構。在二級與三級之間還存在超二級結構和結構域這兩個結構層次。第二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質分子構象的立體化學原則 （a）肽鏈空間構象的基本結構單位為肽平面或肽單位。所謂的肽平面是指肽鏈中從一個C原子到另一個C原子之間的結構，共包含6個原子（C、C、O、N、H、C），它們在空間共處于同一個平面。如下圖所示：第四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（

2、b）肽鍵上的原子呈反式構型 （c）肽鍵C-N鍵長為0.132nm,比一般的CN單鍵（0.147nm）短，比C=N雙鍵（0.128nm）要長，具有部分雙鍵的性質（partial double-bond character），不能旋轉。而C-COOH、C-NH2，為真正單鍵（pure single bond），可以旋轉。（d）相鄰肽平面構成二面角 ：一個C原子相連的兩個肽平面，由于N1C和CC2（羧基碳）兩個鍵為單鍵，肽平面可以分別圍繞這兩個鍵旋轉，從而構成不同的構象。一個肽平面圍繞N1C（氮原子與碳原子）旋轉的角度，用表示。第五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 另一個肽平面圍繞CC2（

3、碳原子與羧基碳）旋轉的角度，用表示。這兩個旋轉角度叫二面角（dihedral angle）。通常二面角（，）確定后，一個多肽鏈的二級結構就確定了。蛋白質空間結構要點： a-螺旋（a-Helix） 又稱為3.613螺旋，= -57。，= -47。 結構要點：(1) 多個肽鍵平面通過碳原子旋轉，主鏈繞一條固定軸形成右手螺旋。(2) 每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當于0.54nm。第六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中CO和N-H形成許多鏈內氫健，即每一個氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個殘基的CO之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定螺旋的主要鍵。（4）肽鏈中氨基酸側鏈R，分

4、布在螺旋外側，其形狀、大小及電荷影響螺旋的形成。第七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月-折疊（ -pleated sheets）又稱片層、結構，其結構要點如下：（1）多肽鏈呈鋸齒狀（或扇面狀）排列成比較伸展的結構；（2）相鄰兩個氨基酸殘基的軸心距離為0.35nm，側鏈R基團交替地分布在片層平面的上下方，片層間有氫鍵相連；（3）有平行式和反平行式兩種，平行式的折疊其=119。，=+113。反平行折疊其=139。，=+135。 第八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質的三級結構：一條多肽鏈中所有原子在三維空間的整體排布，稱為三級結構，是包括主、側鏈在內的空間排列。大多數(shù)蛋白質

5、的三級結構為球狀或近似球狀。 在三級結構中，大多數(shù)的親水的R側基分布于球形結構的表面，而疏水的R側基分布于球形結構的內部，形成疏水的核心。 蛋白質的四級結構：二個或二個以上具有獨立的三級結構的多肽鏈（亞基），彼此借次級鍵相連，形成一定的空間結構，稱為四級結構。 四級結構的實質是亞基在空間排列的方式。第九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質一級結構的測定 蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。 測序要求 1 樣品必需純（97%以上）

6、。 2 知道蛋白質的分子量 。 3 知道蛋白質由幾個亞基組成 。 第十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 4 測定蛋白質的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。 5 測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量 蛋白質和多肽氨基酸順序的測定 1 肽鏈的拆開和分離?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理 。 2測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 第十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 3二硫鍵的斷裂，-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。 4測定每條

7、多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比 第十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 5 N端、C端的測定多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。 6多肽鏈斷裂 可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。 第十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 7測定每個肽段的氨基酸順序。 8

8、確定肽段在多肽鏈中的次序。利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 9確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。第十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質結構分析的物理方法X射線衍射法 特征X射線及其衍射 X射線是一種波長很短(約為200.06埃)的電磁波，能穿透一定厚度的物質，并能使熒光物質發(fā)光、照相乳膠感光、氣體電離。在用高能電子束轟擊金屬“靶”材產(chǎn)生X射線，它具有與靶

9、中元素相對應的特定波長，稱為特征（或標識）X射線。如通常使用的靶材對應的X射線的波長大約為1.5406埃。1埃=0.1納米=10-10m第十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 考慮到X射線的波長和晶體內部原子面間的距離相近，1912年德國物理學家勞厄提出一個重要的科學預見：晶體可以作為X射線的空間衍射光柵,即當一束 X射線通過晶體時將發(fā)生衍射，衍射波疊加的結果使射線的強度在某些方向上加強，在其他方向上減弱。分析在照相底片上得到的衍射花樣，便可確定晶體結構。1913年英國物理學家布拉格父子在勞厄發(fā)現(xiàn)的基礎上,不僅成功地測定了NaCl、KCl等的晶體結構,并提出了作為晶體衍射基礎的著名公

10、式布拉格方程：2d sin=n 第十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 當X射線以掠角(入射角的余角)入射到某一點陣晶格間距為d的晶面上時，在符合上式的條件下，將在反射方向上得到因疊加而加強的衍射線。布拉格方程簡潔直觀地表達了衍射所必須滿足的條件。當 X射線波長已知時(選用固定波長的特征X射線)，采用細粉末或細粒多晶體的線狀樣品,可從一堆任意取向的晶體中，從每一角符合布拉格方程條件的反射面得到反射,測出后，利用布拉格方程即可確定點陣晶面間距、晶胞大小和類型;根據(jù)衍射線的強度,還可進一步確定晶胞內原子的排布。 第十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共四十六頁，

11、創(chuàng)作于2022年6月X-ray對蛋白結構的測定 1. 晶體培養(yǎng) 結構測定的精度依賴于晶體所能達到的衍射分辨率，所以獲得具有強衍射能力的晶體是蛋白質晶體結構測定分析的關鍵步驟，是蛋白質晶體結構分析的瓶頸。蛋白質結晶過程是一個有序化的過程。一般可分為兩個階段：首先是在一定的沉淀劑濃度下，讓蛋白質溶液以適當高的濃度達到過飽和狀態(tài)，蛋白質分子從溶液中析出并聚集形成晶核；然后是周圍的分子向晶核聚集，晶體逐漸長大。第二十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 由于蛋白質結晶比小分子結晶要復雜，這是由于大分子分子量很高，幾何形狀較復雜，表面電荷多種多樣，因此在外界條件的影響下，分子構象容易產(chǎn)生某些變化，

12、一些小分子結晶的方法都不適用于大分子，使得大分子結晶工作相當困難。蛋白質結晶的方法：常用的結晶方法是氣相擴散法。第二十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 微量蒸氣擴散法主要是通過在一個封閉體系內，在能使某種蛋白質結晶的較高沉淀劑濃度的溶液與含有較低沉淀劑濃度的蛋白質溶液之間發(fā)生蒸汽擴散，最后兩者達到平衡，蛋白質溶液內沉淀劑濃度逐漸增加使得蛋白質的溶解性降低，達到過飽和析出而結晶。第二十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 蛋白質結晶經(jīng)過了長期的摸索，已形成商品化的試劑盒，如HamptonResearch公司的Crystal Screen Kits。第二十三張，PPT共四十六頁

13、，創(chuàng)作于2022年6月 2 數(shù)據(jù)收集和處理。一般來講，中等大小晶胞的一套高分辨率數(shù)據(jù)，至少要收集幾萬個衍射強度數(shù)據(jù)，在經(jīng)過專門的數(shù)據(jù)處理程序包處理，給出這一套數(shù)據(jù)的各種統(tǒng)計結果，以判斷數(shù)據(jù)質量的好壞。第二十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 3 .測定相位 分子置換法，單/多對同晶置換法（SIR/MIR），單/多波長反常散射（SAD/MAD）等。同晶置換法和反常散射法都需要在蛋白質結構中通過實驗的方法引入重原子，所以由其所得的相位稱為實驗相位，它們是求解新結構的主要方法。而分子置換法可以解析有同源結構的未知結構。 4.相位的改進。電子密度圖的質量及其后的可解釋性主要決定于相角的準確性

14、。在某些情況下采用晶胞不對稱單元中等同部分的電子密度平均，有可能大大改善誤差較大的起始相角。第二十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 5. 電子密度圖的計算和解釋。有了每個衍射點的相位，加上已經(jīng)收集到的每個衍射點的結構振幅，就可計算電子密度圖。由于蛋白質分子結構的復雜性，它的電子密度圖隨著分辨率的不同，從圖上能識別出的結構層次也不同。 6.結構模型修正。從電子密度圖上最初建立的蛋白質分子結構模型是比較粗糙的，需要進一步精華。第二十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二.核磁共振 核磁共振（Nuclear Magnetic Re

15、sonance即NMR）是處于靜磁場中的原子核在另一交變磁場作用下發(fā)生的物理現(xiàn)象。并不是是所有原子核都能產(chǎn)生這種現(xiàn)象，原子核能產(chǎn)生核磁共振現(xiàn)象是因為具有核自旋。原子核自旋產(chǎn)生磁矩，當核磁矩處于靜止外磁場中時產(chǎn)生能級分裂。在交變磁場作用下，自旋核會吸收特定頻率的電磁波，從較低的能級躍遷到較高能級。這種過程就是核磁共振。 第二十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 NMR技術即核磁共振譜技術，是將核磁共振現(xiàn)象應用于分子結構測定的一項技術 。對于孤立原子核而言，同一種原子核在同樣強度的外磁場中，只對某一特定頻率的射頻場敏感。但是處于分子結構中的原子核，由于分子中電子云分布等因素的影響，實際感

16、受到的外磁場強度往往會發(fā)生一定程度的變化，而且處于分子結構中不同位置的原子核，所感受到的外加磁場的強度也各不相同，這種分子中電子云對外加磁場強度的影響，會導致分子中不同位置原子核對不同頻率的射頻場敏感，從而導致核磁共振信號的差異，這種差異便是通過核磁共振解析分子結構的基礎。第二十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 原子核附近化學鍵和電子云的分布狀況稱為該原子核的化學環(huán)境，由于化學環(huán)境影響導致的核磁共振信號頻率位置的變化稱為該原子核的化學位移。耦合常數(shù)是化學位移之外核磁共振譜提供的的另一個重要信息，所謂耦合指的是臨近原子核自旋角動量的相互影響，這種原子核自旋角動量的相互作用會改變原子核

17、自旋在外磁場中進動的能級分布狀況，造成能級的裂分，進而造成NMR譜圖中的信號峰形狀發(fā)生變化，通過解析這些峰形的變化，可以推測出分子結構中各原子之間的連接關系。 第三十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 信號強度是核磁共振譜的第三個重要信息，處于相同化學環(huán)境的原子核在核磁共振譜中會顯示為同一個信號峰，通過解析信號峰的強度可以獲知這些原子核的數(shù)量，從而為分子結構的解析提供重要信息。表征信號峰強度的是信號峰的曲線下面積積分。另一個重要信息是NOE效應， 當分子內有在空間位置上互相靠近的兩個核A和B時，如果用雙共振法照射A，使干擾場的強度增加到剛使被干擾的譜線達到飽和，則另一個靠近的質子B的共

18、振信號就會增加，這種現(xiàn)象稱NOE。第三十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是由于二個核的空間位置很靠近，相互弛豫較強，當A受到照射達飽和時，它要把能量轉移給B，于是B吸收的能量增多，共振信號增大。這一效應的大小與核間距離的六次方成反比。 第三十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月NMR對蛋白結構的測定 要測定大分子物質就需要利用二維核磁共振以及多維核磁共振。一維核磁共振是在一個脈沖之后的t1時間進行數(shù)據(jù)收集，二維核磁共振在t1時間后再加一個脈沖后在t2時間內收集數(shù)據(jù)S（t1，t2），然后分別以t2和t1為變量進行傅立葉變換就得到二維譜S（w1，w2）。二維

19、譜就是把作為對角線的一維譜的峰進一步分開。第三十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 在生物學研究中最常用的是兩種譜：相關譜（correlated spectroscopy，COSY）和增強譜（Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy，NOESY）。COSY也有顯示J偶合的同核位移相關譜和異核自旋自旋偶合。如果已知蛋白質的一級結構中氨基酸殘基的連接順序，則通過COSY譜可以很容易地辨認出每個峰的歸屬。而NOESY譜是指兩個沒有自旋自旋耦合的核，若在空間距離上小于0.5nm時，輻照其中一個核使之飽和，另一個核的信號強度會增強而產(chǎn)生交叉峰。這種

20、交叉峰地面積大小與兩核間距的六次方成反比。因此可以利用這兩種譜，第一步COSY譜指認出產(chǎn)生共振峰的核，第二步是從J偶合和NOESY 譜確定的NOE值確定出二級結構的類型以及核間距離，根據(jù)核間距離構建出三級結構的模型。第三十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月三.紅外光譜和拉曼光譜 分子紅外光譜是由分子不停地作振動和轉動而產(chǎn)生的。分子振動是指分子中各原子在平衡位置附近作相對運動，多原子分子可組成多種振動模式。含N個原子的分子應有3N6個簡正振動方式；如果是線性分子，只有3N5個簡正振動方式。圖中示出非線性3原子分子僅有的3種簡正振動模式。分子的轉動指的是分子繞質心進行的運動。分子振動和轉

21、動的能量不是連續(xù)的，而是量子化的。當分子由一種振動（或轉動）狀態(tài)躍遷至另一種振動（或轉動）狀態(tài)時，就要吸收或發(fā)射與其能級差相應的光。 第三十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 第三十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 拉曼光譜指：當光穿過透明介質被分子散射的光發(fā)生頻率變化，這一現(xiàn)象稱為拉曼散射。在透明介質的散射光譜中，頻率與入射光頻率相同的成分稱為瑞利散射；頻率對稱分布在兩側的譜線或譜帶即為拉曼光譜，其中頻率較小的成分又稱為斯托克斯線，頻率較大的成分又稱為反斯托克斯線。拉曼光譜的理論解釋是，入射光子與分子發(fā)生非彈性散射，分子吸收頻率為0的光子，發(fā)射01的光子，同時分子從低能

22、態(tài)躍遷到高能態(tài)（斯托克斯線）；分子吸收頻率為0的光子，發(fā)射01的光子，同時分子從高能態(tài)躍遷到低能態(tài)（反斯托克斯線 )。 第三十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月偶極矩與極化度： 分子偶極矩可由鍵偶極矩經(jīng)矢量加法后得到（這里只涉及分子）。若將極性分子置于均勻的外電場中，分子將沿電場方向轉動，同時還會發(fā)生電子云對分子骨架的相對移動和分子骨架的變形，稱為極化。紅外光譜和拉曼光譜主要在外表上的區(qū)別就用“偶極矩與極化度”來解釋。 第三十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 紅外光譜和拉曼光譜對蛋白結構的測定 傅里葉變換-IR測量蛋白中功能基團和高極性鍵的振動。在其對蛋白二級結構測定中，最受關注的是酰胺基團中C=O鍵伸展的結構，同時伴隨著N-H C-N鍵的伸展，對氫鍵和二級結構敏感。 拉曼光譜常用于金屬蛋白，其生色團的電子躍遷配合金屬中心產(chǎn)生了更加強勁的基本拉曼效應。配基的振動模式被急劇加強，這對鑒定蛋白金屬中心的結構組織相當有用。第三十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月四 旋光光譜和圓二色光譜 旋光光譜：許多物質具有旋光性（又稱光學活性），如含有手性碳原子的有機化合物。當平面偏振光通過這些物質（液體或溶液）時，偏振光的振動平面向左或向右旋轉，這種現(xiàn)象稱為旋光。