蛋白質(zhì)表達(dá)與抗體制備

1、關(guān)于蛋白質(zhì)表達(dá)和抗體制備第一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月常用蛋白表達(dá)系統(tǒng)(host) 原核：大腸桿菌。真核：酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物、植物。第二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。優(yōu)越性：對(duì)大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識(shí)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解；商品化的載體和菌株種類非常齊全；表達(dá)效率高；易培養(yǎng)，成本低。缺點(diǎn)：因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；蛋白質(zhì)不能糖基化；其內(nèi)毒素很難除去。 第三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)越性：蛋白可糖基化，有相對(duì)正確的天然

2、結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中，實(shí)現(xiàn)高效率表達(dá)；表達(dá)載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。缺點(diǎn)：糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。第四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式。優(yōu)越性：重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA

3、的理想載體；可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可； 培養(yǎng)成本高。第五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用于表達(dá)高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：糖基化與人源蛋白一致；能表達(dá)天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性很高；可進(jìn)行分泌表達(dá)。缺點(diǎn)：表達(dá)量低；培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。第六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月植物表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)越性：能夠表達(dá)來自動(dòng)物、細(xì)菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)。易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。在基因表達(dá)與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)：不易提取與純化第七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月F

4、actors in E.coli protein expressionVectorStrainGrowth conditions第八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月原核表達(dá)載體眾多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融合表達(dá))等。各載體適應(yīng)的菌株也不盡相同pET(BL21(DE3)、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。對(duì)于我們來說，最常用和最需掌握的是pET表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體(Vector) 第九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Expression plasmid features第十張，PPT共三十二

5、頁，創(chuàng)作于2022年6月Lac operon第十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Induction of expression第十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月原核表達(dá)宿主菌名稱特征用途抗性DH5帶有recA endA突變的克隆菌株，由于DH5具有deoR變異，可以作為較大質(zhì)粒的宿主菌使用。常用的質(zhì)粒抽提工程菌株, 可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。無BL21lon和ompT蛋白酶缺陷型用于PGEX載體構(gòu)建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無BL21 (DE3)lon和ompT蛋白酶缺陷型，含有l(wèi)acI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7 RNA 聚合酶基因用于含有T7的pET系列載體構(gòu)

6、建質(zhì)粒的蛋白表達(dá)無BL21(DE3)-RP在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU和proL基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-RIL在BL21(DE3)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，具有額外拷貝的argU、ileY和leuW tRNA基因解決了表達(dá)富含AT的基因組蛋白密碼子偏倚性問題氯霉素BL21(DE3)-plysS帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。 pLysS 菌株在被誘導(dǎo)前T7 RNA聚合酶的基礎(chǔ)表達(dá)被抑制，這樣可以使表達(dá)會(huì)影響宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的重組體在宿主中更穩(wěn)定。帶有pLacI質(zhì)粒的宿主菌產(chǎn)生額

7、外的抑制pETBlue和pTriEx載體基礎(chǔ)表達(dá)的lac阻遏蛋白更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制，適合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表達(dá)。氯霉素BL21(DE3)- Rosetta-gami（Rosetta-gami）攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平，又具有thioredoxin reductase(trxB)和glutathione reductase(gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)補(bǔ)充7種

8、稀有密碼子，促進(jìn)蛋白可溶性及表達(dá)活性卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素Rosetta -Blue帶有recA endA lacIq突變的克隆菌株,高蛋白表達(dá), 補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA六種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA。補(bǔ)充稀有密碼子，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平氯霉素第十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosetta及Tuner都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。因此，目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株。BL21

9、(DE3)是用得最多的表達(dá)菌AD494 (DE3)和BL21trxB (DE3)具有trxB 突變，而Origami (DE3)，Origami B (DE3)和Rosetta-gami(DE3)菌株帶有trxB 和gor雙突變。擁有trxB 和gor突變的菌株比單具 trxB 突變的菌株更有可能促進(jìn)二硫鍵的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高多數(shù)氨基酸有不只一個(gè)密碼子，而不同的生物使用這61 種密碼子的偏好性不同。每種細(xì)胞里，tRNA種類和數(shù)量直接反映了其mRNA 使用密碼子的種類和數(shù)量的偏好性。當(dāng)外源目的基因mRNA 在E.coli里過表達(dá)，由于密碼子偏愛性不同，會(huì)因?yàn)槿狈δ撤N或某幾種tRNA

10、，直接導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)誤。tRNA不足會(huì)造成翻譯停頓，早期翻譯停止，移碼突變，和氨基酸錯(cuò)摻等問題。Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達(dá)的菌株。經(jīng)提高稀有tRNA 水平，這些蛋白的表達(dá)會(huì)大幅度提高。第十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 表達(dá)條件培養(yǎng)基抗生素誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時(shí)機(jī)誘導(dǎo)時(shí)間第十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月載體對(duì)表達(dá)的影響pET32,BL21(DE3),表達(dá)蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD)pET43,BL21(DE3),表達(dá)蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD)N I I I

11、M I p s p s M N I S PU:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation第十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月0.1mM IPTG,incubate for 16h at 160.1mM IPTG,incubate for 3h at 37 N I S P N I S P表達(dá)條件對(duì)表達(dá)的影響pET21,BL21(DE3)-RIL,表達(dá)的蛋白:His6-REIIBP(MW67KD)U:Uninduced crude extract

12、I:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation第十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 增加可溶性和折疊降低蛋白合成速率。溫度。裂解緩沖液的性質(zhì)。融合標(biāo)簽二硫鍵第十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月pET載體E.coli表達(dá)蛋白流程制備pET載體制備插入DNA將插入片段插入到pET載體上轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)/優(yōu)化表達(dá)目的蛋白放大實(shí)驗(yàn)純化目的蛋白第十九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白抗體制備第二十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月多克隆抗體：由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的

13、抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同抗原決定簇的抗體的混合物，即多克隆抗體。單克隆抗體：由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。用具備這種特性的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對(duì)一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。第二十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月?lián)墨I(xiàn)及DNAstar軟件分析，確定各蛋白最可能抗原區(qū)序列，Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，從基因組，

14、擴(kuò)增目的基因。克隆至pET28a載體上。轉(zhuǎn)化至DH5a中，經(jīng)PCR驗(yàn)證重組子。重組子質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株中，進(jìn)行小量誘導(dǎo)表達(dá)，確認(rèn)最適條件后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，提取大腸桿菌包涵體，溶菌酶處理，添加去垢劑，超聲破碎后，溶于8M Urea中，經(jīng)鎳柱層析咪唑洗脫，過夜透析，無菌過濾后，免疫家兔，通過化學(xué)發(fā)光Western印跡確定多克隆抗血清的效價(jià)。第二十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原基因構(gòu)筑 ：通過設(shè)計(jì)的抗原序列aa的個(gè)數(shù)，加上載體上含組氨酸標(biāo)簽序列的42aa，計(jì)算是否達(dá)到抗體注射免疫家兔的要求（17-25kDa之間）第二十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月

15、誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白 ：PCR驗(yàn)證基因產(chǎn)物是否插入載體。轉(zhuǎn)化至DH5a中測(cè)序，再轉(zhuǎn)化至BL21中小量誘導(dǎo)表達(dá)各蛋白。探索蛋白表達(dá)最合適的條件，如溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度。 0h 2h 4h 6h第二十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大量誘導(dǎo)表達(dá)，分離包涵體 ：過夜培養(yǎng)25ml菌液，在5：1 的錐形瓶:培養(yǎng)基中按1：50比例加入過夜菌液，30-35 ，0.4mM IPTG ，按上述優(yōu)化條件大量誘導(dǎo)表達(dá)靶蛋白。5000g,15min,棄上清，加入Binding buffer (-Urea,20mM PBS(pH 7.8),500mM NaCl)懸浮菌液。加入lysozyme（溶菌酶）至終

16、濃度1mg/ml，室溫放置30min。加入1% Triton-X-100，冰中放置10min。超聲破碎120W，4s，間隔4s,5min。 上清另存用于檢測(cè)。用Binding buffer (-Urea)懸浮洗滌可溶性雜蛋白。上清另存用于檢測(cè)。沉淀用Binding buffer (+8M Urea)懸浮。取少量上清檢測(cè)。其于凍存用于純化。 control第二十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月靶蛋白純化 :0.45um 濾器(whatman)去除細(xì)菌蛋白碎片，以利于進(jìn)行組氨酸標(biāo)簽表達(dá)蛋白的鎳柱層析純化。對(duì)蛋白進(jìn)行定量（牛血清白蛋白法）。 第二十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年

17、6月鎳柱層析 :層析柱（(Poly-Prep Chromatography Column, BIORAD)中加入1.5ml 50% Ni-NTA His Bind Resin，自然沉降，無菌水沖洗，3ml binding buffer(+8M Urea )平衡。（流速10ml/h）6ml （至少3ml）binding buffer(+8m Urea)洗柱，4ml washing buffer(20mM PBS, pH 6.0, 500mM NaCl,8M Urea)洗柱 。6ml 10mM (binding buffer +),50mM,100mM, 150mM,200mM buffer依次洗

18、柱，洗脫靶蛋白。5ml無菌水沖洗。3 ml Binding buffer (+8M Urea )平衡。保留2ml Binding buffer (+8M Urea)于柱中，保存于4。 層析后蛋白樣品需經(jīng)過透析使Urea濃度8M降至2M，和中性條件(pH 7.2, PBS)原理：His標(biāo)簽是蛋白質(zhì)重組技術(shù)中經(jīng)常用到的一種標(biāo)簽，其序列為六個(gè)組氨酸HHHHHH， 其特點(diǎn)是分子量小，基本不改變蛋白質(zhì)的生物結(jié)構(gòu)，不改變蛋白質(zhì)的溶解性，更重要的是它使蛋白質(zhì)的純化變得極為方便，根據(jù)組氨酸上的咪唑環(huán)可以與二價(jià)金屬離子結(jié)合的原理，人們可以利金屬離子親和層析技術(shù)純化帶有His標(biāo)簽的蛋白，即將含有目的蛋白的裂解液通過