TSS法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

1、TSS法制備感受態(tài)取感受態(tài)種子接種于含有LB的2ml試管中，37度振蕩培養(yǎng)將上述培養(yǎng)液用LB按1：100稀釋后，37度振蕩約3h（OD為0.50.03）把培養(yǎng)物放在冰上冷卻后，2500rpm4度離心10min,收集菌體，棄上清使用前準(zhǔn)備好1XTSS（10%W/VPEG3350,50mMMgCl2,85%LB）將收集到的菌體重懸于1XTSS（每100ml培養(yǎng)物溶解于10ml的1XTSS）,混勻。注意保持冰上操作用1.5mlEP管冰上分裝，100UL/管，先放在液氮中速凍一下，后放于-70保存20ml1xTSS：LB19mlMgCl220.2033gPEG33501.9g將LB和PEG3350混合

2、后過(guò)濾（0.22）除菌加DMSO1ml用前冰浴，4度保存TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌（一步法制備感受態(tài)細(xì)菌）TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌（又稱一步法）一、準(zhǔn)備工作1、緩沖液1XTSS的配制：事先配制1M的氯化鎂20.3g氯化鎂（6分子水結(jié)晶）/定容于100ml去離子水后封裝，不用滅菌。取干凈的100ml量筒和100ml燒杯，用量筒量取100ml去離子水，加入至燒杯中，取1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化鈉，10gPEG（MW=3350）,5mlDMSO，5ml的1M氯化鎂，溶解后用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)整pH為6.5，混勻后用0.22um濾器過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存在4度，保質(zhì)期約6個(gè)月。2、已劃平板（或

3、者用槍頭沾取并稀釋后涂布）并在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)的菌種一一Dh5a，用于接種并振蕩培養(yǎng)。兩個(gè)錐形瓶，分別裝有30ml和50mlLB，滅菌后置于4C冰箱備用。3、若干已滅菌的瓊脂平板，一個(gè)未加抗生素，用于第二步的接種。其余做轉(zhuǎn)化用。二、感受態(tài)制備程序：1、前一天晚上調(diào)單菌落至30mlLB中過(guò)夜培養(yǎng)（12-16h），按1：100比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液（500ul）加入到新鮮的50mlLB培養(yǎng)液中，于37C振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4（培養(yǎng)時(shí)間2h4050min）。冰浴30分鐘后4度1000g離心10min,棄上清，收獲細(xì)菌。加入原體積十分之一（這里為5ml）的1XTSS液（冰預(yù)冷）懸浮細(xì)胞，然后分裝

4、成100ul/份，全部冰上操作，一80度保存。三、轉(zhuǎn)化時(shí)取一管（100ul）感受態(tài)細(xì)菌，（凍寸細(xì)胞應(yīng)置于冰上緩慢融化后立即使用）加入3-5ulDNA（0.1lOOng），輕輕混勻后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液，37度150r/min溫和振蕩培養(yǎng)60min，涂布，室溫放置約20分鐘后放于37度恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)（17-20h）。制備高效率感受態(tài)的方法BIOX.CN2005-4-1523:40:00來(lái)源：丁香園液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLIDH5,JM109,HB101等，在LB平板上劃線，37度過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè)

5、,接種到250毫升/3升錐形瓶或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基.培養(yǎng)基量不可再多，會(huì)影響效率.在18度150-250RPM培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒(méi)有冷卻搖床的可在室溫，但不可高于37度.0D600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng)，放在冰水中冷卻10分鐘4度，300RPM離心15分鐘，回收菌體去掉上清后，用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮，在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮，添加最終濃度為7%的DMSO,再冷卻10分鐘0.1-1毫升分裝，直接在液氮中凍上.在液氮或-80度保存.TB溶液TRANSFORMATIONBUFFERPIPES3.0G10mMCaCl2.2H2O2.2g15

6、mMKCl18.6g250mMaddwaterupto950ml用5NKOH調(diào)PH至6.7-6.8*低PH不溶在加終濃度未55mM的MnCl2.4H2O10.9g定溶到1升，過(guò)濾滅菌，4度保存.但有人提出，凍存后轉(zhuǎn)化效率降低，且這種方法不適合大質(zhì)粒.【zihudie】（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37C培養(yǎng)活化。（2）挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18C,200-250rpm培養(yǎng)。（3）當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí)，用預(yù)冷的40mL離心管于4C,8000rpm離心10min，收集菌體。（4）用預(yù)冷的TBBuffer重懸菌體，4C,8000rpm離心10min

7、，收集菌體。重復(fù)第4步操作。用8mL預(yù)冷的TBBuffer重懸菌體，緩慢加入DMS0至終濃度7%。冰浴1Omin后，分裝保存于液氮中。本法效率極高，建議大家采納【yog】單菌落2mlLB37度120RPM過(guò)夜1%轉(zhuǎn)接37度200RPM2小時(shí)(OD到0.40.5)2ml,冰浴15min,4度，6000RPM5min,棄上清，懸浮于1ml0.1MCaCl2中，冰浴20min4度，6000RPM10min,重懸浮于200ul0.1MCaCl2中，冰浴30min建議用TSS法，簡(jiǎn)單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高別的菌可能不一定適用。以下為轉(zhuǎn)貼，具體方法請(qǐng)最好查閱文獻(xiàn)。E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法：?jiǎn)尉?/p>

8、落平板至2mlLB,37oC250r/movn,1ml轉(zhuǎn)至50mlLB,37oC250r/m至A600=0.2-0.4離心后用10毫升TSS重懸后，分裝-70oC保存。盡量冰上操作.轉(zhuǎn)化：加質(zhì)粒(5ul/100ulcell)后冰上30分鐘，42oC90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml,37oC1小時(shí)后鋪抗生素平板。TSS:7.0mlpH6.1LB2.0ml50%PEG60000.5MLdmso0.2MLMg2+(0.1ml1mol/lMgCl2and0.1ml1mol/lMgS04)0.3mlddH20高效感受態(tài)細(xì)胞制備t-70劃出保存菌株，于13平板上37兀培養(yǎng)過(guò)夜；用玻璃環(huán)挑取24個(gè)直徑2mm左右的菌落，接種至50mlSOB培養(yǎng)基中.1祐咒劇烈震蕩培養(yǎng)(20025Ormin),到0%j為0.6左右；三角瓶放置冰上10rnig預(yù)冷后*將菌液轉(zhuǎn)移到同樣預(yù)冷的離心管中,43500g離心10