葉綠體色素的提取和分離

1、葉綠體色素的提取和分離基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（三）1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、進(jìn)一步理解葉綠體色素的提取、分離的原理、方法； 2、了解葉綠素的光學(xué)特性在光合作用中的意義； 2二、實(shí)驗(yàn)原理 葉綠體色素是植物吸收太陽光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，主要由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。它們與類囊體膜相結(jié)合成為色素蛋白復(fù)合體。這兩類色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。提取液可用色譜分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動相）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動速度不同，經(jīng)過一定時間后，可將各種色素分開。 3 當(dāng)葉綠素分

2、子吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)時，分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時發(fā)射出紅光量子，稱為螢光現(xiàn)象。葉綠素是一種二羧酸葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，因而可與堿起皂化作用，產(chǎn)生的鹽可溶于水中，利用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開。4 葉綠素分子中的鎂可被 H + 所取代而形成褐色的去鎂葉綠素。后者遇銅則形成綠色的銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易被破壞，故常用此法制做標(biāo)本；葉綠素分子的化學(xué)性質(zhì)也很不穩(wěn)定，易受強(qiáng)光破壞，特別是當(dāng)葉綠素與蛋白質(zhì)分離后，破壞更快。 5三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備 （一）實(shí)驗(yàn)材料 新鮮植物葉片。 （二）試劑 95乙醇（或丙酮）、碳酸鈣、石英砂、汽油（純凈無色的）、苯、醋酸銅粉末、50

3、醋酸、氫氧化鉀甲醇溶液： 20g 氫氧化鉀用 100 mL 甲醇溶解，盛在具塞的試劑瓶中、醋酸銅醋酸溶液：用50醋酸100mL溶入醋酸銅6g，時加蒸餾水4倍稀釋。 （三）儀器設(shè)備 天平，剪刀，研缽，漏斗，培養(yǎng)皿一套（底和蓋直徑相同），蒸發(fā)皿，濾紙條（2cm5cm左右），圓形濾紙，蒸發(fā)皿，電熱吹風(fēng)機(jī)，小燒杯，試管，酒精燈，鐵三角架，石棉網(wǎng)，移液管，滴管，玻棒。 6四、操作步驟 1、 葉綠體色素的提取和熒光現(xiàn)象的觀察稱取菠菜或其他植物新鮮葉片23g，去掉中脈剪碎，放入研缽中，加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加5mL95乙醇，研磨成勻漿，再加5mL95乙醇，提取35 min，過濾于試管中，再用3mL95乙

4、醇沖洗殘?jiān)?。對濃的葉綠體色素提取液觀察透射光和反射光的顏色，解釋其原因。 72、 葉綠體色素的分離 (1) 取一張圓形濾紙（最好用色層析濾紙剪成圓形）。在濾紙的圓心戳一圓形小孔，另取一張濾紙條（2cm5cm左右，紙條的寬度主要根據(jù)培養(yǎng)皿的高度確定）。用滴管吸取濃葉綠素提取液滴在紙條的一邊，使色素?cái)U(kuò)展的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，用電熱吹風(fēng)機(jī)吹干后，再重復(fù)操作數(shù)次，然后將紙沿著長度的方向卷成紙捻，這樣浸過葉綠體色素的一邊恰在紙捻的一端。 (2) 將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，與濾紙剛剛平齊（勿突出）。 8 在培養(yǎng)皿中放蒸發(fā)皿，蒸發(fā)皿內(nèi)加入適量汽油和23滴苯，將插有紙捻的圓形濾紙平放在培

5、養(yǎng)皿上，使濾紙的下端（無色素的一端）浸入汽油中，迅速用同一直徑的培養(yǎng)皿蓋上。此時，葉綠體色素在推動劑的推動下沿著濾紙向四周移動，不久即可看到被分離的各種色素的同心圓環(huán)。 (4) 待汽油將要到達(dá)濾紙邊緣時，取出濾紙，待汽油揮發(fā)后，用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置和名稱。 93、 葉綠體色素的其他理化性質(zhì) 將本實(shí)驗(yàn)步驟1中提取的葉綠體色素溶液用95乙醇稀釋一倍，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)： (1)皂化作用（葉綠素與類胡蘿卜素的分離） 用移液管吸取葉綠體色素提取液5mL于試管中，加入1.5mL20氫氧化鉀甲醇溶液，充分搖勻。片刻后，加入5mL苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1.5mL蒸餾水，輕輕混勻（不要激烈搖蕩），靜置在試

6、管架上，可看到溶液逐漸分為兩層，下層是稀乙醇的溶液，其中溶有皂化葉綠素a和b,上層是苯溶液，其中溶有胡蘿卜素和葉黃素。 10(2) H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代作用 取2支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2mL，作為對照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5mL，再加入數(shù)滴50醋酸，搖勻，觀察溶液的顏色變化。 當(dāng)溶液變褐色后，倒出一半于另一試管中，加入醋酸酮粉末少許，于酒精燈上微微加熱，觀察溶液的顏色變化，與未加醋酸銅的一半相比較。 另取醋酸銅溶液20mL 左右，加入于燒杯中。取新鮮植物葉片2片，放入溶液中，用酒精燈緩緩加熱，觀察并記錄葉片的顏色變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因

7、。 11（ 3）光對葉綠素的破壞作用 取4支小試管，其中兩支各加入5mL 用水研磨的葉片勻漿，另外兩支各加入2.5mL葉綠體色素乙醇提取液，并用95乙醇稀釋1倍。 取1支裝有葉綠體色素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片勻漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對比觀察顏色有何變化，解釋其原因。 另取本實(shí)驗(yàn)中用圓形濾紙層析分離成的色譜一張，通過圓心裁成兩半，一半放在直射日光下，另一半放在暗中，半小時后比較兩張色譜上的四種色素的顏色各有何變化。 12四、注意事項(xiàng) 1、葉綠體色素對光、溫度、氧氣環(huán)境、酸堿及其它氧化劑都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低溫及無酸堿等干擾的情況下進(jìn)行。乙醚使用前應(yīng)重蒸除去過氧化物。 2、使用低沸點(diǎn)易揮發(fā)有機(jī)溶劑要注意實(shí)驗(yàn)室安全。實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件，不得靠近明火操作。 3、提取液不宜長期存放，必要時應(yīng)抽干沖氮避光低溫保存。 13五、思考與問題 1、什么是光合作用？ 2、試討論葉綠素、-胡蘿卜素的生理意義及實(shí)際應(yīng)用。 3、 綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？ 4、一般天然產(chǎn)物的提取方式有哪些？殘余的植物組織應(yīng)如何除去？ 5、用乙醇-石油醚提取和用丙酮提取可能對結(jié)果產(chǎn)生什么影響？ 14六、注意事項(xiàng) 提取到的葉綠素先觀察是否