酶細(xì)胞原生質(zhì)體固定化

1、關(guān)于酶細(xì)胞原生質(zhì)體的固定化第一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo第二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo固定化生物技術(shù) 通過化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用。第三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo游離酶的缺點1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）。2.不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.分離純化困難。第四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 第一節(jié) 酶與細(xì)胞的固定化一、固定化酶和固定化細(xì)胞的定義及特點 1.固

2、定化酶(immobilized enzyme) 固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。第五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo優(yōu)點：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。缺點：(1)存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。第七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 2. 固定化細(xì)胞（immobilized cell） 固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活

3、動（生長、繁殖、新陳代謝）的細(xì)胞。第八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 優(yōu)越性： (1)降低成本，省去酶的分離純化工作; (2)既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系 完成部分代謝過程。 局限性：(1)細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副 產(chǎn)物。(2)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制 作用。第九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 3.固定化原生質(zhì)體 意義：(1)固定化原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。(2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性提高。第十張，PP

4、T共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 二、固定化方法固定化方法（一）酶的固定化方法吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法 第十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1.吸附法（adsorption）第十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 根據(jù)吸附劑的特點分: 1）物理吸附法（physical adsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、 硅膠、羥基磷灰石、纖維素等

5、。2）離子結(jié)合法（ion binding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM- 纖維素第十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。第十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。2.共價偶聯(lián)法（covalent binding or covalent coupling） 第十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 1）載體：親水載體優(yōu)于疏水載體 如:天然

6、高分子衍生物: 纖維素 葡聚糖凝膠 親和性好，機械性能差 瓊脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 機械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu) 尼龍第十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo2）偶聯(lián)方法：偶聯(lián)成功與否取決于：載體：功能基團(tuán)：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側(cè)鏈非必需基團(tuán)：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。第十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 常用的偶聯(lián)反應(yīng)有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反應(yīng)

7、條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。 第十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo3.交聯(lián)法（crosslinking） 借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第二十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。 此法與共價偶聯(lián)法利用的均是共價鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。 第二十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在

8、分子內(nèi)。 酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。第二十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 缺點：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。 第二十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo4. 包埋法（entrapment） 將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第二十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Log

9、o1）網(wǎng)格型包埋法（gel (lattic) entrapment） 又稱凝膠包埋法凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應(yīng)部分失活高使用的多孔載體及其特點第二十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo海藻酸鈣凝膠包埋法： 滴至海藻酸鈉溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜膠包埋法： 滴至角叉菜膠E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED第二十六

10、張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo2）微囊型包埋法（microencapsulation） 又稱半透膜包埋法 將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi) 。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。 半透膜孔徑80%活性。第四十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo （三）酶的最適溫度 最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。 多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。 （四）酶的最適pH 帶負(fù)電荷載體 ：最適pH 向堿性偏移。 帶正電荷載體 ：最適pH 向酸性偏移。第四十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Lo

11、go 固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加。（五）酶的動力學(xué)特征第四十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生改變。（六）酶的作用專一性 第四十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 與固定化酶相比，固定化細(xì)胞的情況比較復(fù)雜。 （1）有活性升高的現(xiàn)象。（2）穩(wěn)定性的增加 。（3）最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細(xì)胞的性質(zhì) 第四十六張，PPT共七

12、十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo (一)酶(細(xì)胞)的活力 固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進(jìn)后才能用于測定固定化酶。 (二) 蛋白總量 1.雙辛可寧酸法(BCA法) 2.考馬斯亮藍(lán)法 三、固定化酶（細(xì)胞）的評價指標(biāo) 第四十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo (三)偶聯(lián)率及相對活力 偶聯(lián)率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收=固定化酶總活力/加入酶的總活力100%相對活力=固定化酶總活力/ (加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)100%第四十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Comp

13、any Logo (四)半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細(xì)胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。 是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標(biāo)。第四十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D Ala第三節(jié) 固定化酶與固定化細(xì)胞的應(yīng)用 一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 1. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第五十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala

14、A-D-Ala第五十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 2.葡萄糖異構(gòu)酶 世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應(yīng)用最為成功的一種固定化酶。第五十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo二、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 1. 消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。第五十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo2. 人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固

15、定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第五十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo第五十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo酶傳感器 固定化酶和電化學(xué)傳感器的結(jié)合。 優(yōu)點：既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學(xué)電極的高靈敏度；酶的專一反應(yīng)性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測定。 三、在分析檢測中的應(yīng)用第五十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company LogoSensitive and specific Rapid SimpleBiosensor第五十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company

16、 Logo 1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個生物傳感器葡萄糖氧化酶電極。第五十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 葡萄糖酶電極 酶電極示意圖D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5內(nèi)酯H2O2半透膜酶膠層感應(yīng)電極第五十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company LogoGlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以

17、用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。 第六十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo繼酶傳感器（enzyme sensor）后，又出現(xiàn)：細(xì)胞器傳感器（cell organelle sensor）組織傳感器（tissue sensor）微生物傳感器（microbe sensor）免疫傳感器（immunosensor）第六十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo1）酶傳感器的原理生物傳感器 由生物識別單元（如酶、微生物、抗體等）和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。第六十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company

18、 Logo第六十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo生物識別元件(Biological recognition element) 是酶、抗原(體)、細(xì)胞器、組織切片和微生物細(xì)胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力。第六十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo 換能器(Transducer) 將識別元件上進(jìn)行的生化反應(yīng)中消耗或生成的化學(xué)物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，并呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系。第六十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo第六十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)

19、作于2022年6月Company Logo酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別”并催化被檢測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；變換器：把催化反應(yīng)中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，通過儀表顯示出來。第六十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo第六十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo2）酶傳感器的應(yīng)用 水質(zhì)監(jiān)測 用化學(xué)法測定酚時，硫化物、油類等可干擾其測定。 從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成酚傳感器，可檢測大多數(shù)酚類化合物。第六十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月C

20、ompany Logo德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀第七十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測定儀 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖傳感器，可測定血液中葡萄糖濃度。 第七十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第七十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月Company Logo食品鮮度魚鮮度傳感器 在日本、加拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。鮮度可用K值表示：K=肌苷+次黃嘌呤/ ATP +ADP+AMP+IMP +