酶改造方法進(jìn)展

1、關(guān)于酶的改造方法進(jìn)展第一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要進(jìn)行酶改造？溫和的自然體系：常溫、常壓、中性pH、水環(huán)境極端的工業(yè)體系：高溫、高壓、酸、堿、有機(jī)溶劑酶不適應(yīng)第二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的改造方法 酶的化學(xué)修飾-分子修飾 酶的物理修飾-固定化 酶的生物改造-定向進(jìn)化 酶的人工模擬-抗體酶第三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶的化學(xué)修飾B通過制備酶單分子納米凝膠，大大提高了酶的穩(wěn)定性第四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶分子修飾主要方法 金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾 第五張，PPT共六

2、十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1）金屬離子置換修飾實(shí)例 SOD的金屬離子置換： 天然SOD中的鐵原子被錳原子取代后，重組酶對(duì)H2O2的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，對(duì)NaH3的抑制作用的敏感型顯著降低。 氨基酸?；傅慕饘匐x子置換： 氨基酰化酶的鋅被鈷取代后，底物專一性和最適pH都有改變，鋅酶對(duì)N-乙酰丙氨酸的最適pH是8.5,而鈷酶是7.0.第六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2）酶大分子修飾的實(shí)例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，酶的催化效率提高2.25倍； 用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇對(duì)菠蘿蛋白酶進(jìn)行修飾，在55的穩(wěn)定性比未修飾的提高38%；尿激酶采用聚乙二醇5000修飾，在兔體內(nèi)的半

3、衰期延長913倍；超氧化歧化酶采用聚乙二醇修飾后半衰期延長70350倍；L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇修飾后，抗原性顯著降低，1994年經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)成為治療急性白血病的藥物使用第七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3）側(cè)鏈基團(tuán)修飾的實(shí)例用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽鏈中的Lys殘基上的-NH2脫氨變成-OH，酶的半衰期延長2倍；葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)琥珀?；揎椃踊螅钸mpH下降0.5，穩(wěn)定性增加，更有利于果葡糖漿生產(chǎn)；用O-甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中的Lys殘基上的-氨基結(jié)合屏蔽，穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)；枯草桿菌蛋白酶的第104位Tyr上的酚羥基經(jīng)四硝基甲烷修飾后，生成3-硝基酪

4、氨酸殘基，使酶對(duì)帶正電荷的底物結(jié)合能力顯著增強(qiáng)；第八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 4）肽鏈有限水解修飾實(shí)例第九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月5）氨基酸置換修飾實(shí)例 Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。 評(píng)價(jià)：化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)展趨勢(shì)：定點(diǎn)突變 通過定點(diǎn)突變技術(shù)把農(nóng)桿菌-葡萄糖苷酶催化中心的第358位L-GluL-Ala，使親核的羧基

5、甲基，結(jié)果使該酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成第十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶分子修飾的發(fā)展趨勢(shì)大分子修飾研究最為成功，尤其是聚乙二醇修飾；酶的側(cè)鏈基團(tuán)修飾已經(jīng)成為酶結(jié)構(gòu)研究的重要手段；更為精細(xì)的酶?jìng)?cè)鏈修飾往往和結(jié)構(gòu)生物學(xué)緊密相關(guān)；第十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酶的物理改造-固定化 載體固定化：納米材料、樹脂、水凝膠、殼聚糖等 無載體固定化：細(xì)胞表面自固定化、酶聚集體等第十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月10mL 淀粉葡萄糖苷酶(350g/mL)與30mg 殼聚糖混合，在室溫放置1h，不時(shí)攪拌，在4過夜，過濾，用600mL 蒸餾水洗滌, 過

6、濾即得殼聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；第十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月海藻酸鈉先加熱配成溶液，取一定量堿性蛋白酶溶液和海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻后用蠕動(dòng)泵將混合液滴入2%的CaCl2 中形成凝膠珠，放入4 冰箱硬化4h，得到海藻酸鈉微球。卡拉膠加熱配成一定的濃度, 50 水浴保溫 , 加入乳糖酶溶液，均勻攪拌后冷卻，4 冰箱中硬化，得到塊狀固定化酶；第十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶與1.5%的海藻酸鈉溶液充分混和，通過針頭滴入1.1%氯化鈣溶液中，形成珠狀的海藻酸膠顆粒。凝膠珠用0.5%的聚賴氨酸處理，再經(jīng)0.1%的2-N-環(huán)已胺乙基磺酸處理，用生理鹽水洗滌，再

7、以0.05mol/L的檸檬酸鈉水溶液液化微囊內(nèi)海藻酸鈣，得到近乎透明的微囊化的固定化酶。第十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月DEAE-纖維素固定蟲漆酶 CM-纖維素酶固定蟲漆酶 第十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠或樹脂等載體上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。交聯(lián)包埋法：把酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的集合體，然后用高分子或多糖一類物質(zhì)進(jìn)行包埋成顆粒。制得的固定化酶穩(wěn)定性好；第十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體 L-AlaL-Ala A-D-

8、AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化氨基酰化酶制備L-丙氨酸世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶固定化的發(fā)展趨勢(shì)載體新材料層出不窮 介孔材料、納米材料，磁性材料，大孔材料等；固定化方法日新月異 定向固定，微囊化固定，酶聚集體，靜電紡絲等；酶的結(jié)構(gòu)與性能研究是熱點(diǎn) 結(jié)構(gòu)模擬與計(jì)算等；第十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、酶的生物改造-定向進(jìn)化 自然界酶的進(jìn)化是極其緩慢的，無法適應(yīng)工業(yè)過程的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，人們可以在試管內(nèi)利用幾周時(shí)間完成自然界幾萬年的進(jìn)化過程自然進(jìn)化誘變育種定向進(jìn)化上萬年幾年到十多年幾個(gè)月第二十張

9、，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的定向進(jìn)化技術(shù)發(fā)展歷程生物催化劑進(jìn)化方法發(fā)展歷程隨機(jī)和定點(diǎn)突變定向進(jìn)化計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)基于序列-功能關(guān)系與統(tǒng)計(jì)模型的理性進(jìn)化第二十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)穩(wěn)定性活性有機(jī)溶液中的活性不同的底物的利用酸堿度蛋白質(zhì)的表達(dá)親和性 專一性1234性能代數(shù)達(dá)到目的隨機(jī)突變隨機(jī)雜交篩選目標(biāo)蛋白酶定向進(jìn)化的過程和應(yīng)用范圍第二十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶定向進(jìn)化的典型例子枯草桿菌蛋白酶E熱穩(wěn)定性的分子進(jìn)化第二十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月進(jìn)化后的枯草桿菌蛋白酶E在60%的DMF中酶催化效率提高157倍，最適溫度

10、提高17正面反面第二十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)硝基苯酯酶的分子進(jìn)化(Lori Giver等，1998）（在30%的DMF中酶催化活性提高100倍）第二十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月-葡糖苷酶耐熱性的提高(Mara Jesu s Arrizubieta等，2000）第二十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶定向進(jìn)化的基本過程隨機(jī)突變 不同的定向進(jìn)化方法構(gòu)建突變基因文庫 載體的選擇，基因重組，組建基因文庫突變基因的篩選 平板篩選法，熒光篩選法，表面展示法 第二十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月隨機(jī)突變方法：定向進(jìn)化的核心無性進(jìn)化方法：易錯(cuò)

11、PCR法，盒式誘變有性進(jìn)化方法 1）DNA改組法（DNA Shuffling) 2）體外隨機(jī)重組法（RPR) 3）交錯(cuò)延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進(jìn)化第二十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月易錯(cuò)PCR方法第二十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月有性進(jìn)化：DNA改組方法（1994，Stemmer)第三十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月有性進(jìn)化：體外隨機(jī)重組法（1998，Arnold)第三十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月有性進(jìn)化:交錯(cuò)延伸法（1997，Arnold)第三十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基因家族的同源重

12、組無性進(jìn)化方法：易錯(cuò)PCR法，盒式誘變有性進(jìn)化方法 1）DNA改組法（DNA Shuffling) 2）體外隨機(jī)重組法（RPR) 3）交錯(cuò)延伸法(StEP)基因家族的同源重組外顯子的改組雜合進(jìn)化第三十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基因突變庫的篩選方法目標(biāo) 根據(jù)定向進(jìn)化要求，在一定的環(huán)境要求下進(jìn)行篩選，從突變基因文庫中得到所需的突變基因。難點(diǎn) 突變庫容量大，一般達(dá)到106，工作量巨大關(guān)鍵 高通量篩選：通量大，效率高方法 平板篩選法，熒光篩選法，噬菌體表面展示法，細(xì)胞表面展示法第三十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月平板篩選方法依據(jù)細(xì)胞生長情況篩選熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)

13、境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性： pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質(zhì)第三十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月平板篩選方法依據(jù)顏色變化篩選大腸桿菌-半乳糖苷酶基因顯色：噬菌體DNA載體（藍(lán)色）反應(yīng)產(chǎn)物顯色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚脂肪酶篩選海因酶篩選第三十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月平板篩選方法依據(jù)透明圈大小篩選淀粉酶的進(jìn)化：淀粉平板培養(yǎng)基豆鼓纖溶酶的進(jìn)化：血纖維蛋白培養(yǎng)基第三十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光篩選方法利用自身熒光激發(fā)特性 生成產(chǎn)物本身是具有熒光激發(fā)特性的物質(zhì)利用熒光報(bào)告基因辣根過氧化合物酶和單加氧酶的融合基因

14、： 原理：萘萘酚醌類化合物（能激發(fā)熒光）綠色熒光蛋白基因：獲2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 第三十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月綠色熒光蛋白的應(yīng)用 分子標(biāo)記： FISH分析菌株（a）未加探針；（b）DAPI染色（c）-探針雜交（d）Msint-1268探針雜交菌株Y1；（e）Msint-1268探針雜交M. trichosporium OB3b第三十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體顯示篩選模式第四十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月噬菌體顯示的幾種類型第四十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月核糖體顯示技術(shù)第四十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6

15、月RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)第四十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA-蛋白質(zhì)的融合第四十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶定向進(jìn)化的發(fā)展趨勢(shì)定向進(jìn)化方法發(fā)展迅猛 方法均有知識(shí)產(chǎn)權(quán)；方法更有針對(duì)性和特征性；高通量篩選方法是關(guān)鍵 新方法（熒光顯示/表面展示）在涌現(xiàn)，技術(shù)交叉是趨勢(shì)；定向進(jìn)化是近20年中最成功的酶改造方法 新的實(shí)例越來越多；第四十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶對(duì)熱，酸，堿以及有機(jī)溶劑的不穩(wěn)定性，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。四、酶的人工模擬模 擬 酶 -模擬酶的生物催化功能，用化學(xué)半合成法或化學(xué)全合成法合成的酶。固 定 化 酶 -結(jié)合到特定的支持物

16、上并能發(fā)揮作用的一類酶。第四十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)酶的作用原理來模擬酶的活性中心和催化機(jī)制，用化學(xué)方法制成的高效、高選擇性、結(jié)構(gòu)較簡單、穩(wěn)定性較高的新型催化劑。模擬酶利用現(xiàn)有的酶或蛋白質(zhì)做母體，引入相應(yīng)的催化機(jī)團(tuán)，形成酶的化學(xué)修飾物。以合成的高分子聚合物為母體，根據(jù)酶的活性部位結(jié)構(gòu)，連接上所需的功能機(jī)團(tuán)或金屬配合物。第四十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月主客體酶模型：環(huán)糊精、冠醚等；膠束酶模型;肽酶；抗體酶：分子印跡酶；半合成酶；雜化酶;模擬酶的分類第四十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月環(huán)糊精模擬酶?jìng)?cè)鏈上接上羥基、咪唑基和羧基，模擬胰凝乳蛋白

17、酶結(jié)果：催化對(duì)叔丁基苯乙酸酯的水解速度比天然酶一倍第四十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分子印跡模擬酶實(shí)例模擬結(jié)果：以R-1-苯乙醇與月桂酸的酯化反應(yīng)為模型反應(yīng)，獲得了高效的非水相脂肪酶，印跡酶在有機(jī)相中對(duì)新構(gòu)象的記憶時(shí)間達(dá)幾周，極大提高了脂肪酶的對(duì)映體選擇性。第五十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體酶抗體的特性1） 蛋白質(zhì)特性2） 能高選擇配體，專一性與抗原結(jié)合3） 種類達(dá)千萬種酶的特性1） 大部分為蛋白質(zhì)2） 能高選擇性結(jié)合底物，催化反應(yīng)高效進(jìn)行 1.抗體酶的理論基礎(chǔ)第五十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月

18、12第五十三張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體酶催化的應(yīng)用實(shí)例重排反應(yīng)模擬結(jié)果：以椅式構(gòu)象的氧雜雙環(huán)化合物為反應(yīng)的過渡態(tài)類似物，制備了催化分支酸為預(yù)苯酸的抗體酶，比原反應(yīng)速度快102-104倍，而且僅催化（）分支酸。第五十四張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月縮合反應(yīng)第五十五張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)酯基反應(yīng)第五十六張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酰胺鍵的形成第五十七張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酯解反應(yīng)第五十八張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月胺解和脫羧反應(yīng)第五十九張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月消除和金屬取代反應(yīng)第六十張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體酶的發(fā)展前景抗體酶已成為研究酶的作用機(jī)制的一個(gè)有力的工具?？贵w酶的研究過程中，可以直接觀察到過渡態(tài)理論對(duì)抗體酶設(shè)計(jì)所起到的重要作用。這也就為酶的過渡理論的正確性提供了一個(gè)有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)?？贵w酶在有機(jī)合成和有機(jī)反應(yīng)機(jī)制研究方面，也引起了有機(jī)化學(xué)家的廣泛興趣?？贵w酶使過去很多不能應(yīng)用酶促反應(yīng)的有機(jī)合成得以實(shí)現(xiàn)。 第六十一張，PPT共六十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶人工模擬的發(fā)展趨勢(shì)人工模擬方法較多，但進(jìn)展不平衡 環(huán)糊精模擬發(fā)展最早，雜合方法是新