轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理以及應(yīng)用

1、關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用第一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月遺傳的中心法則基因組轉(zhuǎn)錄組表觀遺傳組蛋白組層次第二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月什么是轉(zhuǎn)錄組？All transcripts All mRNAs第三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotypeGenotype DNA第四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月測(cè)序技術(shù)RNA-SeqSmall RNA測(cè)序降解組測(cè)序Non-coding RNA測(cè)序研究對(duì)象mRNASmall RNAmRNANon-coding RNA鑒定新分子OOOO表達(dá)譜研究OOOO

2、基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST 測(cè)序O/XXXX 篩選分子標(biāo)記 OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達(dá)O/XXXXRNA 測(cè)序技術(shù)第五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析第六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Total RNA樣品檢測(cè) Agilent 2200 檢測(cè)OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7 新型安捷倫2200 TapeStation系統(tǒng)是新一代測(cè)序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和

3、抗體生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案?？蓴U(kuò)展的通量16聯(lián)或96孔微量滴定板快速得到結(jié)果平均每個(gè)樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果使用簡(jiǎn)單可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡(jiǎn)化了工作流程樣品用量少每次運(yùn)行僅需要不到2ul樣品第七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)報(bào)告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅第八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月檢測(cè)報(bào)告-不合格樣品第九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析第十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于20

4、22年6月真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過(guò)的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3的poly A與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過(guò)MPC（磁分離器）從溶液中分離出來(lái)。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）第十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原核mRNA的純化Ambion MICROExpress KitLNA扣鎖型探針第十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月mRNA反轉(zhuǎn)錄-fragment+RT純

5、化過(guò)的mRNA樣品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc 糖原 無(wú)水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTds cDNA第十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月末端修復(fù)(防止自連）cDNA 3末端加AAdapter連接第十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成第二天末端修復(fù) 加接頭膠回收3端加A第三天PCRPCR膠回收 文庫(kù)制備 文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)：Aligent 2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測(cè)：跑膠驗(yàn)證。第十五張，PPT共五

6、十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)文庫(kù)制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析第十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ApplicationRNA-Seq (單端測(cè)序-Quantification)RNA-Seq (雙端測(cè)序-Transcriptome)Expression-profilingAlternative SplicingFusion GeneSNP detectionHiSeq 2500Applications of RNA-Seq17第十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-

7、Seq (Transcriptome)第十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)生物信息學(xué)分析第十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq (Transcriptome)Characterize the transcriptome in unparalleled detailTechnique 220RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)RNA-Seq (Transcriptome resequencing)第二十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA

8、-Seq (De novo transcriptome assembly)文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序組裝第二十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月De novo assemble a transcriptome組裝流程第二十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估組裝結(jié)果分析（Contig 長(zhǎng)度分布、Scaffold 長(zhǎng)度分布、Unigene 長(zhǎng)度分布）Unigene （transcript）功能注釋Unigene 的GO 分類Unigene 代謝通路分析預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS）Unigene 表達(dá)差異分析（兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）Unigene 在樣品間的差異

9、GO 分類（需兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）和Pathway 富集性分析De novo assembly transcriptome 信息分析主要內(nèi)容：第二十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月De novo assembly transcriptome信息分析流程第二十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Unigenes的GO 注釋第二十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Pathway 分析第二十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq (Transcriptome resequencing)cDNA文庫(kù)構(gòu)建測(cè)序比對(duì)到參考序列第二十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)

10、作于2022年6月Transcriptome resequencing比對(duì)流程第二十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月比對(duì)統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)注釋基因差異表達(dá)分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接分析預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptome resequencing信息分析主要內(nèi)容第二十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Transcriptome resequencing信息分析流程第三十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用-優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析第三十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Genomic interg

11、enic regionReadsclusterPaired Readsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End (PE) ReadsReads 比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域第三十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鑒定可變剪接（ Alternative Splicing ）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA第三十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鑒定基因融合Paired ReadsSingle ReadsGene AGene B第三十四張，PPT

12、共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：SOAPDe novo 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序: 組裝軟件：SoapDenovo比對(duì)軟件： SoapSNP第三十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月36轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTiling ArraycDNA or EST sequesing Transcriptome SequencingPrincipleHybridizationSanger sequencingNext-GensequencingResolutionFrom several to 100Single baseSingle baseTh

13、roughputHighLowHighReliance on genomic sequenceYesNoIn some casesBackground noiseHighLowLowApplicationSimutaneously map transcribed regions and gene expressionYesLimited for expressionYesDynamic range to quantify gene expression levelUp to a few-hundred foldNot practical 8,000-foldAbility to disting

14、uish different isoforms and allelic expressionLimitedYesYes第三十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因數(shù)比較 RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因的表達(dá)量分布Technique 1第三十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Genome Res 2010Case 實(shí)驗(yàn)材料收集： 葉片，花序, 果實(shí), 根 時(shí)間點(diǎn)：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品均勻混合 測(cè)序策略： Illumina 測(cè)序，1G data第三十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

15、1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接第三十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外包膜蛋白16 (AT2G28900)Intron-retentionControlLow Temperature Resistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個(gè)內(nèi)含子和對(duì)照相比被保留了下來(lái)，揭示了可變剪接有重要功能。第四十張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)等第四十一張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）等同于數(shù)字

16、表達(dá)譜(DGE)第四十二張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Workflow of RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息學(xué)分析第四十三張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估篩選差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類分析GO 功能富集分析Pathway 富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析第四十四張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）信息分析流程第四十五張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-

17、seq1）檢測(cè)基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)0.99）3）數(shù)字化信號(hào)，無(wú)背景噪音，無(wú)交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測(cè)5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測(cè)6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫(kù)更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺(tái)應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺(tái)要求樣品量少1）檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測(cè)閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽(yáng)性率1%3）受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物4）受基因拷貝

18、數(shù)限制，無(wú)法檢測(cè)出低豐度基因5）只能檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本，無(wú)法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況第四十六張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月casePlant Physiology 2010取樣： 選取在成熟季節(jié)開花后 5, 10, 和15個(gè)星期葡萄分別代表葡萄果實(shí)成熟中的三個(gè)時(shí)期（post setting, veraison和ripening）數(shù)據(jù)量： 超過(guò)59M reads數(shù)據(jù)， 長(zhǎng)度在36-44bp之間運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中復(fù)雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。第四十七張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月表二 reads在基因組上的分布情況表一 測(cè)序數(shù)據(jù)葡萄RNA-Seq單端測(cè)序第四十八張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月漿果發(fā)育三個(gè)階段共有、特有基因表達(dá)分布圖基因表達(dá)量分布第四十九張，PPT共五十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月表達(dá)簇的分類分布情況差異表達(dá)的基因GO功能注釋-分成了19