乳制品中三聚氰胺的含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、2009級(jí)化學(xué)教育儀器化學(xué)綜合性與設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：曹*2011年5月 30號(hào)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)分析化學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生初 步的解決分析化學(xué)實(shí)際問(wèn)題的能力，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)與 創(chuàng)新能力。學(xué)習(xí)查閱參考文獻(xiàn)、綜合參考資料、設(shè)計(jì)小型分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)。復(fù)習(xí)和鞏固有關(guān)理論基礎(chǔ)知識(shí)并用于指導(dǎo)實(shí)踐。進(jìn)一步熟練掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)題目：乳制品中三聚氰胺的含量的測(cè)定（高效液相色譜法）摘要、關(guān)鍵詞：摘要為建立乳制品中三聚氤胺含量的高效液相色譜測(cè)定方法， 通過(guò)超聲提取，離子交換萃取小柱凈化，結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行樣 品測(cè)定。色譜條件：A液：0.9508 g辛烷磺酸鈉（5 mmol/L） + 1.064

2、0 g檸檬酸（pH=3-4）用高純水品配制1L溶液；B液：甲醇；色譜條 件：30%B+70%A。色譜柱：CNWSIL C18液相色譜柱（4.6x250mm，5 pm），檢測(cè)波長(zhǎng): 239 nm結(jié)果表明：三聚氤胺標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 449595】X +18978.83，相關(guān)系數(shù)日二 0.9999693，在0.17110.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法檢出限為0.12 mg/L，兩個(gè)樣品三個(gè)水平的加標(biāo)回收率分別為96.34 % （RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21)、104.29 % (RSD = 7.63)和95.31 % (RSD = 4.39)、89.25 %

3、 (RSD = 3.88)、92.59 % (RSD = 5.27) 關(guān)鍵詞高效液相色譜；三聚氰胺；乳制品引言一、目前有關(guān)三聚氧胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine)(化學(xué)式：C3H6N6)，俗稱密胺、蛋白精， IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一種重要的氮雜環(huán)有 機(jī)化工原料，通常用于塑料制品中合成樹(shù)脂的生產(chǎn)1 。它是白色 單斜晶體，幾乎無(wú)味，微溶于水(3.1g/L常溫)，可溶于甲醇、甲醛、 乙酸、熱乙二醇、甘油、毗啶等，不溶於丙酮、醚類、對(duì)身體有害， 不可用於食品加工或食品添加物。由于中國(guó)采用估測(cè)食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量方法的缺陷，三聚 氰胺也常被不法商人

4、摻雜進(jìn)食品或飼料中，以提升食品或飼料檢測(cè)中 的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被作假的人稱為“蛋白精”。 蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成。蛋白質(zhì)平均含氮量為16%左右，而三聚氰 胺的含氮量為66%左右。常用的蛋白質(zhì)測(cè)試方法“凱氏定氮法”是通 過(guò)測(cè)出含氮量乘以6.25來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會(huì)使 得食品的蛋白質(zhì)測(cè)試含量虛高，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)只 做粗蛋白質(zhì)簡(jiǎn)易測(cè)試時(shí)蒙混過(guò)關(guān)。有人估算在植物蛋白粉和飼料中使 測(cè)試蛋白質(zhì)含量增加一個(gè)百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原 料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒(méi)有什么氣味和味道， 所以摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。奶粉事件：近年來(lái)，一些不法廠商

5、將三聚氰胺添加到奶粉中，以 增加蛋白質(zhì)含量。2008年9月，震驚中外的“三鹿嬰幼兒奶粉事件” 2 暴露出乳制品行業(yè)的“潛規(guī)則”，國(guó)內(nèi)一些知名乳品品牌也被 檢出其產(chǎn)品中含三聚氰胺3。各個(gè)品牌奶粉中蛋白質(zhì)含量為 15-20% （晚上在超市看到包裝上還有標(biāo)示為10-20%的），蛋白質(zhì)中含 氮量平均為16%。某合格奶粉蛋白質(zhì)含量為18%計(jì)算，含氮量為2.88%。 而三聚氰胺含氮量為66.6%，是鮮牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g 牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理論上就能提高0.625%蛋白質(zhì)。微溶系指1g（ml）溶質(zhì)能在100ml1000ml溶劑中溶解，三聚氰胺 在水中微溶，在牛奶這種水包油型

6、的乳液中溶解度未找到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 應(yīng)該比水的溶解度要好一些，待驗(yàn)證。檢測(cè)方案：在現(xiàn)有奶粉檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂 肪、細(xì)菌等檢測(cè)。三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的， 所以現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)包含相應(yīng)內(nèi)容。亦即三聚氰胺檢測(cè)目前并無(wú)國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)。因此，德國(guó)萊茵TÜ；V集團(tuán)參照美國(guó)食品化學(xué)品法典 （FCC）HPLC-UV定量方法，同時(shí)還可采用HPLC/M S檢測(cè)方法（實(shí)驗(yàn)室方 法）對(duì)嬰兒食品，寵物食品，飼料及其原料（包括淀粉，大米蛋白，玉 米蛋白，谷朊粉、糧油等）開(kāi)展的檢測(cè)業(yè)務(wù)，檢測(cè)結(jié)果具備權(quán)威性。因此，如何快速、準(zhǔn)確分析乳制品中的三聚氰胺成為多方關(guān)注的 問(wèn)題.本次設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)在N

7、Y/T 13722007標(biāo)準(zhǔn)4 的基礎(chǔ)上進(jìn)行改 進(jìn)，結(jié)合其他產(chǎn)品中三聚氰胺的測(cè)定方法5 ，利用高效液相色譜 法對(duì)乳制品進(jìn)行三聚氰胺含量的測(cè)定。二、對(duì)三聚氤胺的測(cè)定方法概述：國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局與標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)聯(lián)合發(fā)布了原料乳 與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法，即國(guó)標(biāo)GB/T22388-2008。這一新標(biāo) 準(zhǔn)制定了高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法及氣相色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用法三種檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)。三聚氰胺的檢測(cè)方法還包括試劑盒檢測(cè) 法（ELISA）、離子交換色譜-紫外檢測(cè)法等。1、高效液相色譜法（HPLC）:試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液 提取，提取液離心后經(jīng)混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化，洗脫物

8、吹 干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。在添加濃度 2mg/kg10mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差小于10%。2、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS和GC-MS/MS）:試樣經(jīng)超聲 提取、固相萃取凈化后，進(jìn)行硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物采用選擇離子監(jiān) 測(cè)質(zhì)譜掃描模式（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜掃描模式（MRM），用化合 物的保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片的豐度比定性，外標(biāo)法定量。其中GC-MS法 在添加濃度0.05mg/kg2mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在70%110%之 間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%; GC-MS/MS法在添加濃度0.005mg/kg 1mg/kg濃度范圍內(nèi)

9、，回收率在90%105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。3、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）:試樣用三氯乙酸溶液 提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè) 定和確證，外標(biāo)法定量。在添加濃度0.01mg/kg0.5mg/kg濃度范圍 內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。4、試劑盒檢測(cè)法（Enzyme Linked Immunosorbent AssayELISA）:試劑盒檢測(cè)法即為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，是利用萃取液通 過(guò)均質(zhì)及震蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測(cè)定的一種方 法。5、離子交換色譜-紫外檢測(cè)法：何強(qiáng)建立離子交換色譜-紫外檢 測(cè)法測(cè)定

10、乳制品中三聚氰胺。樣品用水和乙腈提取，分析時(shí)用LC-SCX 離子交換色譜柱分離，濃度為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH3.0）- 乙腈（70： 30）為流動(dòng)相，在紫外波長(zhǎng)240nm處檢測(cè)。三聚氰胺為 0.5mg/L-100.0mg/L時(shí)，質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999），最低檢出限為1.0mg/kg，加標(biāo)回收率為93.8%102.5%， RSD3.5%。6、其他檢測(cè)法：利用抗原與抗體相互識(shí)別的原理，制作出能識(shí)別 三聚氰胺的抗體試紙，將試紙插入稀釋的奶制品中，則可檢測(cè)出其中 是否含有三聚氰胺。使用膜分離技術(shù)萃取樣品溶液，然后采用紫外可 見(jiàn)光度法或化學(xué)檢驗(yàn)的方法檢測(cè)樣

11、品中三聚氰胺的含量。三、選定實(shí)驗(yàn)方案的原理：試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化 后，（其中包括 試樣經(jīng)溶解、超聲提取、沉淀蛋白、過(guò)濾得到測(cè)試液）， 再經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收光譜定性，根據(jù)峰 面積進(jìn)行定量。三聚氰胺呈弱堿性（弱陽(yáng)離子化合物），凈化過(guò)程一般應(yīng)選擇陽(yáng)離 子交換柱。混合型的陽(yáng)離子交換柱（PCX）通過(guò)將磺酸基團(tuán)（-SO3H）鍵合 在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽(yáng)離子交換 和反相吸附兩種機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：a）可通過(guò)兩種不同溶液的洗 滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑），使樣品更干凈，提高檢測(cè)的靈敏度。b）批次重復(fù)性好

12、。c）回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。實(shí)驗(yàn)部分一、所使用的儀器和試劑：儀器：1200高效液相色譜儀；分析天平；小燒杯；玻璃棒；容量瓶（100ml、25ml）；膠頭滴管；量筒（10ml、25ml）；具塞刻度試管（50ml）；超聲波提取儀；離心管（10ml）；離心機(jī);有機(jī)濾膜；微量注射器； 試劑：三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）;三氯乙酸、乙腈、（分析純，）； 實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；待測(cè)乳制品（伊利奶粉）。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1、樣品的制備參照NY/T 13722007標(biāo)準(zhǔn)的方法4 ,準(zhǔn)確稱取伊利奶粉5.0g四 份，其中一份加入到具塞刻度試管后，再加入1%的三氯乙酸溶液15 巾1和乙腈溶

13、液5 mL,超聲提取10 min后，用三氯乙酸定容至刻度，混 勻。靜置，將其轉(zhuǎn)移至離心管，于30 000 r/min下離心10 min,取離 心后的上清液10 mL,轉(zhuǎn)移至25ml的容量瓶中配成25ml的溶液，再轉(zhuǎn) 移少量溶液備用用于下次待測(cè)。過(guò)0.45mm濾膜，上機(jī)測(cè)定。2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（已做）3、三聚氰胺的含量根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)乳制品中三聚氰胺的含量，并使用有關(guān)軟件計(jì)算出其他有關(guān)的數(shù)據(jù)，再通過(guò)數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)，討論并得出 結(jié)論。5結(jié)果與討論（1）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果與處理色譜條件：A 液：0.9508 g 辛烷磺酸鈉（5 mmol/L）+ 1.0640 g 檸檬酸（pH=3

14、-4） 用高純水品配制1L溶液；B液：甲醇；色譜條件：30%B+70%A。色譜柱：CNWSIL C18液相色譜柱（4.6x250mm，5 pm），檢測(cè)波長(zhǎng): 239 nm一、定性8.07.06.05.04.03.02.01.00.0T.00.02.55.07.510.012.515.017.5min三聚氤胺保留時(shí)間為：15.866 min二、定量配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為：0.01 mg/ml、0.02 mg/ml、0.05 mg/ml、 0.10 mg/ml、0.25 mg/ml、0.58 mg/ml、1.00 mg/ml，依次進(jìn)樣，每次進(jìn)樣體積為5.V(x10,000)4.0-3.0-

15、2。1.0-0.0-0.iiiIiiiiIiiiiIiiiIiiiIiiiIiiiiiii02.55.07.510.012.515.017.5min濃度峰號(hào)保留時(shí)間面積峰高濃度11.8941928.7360.90.0000022.0282445.2546.30.0000032.14943198.17151.70.0000042.497106357.016026.10.0000052.83953720.93821.20.0000063.14535308.05893.30.0000073.28841854.24932.20.0000084.0211869.0203.60.0000099.37223

16、825.42043.90.000001012.6582362.1212.00.00000空白峰號(hào)保留時(shí)間面積峰高濃度11.9021289.8248.10.0000022.0302342.3517.40.0000032.14936913.96294.80.0000042.49393291.314050.40.0000052.84941051.43060.10.0000063.13129070.85139.50.0000073.27541222.34999.80.0000083.9901363.3170.70.0000099.24220115.31783.90.000001012.4522127.

17、0180.90.000001114.715318221.217928.70.07031濃度25： 10峰號(hào)保留時(shí)間面積峰高濃度11.9001808.6344.80.0000022.0333059.5750.80.0000032.15154231.98725.80.0000042.506125476.218059.50.0000052.84754154.73738.90.0000063.13240664.07282.20.0000073.27555942.76927.70.0000083.9931861.6232.00.0000099.23428462.82502.70.000001012.44

18、32864.3251.90.000001114.699412705.922380.80.091187.50.02.55.010.012.515.017.5min5.04.03.02.01.00.0V(x10,000)4峰號(hào)保留時(shí)間面積峰高濃度11.9021960.0365.10.0000022.0312814.7671.40.0000032.15050468.58242.30.0000042.503118354.917232.50.0000052.84552648.43750.20.0000063.13138335.86812.70.0000073.27454378.36596.60.0000030： 1083.9931639.9211.70.0000099.22526031.12348.00.000001012.4292835.2244.50.000001114.675402702.022081.70.0889735： 10數(shù)據(jù)比較(2)討論參考文獻(xiàn)1 邵靜群，溫家琪，徐世文。三聚氰胺毒理學(xué)進(jìn)展J 現(xiàn)代 畜牧獸醫(yī)，2007,12: 52-54.2 錢(qián)中兵。三鹿嬰幼兒奶粉受三聚氰胺污染EB /OL 。2008209211 http: / /news. xinhuanet