HPLC色譜分析中常見(jiàn)問(wèn)題課件

1、HPLC色譜分析中常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法姚彤煒 主講浙江大學(xué)藥學(xué)院第1頁(yè)，共14頁(yè)。色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因進(jìn)口濾片堵塞吸附了樣品雜質(zhì)柱填充不良，使用久，機(jī)械及熱沖擊造成空洞固定相遭化學(xué)侵蝕2022/8/182第2頁(yè)，共14頁(yè)。柱凹陷出現(xiàn)裂峰現(xiàn)象，填料與色譜柱頂端不齊平，可用相同填料填平凹陷處壓力影響應(yīng)避免突然的壓力波動(dòng)與任何的機(jī)械與熱力沖擊，如：色譜柱掉在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上驟然改變柱溫進(jìn)樣過(guò)程中轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥太慢引起壓力波動(dòng)，使色譜峰產(chǎn)生裂隙2022/8/183第3頁(yè)，共14頁(yè)。柱壓升高原因強(qiáng)保留樣品組分強(qiáng)吸附組分易聚集在柱

2、進(jìn)口填料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分、緩控釋制劑中的高分子輔料等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時(shí)往往是強(qiáng)保留污染物在柱口處聚集的信號(hào)解決辦法使用保護(hù)柱可延長(zhǎng)分析柱壽命每天實(shí)驗(yàn)后應(yīng)用強(qiáng)溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱并定期進(jìn)行保養(yǎng)，以低流速的強(qiáng)溶劑較長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱2022/8/184第4頁(yè)，共14頁(yè)。樣品純度差有微小的顆粒堵塞管路可用濾膜過(guò)濾樣品后再進(jìn)樣樣品濃度高連續(xù)進(jìn)樣，造成過(guò)載如果樣品吸收度不是太低，使樣品濃度在0.5mg/ml以下較適宜 流動(dòng)相中緩沖液濃度過(guò)高,有機(jī)相比例大在色譜過(guò)程中堵塞管路，析出的鹽結(jié)晶還磨損泵、進(jìn)樣閥密封圈造成漏液緩沖液濃度一

3、般控制在20mmol以下較適宜，測(cè)定完畢后必須及時(shí)沖洗2022/8/185第5頁(yè)，共14頁(yè)。注意！ 一旦柱壓升高，應(yīng)停止測(cè)定，用水沖洗數(shù)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，待壓力下降后再測(cè)定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級(jí)檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等2022/8/186第6頁(yè)，共14頁(yè)。檢測(cè)器泵分析柱預(yù)柱流路檢查順序進(jìn)樣閥2022/8/187第7頁(yè)，共14頁(yè)。柱效低的原因頻繁更換流動(dòng)相組成加速柱效降低最好一根色譜柱使用的流動(dòng)相成分和pH值相近，如始終在酸性條件下或堿性條件下工作 色譜柱的選擇不合適或使用時(shí)間久更換色譜柱（廠家，型號(hào)）進(jìn)樣操作不當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)應(yīng)一次轉(zhuǎn)到位，不能過(guò)慢或停頓，否則易造成裂峰 2022/8

4、/188第8頁(yè)，共14頁(yè)。樣品溶劑與流動(dòng)相成分不匹配樣品溶劑與流動(dòng)相成分不匹配，造成前沿峰，倒峰或裂峰如樣品用純甲醇作溶劑，而流動(dòng)相中甲醇比例很低，這樣易出現(xiàn)前沿峰，改變樣品溶劑成分或比例，使醇-水比例接近于流動(dòng)相前沿峰倒峰裂峰柱凹陷？2022/8/189第9頁(yè)，共14頁(yè)。結(jié)果不能重現(xiàn) 表現(xiàn)為同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積相差大，引起這種情況時(shí)，可從以下幾方面來(lái)查找原因：泵、進(jìn)樣閥、管路漏液：造成峰面積變化儀器未達(dá)平衡：穩(wěn)定時(shí)間不夠進(jìn)樣量太少：注射體積剛夠定量圈體積檢測(cè)器靈敏度改變：如果同一樣品兩次進(jìn)樣峰面積相差10倍或更大倍數(shù)，則最可能的原因是檢測(cè)器的靈敏度被無(wú)意中改變，軟件的靈敏度改變不會(huì)

5、影響峰面積的積分?jǐn)?shù)值2022/8/1810第10頁(yè)，共14頁(yè)。色譜軟件積分方式是否一致尤其是對(duì)于色譜峰較復(fù)雜的，積分時(shí)基線稍有變化將造成峰面積大的變化，如果兩峰不是基線分離，則峰切割方式對(duì)峰面積有很大影響，有時(shí)候采用峰高較峰面積誤差小垂直切割基線切割2022/8/1811第11頁(yè)，共14頁(yè)。進(jìn)樣量對(duì)色譜峰分離影響例：三七提取物以甲醇為溶劑，流動(dòng)相：乙腈-水,梯度洗脫，乙腈初始濃度20% 進(jìn)樣量50L 進(jìn)樣量10L 正常異常2022/8/1812第12頁(yè)，共14頁(yè)。主動(dòng)閥故障對(duì)色譜分離影響主動(dòng)閥閥芯出問(wèn)題時(shí)，壓力線會(huì)有不正常的壓力降，或者是壓力線波動(dòng)很大，超過(guò)正負(fù)23個(gè)bar導(dǎo)致進(jìn)樣后，各組分出峰忽而正常，忽而異常，且峰位置發(fā)生明顯變化更換主動(dòng)閥閥芯，可消除上述癥狀 202