包頭醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)之實(shí)驗(yàn)5 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)5 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)目的要求掌握金黃色葡萄球菌檢測(cè)的基本程序熟悉金黃色葡萄球菌檢測(cè)的基本方法與步驟。器材和試劑1樣品 可疑奶粉 2培養(yǎng)基及試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板、卻普曼瓊脂平板、7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵管（微）、甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂平板、葡萄糖微量發(fā)酵管、新鮮抗凝血漿（人或兔）。3其他 接種環(huán)、接種針、載玻片、革蘭染液、香柏油、擦鏡液、生理鹽水。步驟和方法一、檢驗(yàn)程序1：10奶粉稀釋液 7.5%NaCl肉湯增菌 直接計(jì)數(shù) 血平板和卻普曼瓊脂平板 觀察菌落特征，革蘭染色鏡檢 血漿凝固酶試驗(yàn)、甘露醇試驗(yàn) 耐熱核酸酶試驗(yàn)、腸毒素測(cè)定等二、檢驗(yàn)方法1、樣品的采取和送檢（

2、1）散裝或大型包裝的乳品檢樣：用滅菌刀、勺取樣。在移采另一件樣品前，應(yīng)將用過(guò)的刀、勺清洗滅菌。采樣時(shí)應(yīng)注意不同的部位、使樣品有代表性。樣品仿品放入滅菌器內(nèi)，及時(shí)送檢。(2)小型包裝的乳品檢樣：應(yīng)采取整件包裝，奶粉1瓶或1包。采樣時(shí)應(yīng)注意包裝的完整性。（3）成批產(chǎn)品質(zhì)量的檢樣：采樣量一般以1的比率抽取，應(yīng)注意代表性，不足千件者抽取1件。2、檢樣處理（1）罐（瓶）裝乳粉：將罐或瓶表面先用溫水洗凈，再用點(diǎn)燃的酒精棉球消毒瓶或罐的上表面，然后用滅菌的開(kāi)罐器打開(kāi)罐或瓶面，以無(wú)菌手續(xù)稱(chēng)取25g檢樣，放入裝有玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，然后徐徐加入225ml溫?zé)岬臏缇睇}水，（先加少許使乳粉調(diào)成糊狀，再全部加入，

3、以免奶粉結(jié)塊）。振搖均勻，使充分溶解后即為1：10稀釋液。（2）袋裝乳粉：可用75%的酒精棉球擦拭消毒袋口后，以無(wú)菌手續(xù)開(kāi)封取樣。以后操作同罐（瓶）裝乳粉。增菌培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取上述稀釋液5ml加入7.5%NaCl肉湯或胰酪胨大豆肉湯45ml培養(yǎng)基內(nèi)，置37溫箱培養(yǎng)24h。再肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長(zhǎng)。分離培養(yǎng)：直接取可疑奶粉或增菌培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種至血平板或卻普曼瓊脂平板，經(jīng)37孵育18-24h后觀察菌落。取可疑菌落做革蘭染色鏡檢。根據(jù)形態(tài)染色特性，然后進(jìn)一步做生化反應(yīng)鑒定。生化反應(yīng)（1）觸酶試驗(yàn)：本試驗(yàn)用于初步區(qū)別葡萄球菌和鏈球菌，前者為陽(yáng)性，后者為陰

4、性。（2）血漿凝固酶試驗(yàn)：1）原理：致病性葡萄球菌產(chǎn)生的一種能凝固人和兔血漿的蛋白質(zhì)?？煞譃閮煞N： 結(jié)合型血漿凝固酶直接作用于血漿中的纖維蛋白原變成纖維蛋白而附著于細(xì)菌表面，發(fā)生凝集，可用玻片法測(cè)出。 另一種是分泌至菌體外的游離型凝固酶，作用類(lèi)似凝血酶原，可被人或兔血漿中協(xié)同因子激活變成凝固酶樣物質(zhì)，使液態(tài)的纖維蛋白原變成固態(tài)的纖維蛋白，進(jìn)而使血漿凝固，可用試管法測(cè)出。2）方法：玻片法：取人或兔血漿和鹽水各一滴，分別置于潔凈的破片上，挑取可疑菌落分別與血漿和鹽水混合；試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿和生理鹽水，挑取被檢菌分別加入血漿中并混勻，于370C水浴3-4小時(shí)3）結(jié)果判斷、解

5、釋和報(bào)告：玻片法以血漿中有明顯顆粒出現(xiàn)而鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象判為陽(yáng)性，反之，細(xì)菌在血漿中呈均勻混濁則為陰性；試管法以血漿凝固判為陽(yáng)性，反之，試管內(nèi)血漿不凝固仍流動(dòng)的，則為陰性。若陰性，應(yīng)繼續(xù)觀察到24h，仍不凝固者為陰性。4）臨床意義：血漿凝固酶試驗(yàn)被廣泛用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其它葡萄球菌，常作為鑒定葡萄球菌致病性的主要依據(jù)之一，金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（3）耐熱核酸酶測(cè)定：1）原理：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生一種耐熱核酸酶，能將DNA水解成由幾個(gè)單核苷酸組成的寡核苷酸鏈。水解后的DNA短鏈與甲苯胺藍(lán)結(jié)合，使甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂顯示粉紅色。非致病性葡萄球菌雖然也能產(chǎn)生

6、DNA酶，但不耐熱。因此耐熱DNA酶測(cè)定可作為鑒定致病性葡萄球菌的重要指標(biāo)。2）方法：玻片法：取融化好的甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂3ml均勻澆在載玻片上，待瓊脂凝固后打上68個(gè)孔徑25mm的小孔，各孔分別加1滴經(jīng)沸水浴3min處理過(guò)的待檢菌和陽(yáng)性、陰性對(duì)照葡萄球菌培養(yǎng)物，37孵育3h，觀察有無(wú)粉紅色圈及其大小。平板法：在已形成葡萄球菌菌落的 平板上挑選待檢菌并做好標(biāo)記，置60烤箱加熱2h（使不耐熱的DNA酶滅活），取出后平板上傾注10ml已預(yù)先融化的甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂，37孵育3h，觀察菌落周?chē)袩o(wú)粉紅色圈。劃線(xiàn)刺中法：將24小時(shí)肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種劃線(xiàn)刺中于甲苯胺藍(lán)DNA瓊脂平板上

7、，371培養(yǎng)24小時(shí)，觀察刺中線(xiàn)周?chē)袩o(wú)淡粉紅色出現(xiàn)。3）結(jié)果判斷、解釋和報(bào)告：玻片法孔外出現(xiàn)粉紅色圈的為陽(yáng)性；平板法葡萄球菌菌落周?chē)袩o(wú)粉紅色圈的為陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（4）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：1）原理：致病性葡萄球菌多能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。2)方法：將待檢菌分別接種于兩支甘露醇發(fā)酵管，其中一支滴加滅菌的液體石蠟（不低于1cm ）, 35培養(yǎng)1824小時(shí)后觀察結(jié)果。3）結(jié)果判斷、解釋和報(bào)告：兩支培養(yǎng)基均混濁，由紫色變?yōu)辄S色為甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性，兩支都為紫色或只有一支變?yōu)辄S色為陰性。金黃色葡萄球菌的本試驗(yàn)為陽(yáng)性，表皮和腐生葡萄球菌為陰性。（5）腸毒素測(cè)定：1）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌腸毒素與腸毒素抗血清在瓊脂板上可形成白色沉淀線(xiàn)。2）ELISA法：利用雙抗體夾心法，測(cè)定標(biāo)本中金黃