實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的提取和鑒定

1、質(zhì)粒DNA的提取和純化 生化與分子生物學(xué)系1分子生物學(xué)從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質(zhì)基礎(chǔ)的學(xué)科。研究細(xì)胞成分的物理、化學(xué)的性質(zhì)和變化以及這些性質(zhì)和變化與生命現(xiàn)象的關(guān)系，如遺傳信息的傳遞，基因的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)調(diào)控和表達(dá)產(chǎn)物的生理功能，以及細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。 2基因工程3移液器和EP管4質(zhì) 粒質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體之外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質(zhì)。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對(duì)抗生素的抗性等。F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒(抗藥性因子)和Col質(zhì)粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見(jiàn)的天然質(zhì)粒。 能穩(wěn)定地獨(dú)立存在于染色體外，并傳遞到子

2、代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質(zhì)粒大多數(shù)是經(jīng)過(guò)改造或人工構(gòu)建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術(shù)中重要的工具。 5分類：?jiǎn)慰截愘|(zhì)粒；多拷貝質(zhì)粒；緊密控制型；松弛控制型；67質(zhì)粒DNA的提取方法堿裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法； 概括起來(lái)主要是用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理。8基本思路培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)電泳檢測(cè)；9堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉(SDS) 可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)SDS處理后，細(xì)菌染色體DNA會(huì)纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時(shí)由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核

3、酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線性染色體DNA變性，而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA)的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)。當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線狀染色體DNA片段難以復(fù)性，而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起，而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復(fù)原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。10實(shí)驗(yàn)步驟1、將含有質(zhì)粒DNA的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。取1.5ml LB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g離心30秒。 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。 3、菌

4、體沉淀重懸浮于100l溶液中（需劇烈振蕩）。 4、加入新配制的溶液200l，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內(nèi)容物（千萬(wàn)不要振蕩），冰浴2分鐘。 5、加入150l預(yù)冷的溶液，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5分鐘，4下12000g離心10分鐘。6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4下12000g離心10分鐘。 117、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，振蕩混

5、勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 9、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次，4下12000g離心5-10分鐘。 10、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。 11、將沉淀溶于10l TE緩沖液（pH8.0，含20g/ml RNaseA）中，儲(chǔ)于-20冰箱中。12LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣

6、滅菌20分鐘。13溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲(chǔ)存于4冰箱溶液I：重懸細(xì)菌；葡萄糖：比重大，使細(xì)菌不易沉淀；TrisHCl：緩沖體系；EDTA：螯合金屬離子；14溶液0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1SDS溶液II破膜，變性基因組DNA和蛋白質(zhì)；SDS破膜作用，變性蛋白質(zhì)；NaOH破膜，變性基因組DNA；15溶液5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。

7、溶液終濃度為：K+3mol/L，Ac5mol/L。溶液III中和溶液，復(fù)性質(zhì)粒DNA；16酚/氯仿（1:1）酚變性蛋白質(zhì)；氯仿萃取溶液中的酚； 分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時(shí)不要震蕩。17乙醇無(wú)水乙醇（2倍體積）沉淀質(zhì)粒DNA；70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；1819核酸的定量260 nm，1OD值相當(dāng)于：雙鏈DNA濃度為50g/ml單鏈DNA濃度為40g/mlA260/A280 = 1.8（DNA）A260/A280 = 2.0（RNA）20電 泳 Electrophoresis 21一、定義電泳帶電粒子在直流電場(chǎng)中向著電性相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳分析技術(shù)利

8、用電泳現(xiàn)象進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。22二、電泳分析技術(shù)發(fā)展概況 1809年 發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年 Tiselius 自由界面電泳 1948年 Wieland 濾紙電泳 1980年 毛細(xì)管電泳 (capiliary electrophoresis)23三、電泳分析技術(shù)的分類1.根據(jù)被分離樣品的量多少 分析電泳 制備電泳2.根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳 0500 V 高壓電泳 5003000V3.根據(jù)電泳中是否使用支持物 自由電泳不使用支持物，在溶液中進(jìn)行。 區(qū)帶電泳使用支持物244. 按支持物的物理性狀不同濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠

9、、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳絲狀電泳，如尼龍絲、人造絲電泳255. 按支持物的裝置形式不同平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳266.根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)連續(xù)pH電泳指電泳過(guò)程中pH保持不變；不連續(xù)pH電泳指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段也有不同的pH ； 27電泳技術(shù)的特點(diǎn):凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分離,并可進(jìn)行定性或定量分析;樣品用量極少;設(shè)備簡(jiǎn)單;可在常溫進(jìn)行;操作簡(jiǎn)便省時(shí);分辨率高.28四、電泳的基本原理一個(gè)分子，如能解離或能吸附帶電質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)中便會(huì)向正極或負(fù)極移動(dòng)。 29移動(dòng)速度以蛋白質(zhì)分子為例: F= EQ （Q：有效電荷; E

10、：電位梯度） F=6rv （F：摩擦阻力; v：在介質(zhì)粘度中半徑為r的顆粒的移動(dòng)速度） F=F EQ=6rv E Q v= 6r 30 遷移率（Mobility)帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度。 V Q M = = E 6r 31五、影響電泳速度的因素1.電場(chǎng)強(qiáng)度（E） E電流熱效應(yīng)支持介質(zhì)上的水分蒸發(fā)樣品的熱變性 E電泳速度慢延長(zhǎng)電泳時(shí)間樣品擴(kuò)散區(qū)帶模糊不清分辨率下降2. 帶點(diǎn)顆粒的半徑 r 阻力電泳速度變慢3. 支持物介質(zhì)吸附作用；電滲作用；分子篩作用緩沖液 離子強(qiáng)度（I）：I緩沖能力越大緩沖液所載的分電流增加，而樣品所載的電流相應(yīng)減少電泳速度減慢 pH：pH值決定了化合物解離的程度，

11、也決定了質(zhì)點(diǎn)所帶的凈電荷。32電泳在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型(相對(duì)分子質(zhì)量不同的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。33瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團(tuán)、羧酸基團(tuán)等帶電荷基團(tuán)的中性部分，結(jié)構(gòu)是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層析和電泳。 34電泳鑒定其中超螺旋結(jié)構(gòu)泳動(dòng)最快；其次為線性結(jié)構(gòu)；最慢的可能是復(fù)制中間體（沒(méi)