抑菌物質(zhì)肉桂醛防治芒果炭疽病機(jī)理研究

1、抑菌物質(zhì)肉桂醛防治芒果炭疽病機(jī)理研究論文關(guān)鍵詞：芒果炭疽病,肉桂醛,抑菌物質(zhì),機(jī)理芒果炭疽病是芒果最嚴(yán)重的病害之一，在世界芒果種植產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病是由膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的侵染性病害，主要危害新抽發(fā)的嫩葉、熟果，常造成貯運(yùn)期芒果果實(shí)嚴(yán)重?fù)p失。目前，生產(chǎn)上仍以化學(xué)防治為主，施?？说缺奖溥蝾?lèi)內(nèi)吸性殺菌劑對(duì)該病具有良好的防治效果，但是長(zhǎng)期大量使用相同作用位點(diǎn)的苯丙咪唑類(lèi)殺菌劑使得不少果園產(chǎn)生了抗性菌株，從而使其防治效果大大降低。生物防治作為一種無(wú)毒無(wú)害、符合綠色食品要求的病害防控措施，已成為取代化學(xué)農(nóng)藥防治芒果炭疽病的一種有效手段。目前，用

2、于生物防治研究的材料來(lái)源包括了動(dòng)物源活性物質(zhì)，植物源活性物質(zhì)，有益微生物及其產(chǎn)生的活性物質(zhì)。肉桂CinnamomumcassiaPresl是一種重要的中草藥，具有補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛，溫通經(jīng)脈之功能；肉桂中除含有一些碳水化合物外，還含有豐富的肉桂油，其主要成分為肉桂醛。試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛對(duì)芒果炭疽病等病原微生物具有較強(qiáng)的抑制作用。本研究以肉桂醛純物質(zhì)為研究材料，對(duì)其生防芒果炭疽病的效果進(jìn)行了測(cè)定，且從抑制病菌生長(zhǎng)及防御酶活性變化角度探討了其防病機(jī)理，為進(jìn)一步利用該物質(zhì)開(kāi)發(fā)創(chuàng)制新農(nóng)藥奠定根底。1材料與方法1.1供試材料供試芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides

3、為本實(shí)驗(yàn)室從廣東湛江芒果園果實(shí)病斑中別離獲得，經(jīng)檢測(cè)對(duì)芒果具有較強(qiáng)的致病性。供試肉桂醛為色譜純，99%。供試芒果為金黃芒，市場(chǎng)購(gòu)得。1.2供試培養(yǎng)基改進(jìn)PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，蛋白胨5g，瓊脂18g，水1000mL，pH自然用于芒果炭疽病菌的培養(yǎng)及產(chǎn)孢。1.3不同濃度的肉桂醛對(duì)芒果炭疽病的防病效果測(cè)定選無(wú)病芒果，用70%酒精外表消毒后，單果分開(kāi)放入塑料盆，噴霧肉桂醛濃度分別為0、10、15、20、25、30、35、40mg/L、清水以果面布滿(mǎn)液體為度后，待果面液體自然晾干后噴霧接種芒果炭疽病菌分生孢子懸浮液濃度為10個(gè)/mL，同樣以果面布滿(mǎn)霧點(diǎn)為度，每處理重復(fù)8次，并進(jìn)行

4、兩次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果，24-27下保濕培養(yǎng)，處理3d后記錄發(fā)病情況。1.4肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響將芒果炭疽病菌在PDA平板上預(yù)培養(yǎng)5d后，在菌落邊緣制取直徑為8mm的菌絲塊，移至含肉桂醛濃度為0、10、15、20、25、30、35、40mg/L的系列PDA平板上，以其中不加肉桂醛的平板為空白對(duì)照，每處理重復(fù)5次，25下培養(yǎng)5d，待空白長(zhǎng)至培養(yǎng)皿2/3時(shí)，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，繼續(xù)培養(yǎng)至滿(mǎn)皿后，每皿加10mL無(wú)菌水洗脫孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算產(chǎn)孢量，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)濃度對(duì)數(shù)(X)與菌落生長(zhǎng)相對(duì)抑制率的機(jī)率值(Y)求取提取物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程Y=a+bX和相關(guān)系數(shù)(r)，并計(jì)算

5、抑制菌落擴(kuò)展的有效中濃度EC及EC。相對(duì)抑制率(%)=x1001.5肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌分生孢子萌發(fā)的影響吸取100L芒果炭疽病等病菌的分生孢子懸浮液均勻涂布在含肉桂醛濃度為0、10、15、20、25、30、35、40mg/L的PDA平板上，每處理重復(fù)5次，25下培養(yǎng)，在10 x20倍的顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，當(dāng)空白對(duì)照孢子萌發(fā)率達(dá)90以上時(shí)開(kāi)始調(diào)查，調(diào)查孢子總數(shù)不少于200個(gè)，觀察肉桂醛對(duì)孢子形態(tài)的影響，并記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)(視孢子芽管長(zhǎng)度大于孢子的短半徑為萌發(fā))，根據(jù)濃度對(duì)數(shù)(X)與孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率的機(jī)率值(Y)求取提取物對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的毒力回歸方程Y=a+bX和相關(guān)系數(shù)(r)，

6、并計(jì)算抑制孢子萌發(fā)的有效中濃度EC及EC。孢子萌發(fā)率(%)=(孢子萌發(fā)熟/調(diào)查孢子總數(shù))x100；孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率(%)=x100。1.6肉桂醛防治芒果炭疽病的生理機(jī)制選健康無(wú)病芒果，70%酒精外表消毒后，單果分開(kāi)放入塑料盆，噴霧肉桂醛濃度為30mg/L、清水以果面布滿(mǎn)液體為度后，待果面液體自然晾干后噴霧接種芒果炭疽病菌分生孢子懸浮液濃度為10個(gè)/mL，同樣以果面布滿(mǎn)霧點(diǎn)為度，5次重復(fù)。于0、24、48、72、96、120、148h隨機(jī)取樣，每處理取果3個(gè)，冰凍保存?zhèn)溆?。稱(chēng)取芒果樣品3g，參加10mL50mmol/LpH8.8硼酸鹽緩沖液內(nèi)含1聚乙烯毗咯烷酮，冰浴中研磨勻漿，在4下8000r

7、/min離心15min，上清液用于丙二醛的含量和PAL活性測(cè)定。另稱(chēng)取樣品3g，參加10mL50mmol/LpH7.8磷酸緩沖液內(nèi)含1聚乙烯毗咯烷酮，冰浴中研磨勻漿，在4下8000r/min離心15min，上清液用于POD、SOD活性及可溶性蛋白質(zhì)含量的分析?？扇苄缘鞍椎暮繙y(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)顯色法，MDA含量測(cè)定采用TBA比色法，SOD采用氮藍(lán)四唑 Concentration of cinnamaldehyde 接種后時(shí)間Day after inoculating(d) 4 7 10 13 病情指數(shù)Disease index 防治效果 Control efficacy 病情指數(shù)Disease

8、 index 防治效果 Control efficacy 病情指數(shù)Disease index 防治效果 Control efficacy 病情指數(shù)Disease index 防治效果 Control efficacy 40 1.11 94.55 a 18.89 78.75 a 35.56 64.44 a 40.00 60.00 a 35 1.11 94.55 a 21.11 76.25ab 35.56 64.44 a 41.11 58.89 a 30 3.33 83.65 b 23.33 73.75bc 38.89 61.11ab 43.33 56.67ab 25 3.7 81.84bc 25

9、.56 71.25 c 45.56 54.44bc 63.33 36.67 c 20 3.7 81.84bc 34.57 61.11 d 61.73 38.27 d 70.37 29.63 d 15 7.41 63.62 d 51.85 41.67 e 79.63 20.37 e 88.89 11.11 e 10 10 50.91 e 63.33 28.75 f 81.11 18.89 f 95.56 4.44 e CK 20.37 88.89 100 100 2.2肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的毒力及對(duì)產(chǎn)孢的影響肉桂醛對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)抑制的毒力方程為y=2.8696x+0.4499(r=0.97

10、42)，有效中濃度EC為38.51mg/L，EC為176.18mg/L；肉桂醛對(duì)病菌產(chǎn)孢影響測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，低濃度肉桂醛可以促進(jìn)炭疽病菌較早產(chǎn)孢，但當(dāng)濃度30mg/L，病菌的產(chǎn)孢量開(kāi)始下降，分生孢子的形成量?jī)H為空白對(duì)照的8.31%，當(dāng)肉桂醛濃度40mg/L時(shí)，可完全抑制病菌產(chǎn)孢。2.3肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌分生孢子萌發(fā)的毒力測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌分生孢子萌發(fā)抑制的毒力方程為y=3.6707x+0.0484r=0.9693，有效中濃度EC為22.34mg/L，EC為75.67mg/L。鏡檢發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肉桂醛濃度15mg/L時(shí)，主要引起芽管產(chǎn)生畸形，萌發(fā)率下降圖1-B。當(dāng)肉桂醛濃度40mg/L時(shí)，

11、病菌分生孢子萌發(fā)受到抑制，且細(xì)胞壁發(fā)生消解，原生質(zhì)外滲圖1-C。ABC圖1肉桂醛對(duì)芒果炭疽菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.1InhibitionofcinnamaldehydeagainstconidiaofColletotrichumgloeosporioides注：A:正常萌發(fā)菌絲；B：肉桂醛濃度為15mg/LC:肉桂醛濃度為40mg/LNote：A:NormalconidiaofC.gloeosporioides,B:Thecinnamaldehydeat15mg/L,C:Thecinnamaldehydeat40mg/L2.4芒果內(nèi)可溶性蛋白含量的變化各處理芒果內(nèi)可溶性蛋白含量變化測(cè)定

12、結(jié)果說(shuō)明圖2，清水處理的芒果內(nèi)可溶性蛋白在試驗(yàn)期間保持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的上升狀態(tài)，可能原因是隨著芒果的成熟其體內(nèi)可溶性蛋白含量逐漸提高。病菌+肉桂醛處理的芒果內(nèi)可溶性蛋白含量的變化趨勢(shì)與清水相似，但上升值略偏低。肉桂醛和炭疽處理的芒果體內(nèi)可溶性蛋白均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中肉桂醛在72h時(shí)上升到最大值，炭疽處理的芒果其峰值出現(xiàn)推遲24h。可能是肉桂醛和炭疽刺激了芒果體內(nèi)可溶性蛋白的大量產(chǎn)生，可溶性蛋白參與了一系列寄主抗病性相關(guān)酶的合成，提高了芒果對(duì)炭疽的抗性。圖2芒果各處理可溶性蛋白含量的變化Fig.2Changesofcontentofsolubleproteinsinmango2.5芒

13、果內(nèi)丙二醛濃度的變化芒果各處理MDA濃度變化測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，清水處理的芒果內(nèi)MDA含量沒(méi)有什么明顯的變化；肉桂醛處理芒果內(nèi)MDA含量呈上升趨勢(shì)，但變化的幅度不大，后期含量與清水處理的含量相當(dāng)。炭疽和肉桂醛+炭疽的變化趨勢(shì)根本一致，在接種以后，兩者含量都是明顯增加，只是增加的幅度不一樣，炭疽處理的芒果內(nèi)MDA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肉桂醛+炭疽處理，120h后單獨(dú)接種炭疽的芒果體內(nèi)含量是清水處理的3.956倍，而共同接種處理比清水高84.5%。從總體上看，芒果內(nèi)MDA含量的變化與病害發(fā)生情況根本相吻合，因?yàn)槊⒐麅?nèi)MDA含量與細(xì)胞的損傷程度相關(guān)，這與前人的研究認(rèn)為寄主體內(nèi)MDA含量是膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)重要標(biāo)志

14、，它與寄主細(xì)胞膜的損傷程度直接相關(guān)的結(jié)果相符。肉桂醛處理后再接種炭疽，可使芒果內(nèi)MDA濃度與單獨(dú)接種病菌相比大大降低，可能是由于肉桂醛具有保護(hù)細(xì)胞脂膜過(guò)氧化的功能，降低了MDA的形成。圖3芒果各處理丙二醛濃度的變化Fig.3Changesofmalondialdehydelevelinmango2.6芒果內(nèi)過(guò)氧化物酶POD活性變化各處理芒果內(nèi)過(guò)氧化物酶POD活性變化測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，四個(gè)處理芒果內(nèi)POD活性變化趨勢(shì)根本相似，均呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，四個(gè)處理的上升趨勢(shì)分別為病菌肉桂醛+炭疽清水肉桂醛。由此可以推斷，接種炭疽后芒果內(nèi)超氧自由基(O-)、HO或過(guò)氧化物產(chǎn)生較多，對(duì)寄主損傷也較大，導(dǎo)致芒果內(nèi)P

15、OD活性變化大，而肉桂醛可以減少這類(lèi)物質(zhì)的形成，從而使POD活性的變化趨勢(shì)降低。圖4芒果各處理POD活性的變化Fig.4DynamicchangesofPODactivityinmango2.7芒果內(nèi)超氧化物歧化酶SOD活性變化各處理芒果內(nèi)超氧化物岐化酶SOD的活性變化測(cè)定結(jié)果說(shuō)明，四個(gè)處理的芒果內(nèi)SOD活性變化沒(méi)有什么明顯的差異，在整個(gè)處理階段處于上升階段，且上升幅度不大。圖5芒果各處理SOD活性的變化Fig.5DynamicchangesofSODactivityinmango2.8芒果內(nèi)苯丙氨酸解氨酶PAL活性變化由圖3-14可以看出，各處理芒果內(nèi)苯丙氨酸解氨酶PAL的活性變化測(cè)定結(jié)果說(shuō)

16、明，清水和肉桂醛處理的芒果內(nèi)PAL活性的變化在整個(gè)處理階段處于下降趨勢(shì)，下降幅度在50%左右。然而炭疽、肉桂醛+炭疽處理出現(xiàn)了明顯不同的變化趨勢(shì)，炭疽處理的芒果內(nèi)PAL活性呈不斷上升的趨勢(shì)。說(shuō)明接種炭疽后能夠誘導(dǎo)芒果內(nèi)PAL酶活性的提高，PAL是苯丙烷類(lèi)代謝合成反響中的定速酶，催化苯丙氨酸裂解，生成反式肉桂酸，該物質(zhì)迅速轉(zhuǎn)入植保素合成的莽草酸途徑體系中，其中的許多物質(zhì)具有抑制病原菌生長(zhǎng)的活性，是過(guò)敏性代謝中的重要酶類(lèi)，而肉桂醛處理后芒果受害程度降低，從而使其活性升高值偏低。圖6芒果各處理PAL活性的變化Fig.6DynamicchangesofPALactivityinmango3討論植物源農(nóng)

17、藥作為生物農(nóng)藥的一種，由于其原材料取自于天然植物，自然界有其順暢的降解途徑，具有無(wú)殘留、無(wú)公害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治。植物中具有抗菌、殺菌活性物質(zhì)主要是萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)香豆素、木脂素、苷類(lèi)、醌類(lèi)、胺類(lèi)、甾類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、有機(jī)酸及植物精油類(lèi)等化合物。這類(lèi)物質(zhì)的作用機(jī)理主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性、增強(qiáng)寄主保鮮及貯藏能力等方面；對(duì)病原菌表現(xiàn)在抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生、附著胞及侵入絲的形成等方面。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)肉桂醛處理后，芒果體內(nèi)O-等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生量明顯低于病菌處理，說(shuō)明肉桂醛可以減低病菌對(duì)芒果細(xì)胞組織的損傷，減小了芒果因病菌侵染而導(dǎo)致防御酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂的程

18、度，使寄主保持根本正常的生理狀態(tài)。肉桂醛與芒果炭疽病菌共同培養(yǎng)時(shí)，可使病菌的菌絲體形態(tài)產(chǎn)生異常，長(zhǎng)時(shí)間后可致菌絲聚集成簇或原生質(zhì)外滲；且可干擾芒果炭疽菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)，不僅能抑制分生孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)，還能影響分生孢子的形成，并可致分生孢子發(fā)生消解。因此可以推斷，肉桂醛防治芒果炭疽病的機(jī)理：通過(guò)抑制病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子形成及孢子萌發(fā)等，直接殺傷病菌，減少病菌的侵入，到達(dá)防病效果；肉桂醛可以在一定程度上消除O-等活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生，減小芒果防御酶系統(tǒng)發(fā)生紊亂的程度，從而抑制和減輕病害的發(fā)生。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，低濃度肉桂醛對(duì)病菌表現(xiàn)抑制作用，高濃度時(shí)那么直接顯示出殺菌作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

19、本文采用植物源抑菌物質(zhì)肉桂醛為試驗(yàn)材料，對(duì)其抑制芒果炭疽菌的有效中濃度進(jìn)行了測(cè)定，并采用不同濃度肉桂醛對(duì)芒果炭疽病防治效果進(jìn)行了研究，獲得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，為肉桂醛作為新型農(nóng)藥開(kāi)發(fā)利用奠定了理論根底。參考文獻(xiàn)1 ESTRADAA A B, DODDB J C, JEFFRIESC P. Effect of humidity and temperature on conidial germination and appressorium developmentof two Philippine isolates of the mango anthracnose pathogen Colletot

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