蛋白質(zhì)與酶工程知識點完-僅供

1、-. z.1、易錯PCR:通過調(diào)整反響條件來使PCR擴(kuò)增過程中復(fù)制錯配率增加，在目的基因中隨機(jī)引入突變，繼而獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體 * 提高鎂離子濃度或參加錳離子 * 降低體系中一種的dNTP濃度至少5-10% * 運用低保真度DNA聚合酶 * 增加DNA聚合酶的濃度 屬于無性進(jìn)化：單一基因進(jìn)展遺傳突變，費力、耗時，多用于小片段800bp以下酶的概念：酶是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對其特異底物substrate具有高效催化作用的生大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸輔酶:與酶蛋白結(jié)合疏松，可用透析或超濾的方法除去(NAD+)。 輔基 :與酶蛋白結(jié)合嚴(yán)密，不能用透析或超濾的方法除去(FAD、FMN) 酶的活性

2、中心：或稱活性部位，指必需基團(tuán)在空間構(gòu)造上彼此靠近，組成具有特定空間構(gòu)造的區(qū)域，能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。4、抗體酶或催化抗體：是具有催化功能的抗體。本質(zhì)：免疫球蛋白，即具有催化作用的免疫球蛋白5、酶促反響特點：酶促反響具有極高的效率 酶促反響具有高度的特異性：絕對特異性、相對特異性、立體構(gòu)造特異性酶促反響的可調(diào)節(jié)性：對酶量的調(diào)節(jié)，對酶活性的調(diào)節(jié)誘導(dǎo)契合假說：酶與底物相互接近時，其構(gòu)造相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說 。底物濃度對反響速度的影響：當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時：反響速度與底物濃度成正比；反響為一級反響。隨著底物濃度的增加：反響速度不

3、再成正比例加速；反響為混合級反響。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度：反響速度不再增加，達(dá)最大速度；反響為零級反響Km與Vma*的意義不可逆性抑制作用：抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心或活性中心以外的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活?？赡嫘砸种谱饔茫阂种苿┩ǔＲ苑枪矁r鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。類型：競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制。三種抑制劑的特點酶的調(diào)節(jié)：酶活性的調(diào)節(jié)快速調(diào)節(jié)酶原與酶原的激活變構(gòu)別構(gòu)酶酶的共價修飾調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)緩慢調(diào)節(jié)酶蛋白合成的誘導(dǎo)和阻遏酶降解的調(diào)控酶原激活的意義 防止細(xì)胞產(chǎn)生的酶對細(xì)胞進(jìn)展自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中

4、發(fā)揮作用，保證體代正常進(jìn)展。消化管的蛋白酶有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。凝血酶與纖溶酶類變構(gòu)調(diào)節(jié)一些代物可與*些酶分子活性中心外的*局部可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié)兩種操縱子：乳糖操縱子、色氨酸操縱子14：細(xì)胞破碎法：實驗室小規(guī)模旋刀勻漿法研磨法高速珠磨法反復(fù)凍融滲透壓破碎法超聲勻漿法大規(guī)模提?。焊邏簞驖{法解吸方法-洗脫原理 加大反離子的濃度，常用的反離子是NaCl改變?nèi)芤旱膒H改變結(jié)合基團(tuán)的電荷 同時改變pH與離子強(qiáng)度交換劑選擇的一般原則： *酶蛋白穩(wěn)定存在的pHpI，用陰離子交換劑 *兩種pH條

5、件下均能穩(wěn)定存在，二種交換劑均可 4、蛋白質(zhì)與酶的構(gòu)造和功能 氨基酸的分類：拉氏構(gòu)象圖：兩相鄰肽鍵平面可相對旋轉(zhuǎn)構(gòu)象角,：圍繞C旋轉(zhuǎn)的構(gòu)象與角度18、蛋白質(zhì)一級構(gòu)造：多肽鏈中氨基酸的排列順序。主要化學(xué)鍵：肽鍵+二硫鍵螺旋(-heli*)：多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的右手螺旋構(gòu)象。簡言之，各個肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)形成的右手螺旋構(gòu)象。兩親性螺旋：重要氨基酸側(cè)鏈從螺旋骨架伸出，形成螺旋外表一側(cè)親水帶電、極性，一側(cè)疏水易形成疏水核或疏水外表聚合的特性。螺旋轉(zhuǎn)輪：螺旋沿著螺旋軸的二維投射圖，可以判斷alpa螺旋是否具有兩親性。影響-螺旋穩(wěn)定因素：側(cè)鏈基團(tuán)空間位阻：如Ile、Trp、Ph

6、e側(cè)鏈基團(tuán)；連續(xù)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)帶有一樣電荷同種電荷互斥Pro等亞氨基酸存在不能形成氫鍵,且C參與吡咯環(huán)形成，環(huán)C-N和C-N鍵不能旋轉(zhuǎn)。motif 的層次、線性motif 的概念重要21、四級構(gòu)造：兩條和兩條以上多肽寡聚蛋白或多聚蛋白質(zhì)形成的高級構(gòu)造。亞基種類、數(shù)目、空間排布以及亞基互作是四級構(gòu)造穩(wěn)定因素。 5、 蛋白質(zhì)與酶的修飾技術(shù)酶分子修飾的概念和意義：概念：通過各種方法改變蛋白/酶的分子構(gòu)造，從而改變其*些特性和功能。主要途徑有化學(xué)途徑和分子生物學(xué)途徑。意義：提高蛋白/酶的活力,滿足/適應(yīng)生產(chǎn)工藝的要求增強(qiáng)蛋白/酶的穩(wěn)定性提高、降低或消除蛋白/酶的抗原性研究和了解蛋白/酶的構(gòu)造：彌補(bǔ)天然

7、蛋白的缺乏，賦予優(yōu)良性狀2、化學(xué)修飾的手段與方法：經(jīng)常被修飾的殘基：親核：絲、半胱、甲硫、賴、組 親點：酪、色3、側(cè)鏈基團(tuán)的修飾1羧基修飾反響-水溶性碳二亞胺類最標(biāo)準(zhǔn)、硼氟化三甲烊鹽2氨基修飾：采用*些化合物使酶分子側(cè)鏈氨基發(fā)生改變，從而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法稱為氨基修飾 亞硝酸2，4，6-三硝基苯磺酸TNBS、3巰基修飾：巰基在許多酶中是活性中心的催化基團(tuán)，巰基還可與另一巰基形成二硫鍵，因此對穩(wěn)定酶的構(gòu)造和發(fā)揮催化功能具有重要的作用。常用修飾劑：烷基化試劑碘乙酸、碘乙酰胺、馬來酰亞胺4咪唑基修飾：組氨酸(咪唑基)位于許多酶的活性性中心。常用咪唑基修飾劑：焦碳酸二乙酯DPC和碘代乙酸5酚羥

8、基酪氨酸修飾反響：Tyr酪氨酸殘基修飾主要是酚羥基的修飾，Thr和Ser殘基修飾為羥基修飾，但反響條件苛刻6胍基(精氨酸化學(xué)修飾反響：采用二羰基化合物與胍基反響生成穩(wěn)定的雜環(huán)，從而改變酶分子空間構(gòu)象的方法。修飾劑：丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、丙二醛和苯乙二醛二羰基化合物7吲哚基(色氨酸)化學(xué)修飾反響：大分子結(jié)合共價修飾：修試劑：聚乙二醇PEG、單甲氧基聚乙二醇MPEG、右旋糖酐5、分子交聯(lián)修飾：雙功能基團(tuán)化合物雙功能試劑：戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，在酶蛋白分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶穩(wěn)定性的修飾方法。6、金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，

9、使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。作用如下：說明金屬離子對酶催化作用的影響提高酶活力增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性改變酶的動力學(xué)特性氨基酸化學(xué)置換修飾：將酶分子肽鏈上的*一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法。缺點：難度大，本錢高，專一性差，而且對酶分子逐個進(jìn)展修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。蛋白質(zhì)片段嵌合修飾：一個天然多肽與一個人造多肽或化學(xué)修飾相締合，產(chǎn)生半合成構(gòu)造分子生物學(xué)方法：定點突變技術(shù)10:、細(xì)胞修飾： 6、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計蛋白質(zhì)分子設(shè)計的分類小改：定位突變和化學(xué)修飾中改：構(gòu)造域進(jìn)展拼接組裝大改：完全從頭設(shè)計全新的蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)與酶分子設(shè)計原理重要核假設(shè)：蛋白質(zhì)在進(jìn)化中，由氫鍵連接的二級構(gòu)造保

10、守部單元組成區(qū)域骨架。部密堆積，無重疊。部氫鍵是最大限度滿足的(主鏈及側(cè)鏈)。最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)需合理分布：需安排少量的疏水基團(tuán)在外表，少量的親水基團(tuán)在部。金屬蛋白配位殘基的替換應(yīng)滿足金屬配位幾何，且金屬中心與外圍第二殼層相互作用十分重要構(gòu)造和功能具有專一性蛋白質(zhì)設(shè)計最困難問題先導(dǎo)化合物：即原型物，是通過各種途徑或方法得到的具有一定生物活性的化學(xué)物質(zhì)，有可能進(jìn)一步優(yōu)化活性不高、特異性差、毒副作用大、或藥代動力學(xué)性質(zhì)差而得到供臨床使用的藥物。4、不同氨基酸的特征：估計就選擇：5、從頭設(shè)計法：是指基于對蛋白質(zhì)折疊規(guī)律的認(rèn)識，從氨基酸的序列出發(fā)，設(shè)計制造自然界中不存在的全新蛋

11、白質(zhì)，使之具有特定的空間構(gòu)造和預(yù)期的功能。固定化酶與固定化細(xì)胞酶固定化：采用各種方法，將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶的過程成為酶的固定化。方法：吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法.四種方法的比擬吸附法： 利用各種固體吸附劑將酶或含酶細(xì)胞吸附在其外表上而使酶固定的方法，又稱為物理吸附法常用吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔瓷優(yōu)點：操作簡便、條件溫和、不易變性失活、載體廉價、可反復(fù)使用。缺點：酶與載體結(jié)合不結(jié)實，易脫落包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。根據(jù)包埋的材料和包埋方法的不同，可分為：凝膠包埋法和半透膜包埋法微囊化法凝膠包埋法：半透膜包埋法：適用于底物和產(chǎn)物都

12、是小分子的酶的固定化。半透膜：聚酰胺膜、火棉 膠膜等結(jié)合法：分為離子鍵結(jié)合法和共價鍵結(jié)合法離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素。優(yōu)點：條件溫和、操作簡便、活力損失少。缺點：酶與載體結(jié)合不結(jié)實，使用時需嚴(yán)格控制好pH值、離子強(qiáng)度、溫度等操作條件。共價鍵結(jié)合法：通過共價鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。方法：重氮法、疊氮法、溴化氰發(fā)、烷基化法4) 交聯(lián)法：利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)展交聯(lián)反響，以制備固

13、定化酶的方法。交聯(lián)試劑：戊二醛常用、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。 優(yōu)點：結(jié)合結(jié)實，酶不會脫落，可長時間使用。 缺點：交聯(lián)反響條件劇烈，酶的多個基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶的活力損失大。制備的固定化酶顆粒較小，不便于使用。2、細(xì)胞的固定化：固定在載體上并在一定空間圍進(jìn)展生命活動的細(xì)胞。常用凝膠包埋法優(yōu)點：缺點：3、固定化酶優(yōu)點：缺點：酶的非水相催化非水介質(zhì)酶催化反響優(yōu)點：2、酶的非水相催化類型：有機(jī)介質(zhì)中的酶催化：酶在含有一定量水結(jié)合水和溶劑水的有機(jī)溶劑中進(jìn)展的催化反響。反響體系：A.微水介質(zhì)體系、B.與水溶性有機(jī)溶劑組成的均一體系、C.與水不溶性有機(jī)溶劑組成的兩相或多相體系、D.正膠束體系水包油、

14、E.反膠束體系油包水 適用于：疏水性物質(zhì)底物或產(chǎn)物的酶催化作用反響體系：兩相界面進(jìn)展最適水含量：催化反響速度到達(dá)最大時的水含量水活度：描述有機(jī)溶劑中酶活性與水含量關(guān)系，即為一定壓力和溫度下，反響體系中的水摩爾分?jǐn)?shù)與水活度系數(shù)的乘積。它看直接反映體系中的水分情況，與反響體系中的水含量和有機(jī)溶劑的極性無關(guān)。不同的酶有不同的最正確水活度。極性系數(shù)lgP：反響有機(jī)溶劑與酶活力之間的關(guān)系P為溶劑在正辛醇和水中的分配系數(shù)。lgP越大，說明其極性越小，疏水性越強(qiáng)。極性較強(qiáng)有機(jī)溶劑，會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境水化層，降低酶催化活性，甚至導(dǎo)致酶變性失活。一般選用2lgP4的有機(jī)溶劑作為有機(jī)介質(zhì)為宜氣相介質(zhì)中的酶催化：適于底物為氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體物質(zhì)的酶催化反響。超臨界流體介質(zhì)中的酶催化：超臨界流體：溫度和壓力超過*物質(zhì)超臨界點的流體。常見的有：CO2、水、氨、甲醇、乙醇、乙烯。超臨界流體具備的條件：離子液介質(zhì)中的酶催化：離子液：在室溫條件下，有機(jī)/無機(jī)陰-陽離子低熔點鹽