土壤與環(huán)境微生物研究法

1、 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark0 o Current Document 第七章土壤微生物區(qū)系分析92 HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 第一節(jié)一般土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)92 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 一、稀釋平板法92 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 二、MPN稀釋法94 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 三、土粒法96第二節(jié)厭氧微生物的分離96 HYP

2、ERLINK l bookmark12 o Current Document 一、充氮厭氧培養(yǎng)法96 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 二、焦性沒(méi)食子酸吸氧法97 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 三、專(zhuān)性厭氧細(xì)菌的分離法98 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 第三節(jié)土壤主要類(lèi)群微生物的分離與計(jì)數(shù)99 HYPERLINK l bookmark24 o Current Document 一、好氧細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)99 HYPERLINK l book

3、mark26 o Current Document 二、絲狀真菌的分離與計(jì)數(shù)100三、放線(xiàn)菌的分離與計(jì)數(shù)100 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 第四節(jié)土壤中功能微生物的測(cè)定101 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 一、氨化細(xì)菌的測(cè)定101 HYPERLINK l bookmark36 o Current Document 二、硝化細(xì)菌的測(cè)定102 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 三、反硝化細(xì)菌的測(cè)定104 HYPERLINK l bookma

4、rk52 o Current Document 四、好氧性自生固氮細(xì)菌的測(cè)定105 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 十一、纖維分解菌的測(cè)定106 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 十二、光合細(xì)菌的測(cè)定108 HYPERLINK l bookmark70 o Current Document 十三、甲烷產(chǎn)生菌的測(cè)定109 HYPERLINK l bookmark72 o Current Document 十四、有機(jī)污染物降解菌的測(cè)定110 HYPERLINK l bookmark74 o Cur

5、rent Document 十五、重金屬抗性菌的測(cè)定111 HYPERLINK l bookmark76 o Current Document 第八章根圈微生物分析111 HYPERLINK l bookmark78 o Current Document 第一節(jié)根圈細(xì)菌的分析112 HYPERLINK l bookmark80 o Current Document 一、根圈的分區(qū)112 HYPERLINK l bookmark82 o Current Document 二、根圈細(xì)菌的分離112 HYPERLINK l bookmark86 o Current Document 三、根圈優(yōu)勢(shì)菌株

6、的分群114第二節(jié)植物組織內(nèi)微生物的分離115 HYPERLINK l bookmark90 o Current Document 一、植物材料的選擇116 HYPERLINK l bookmark92 o Current Document 二、組織表面消毒116 HYPERLINK l bookmark98 o Current Document 三、分離方法117 HYPERLINK l bookmark100 o Current Document 第十五章土壤微生物生物量的測(cè)定119 HYPERLINK l bookmark110 o Current Document 第一節(jié)土壤樣品采集與

7、預(yù)處理119 HYPERLINK l bookmark112 o Current Document 第二節(jié)土壤微生物生物量碳分析120 HYPERLINK l bookmark114 o Current Document 一、熏蒸提取容量分析法120 HYPERLINK l bookmark134 o Current Document 第三節(jié)土壤微生物生物量氮分析124 HYPERLINK l bookmark136 o Current Document 一、熏蒸提取全氮測(cè)定法125 HYPERLINK l bookmark142 o Current Document 二、熏蒸提取茚三酮比色法

8、127 HYPERLINK l bookmark148 o Current Document 第四節(jié)土壤微生物生物量磷分析129 HYPERLINK l bookmark150 o Current Document 一、熏蒸提取全磷測(cè)定法129第十七章土壤生物化學(xué)過(guò)程強(qiáng)度測(cè)定130 HYPERLINK l bookmark152 o Current Document 第一節(jié)土壤呼吸作用130 HYPERLINK l bookmark154 o Current Document 一、密閉靜置培養(yǎng)測(cè)CO2法130 HYPERLINK l bookmark166 o Current Document

9、 二、通氣培養(yǎng)測(cè)002法131 HYPERLINK l bookmark168 o Current Document 三、田間收集C02法132 HYPERLINK l bookmark170 o Current Document 第二節(jié)土壤氨化作用133 HYPERLINK l bookmark172 o Current Document 一、土壤培養(yǎng)法133 HYPERLINK l bookmark174 o Current Document 二、氨化菌培養(yǎng)液培養(yǎng)法134 HYPERLINK l bookmark176 o Current Document 第三節(jié)土壤硝化作用135 HYP

10、ERLINK l bookmark214 o Current Document 一、土壤培養(yǎng)法136 HYPERLINK l bookmark190 o Current Document 二、培養(yǎng)基接種土壤懸液法137 HYPERLINK l bookmark194 o Current Document 三、純菌培養(yǎng)法138 HYPERLINK l bookmark196 o Current Document 四、環(huán)流法139 HYPERLINK l bookmark202 o Current Document 第四節(jié)土壤反硝化作用140 HYPERLINK l bookmark204 o C

11、urrent Document 一、硝酸鹽消失法140 HYPERLINK l bookmark210 o Current Document 二、氣相色譜法142 HYPERLINK l bookmark212 o Current Document 第五節(jié)土壤固氮作用145一、土壤培養(yǎng)測(cè)全氮法145 HYPERLINK l bookmark220 o Current Document 二、無(wú)氮培養(yǎng)液培養(yǎng)法146 HYPERLINK l bookmark224 o Current Document 三、乙炔還原法147 HYPERLINK l bookmark226 o Current Docu

12、ment 第六節(jié)土壤磷素的轉(zhuǎn)化作用151 HYPERLINK l bookmark228 o Current Document 第十八章土壤酶活性測(cè)定152 HYPERLINK l bookmark230 o Current Document 第一節(jié)氧化還原酶153 HYPERLINK l bookmark232 o Current Document 一、脫氫酶153二、多酚氧化酶154 HYPERLINK l bookmark250 o Current Document 三、過(guò)氧化氫酶155 HYPERLINK l bookmark264 o Current Document 四、過(guò)氧化物酶

13、156 HYPERLINK l bookmark274 o Current Document 五、硝酸還原酶158 HYPERLINK l bookmark286 o Current Document 六、亞硝酸還原酶159 HYPERLINK l bookmark300 o Current Document 七、硫酸鹽還原酶160 HYPERLINK l bookmark304 o Current Document 第二節(jié)水解酶161 HYPERLINK l bookmark306 o Current Document 一、脲酶161二、蛋白酶163 HYPERLINK l bookmark

14、322 o Current Document 三、a-淀粉酶和住淀粉酶164 HYPERLINK l bookmark330 o Current Document 四、脂肪酸165 HYPERLINK l bookmark332 o Current Document 五、轉(zhuǎn)化酶（蔗糖酶）166第七章土壤微生物區(qū)系分析土壤是微生物生活的大本營(yíng)，也是人類(lèi)開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤微生物區(qū)系（soilmicroflora）是指特定土壤生態(tài)系統(tǒng)中生活的微生物的數(shù)量和組成狀況，是反映土壤微生物生態(tài)特征的重要指標(biāo)。由于在不同的地理地帶、不同的土壤類(lèi)型、不同的季節(jié)和不同的土壤條件以及農(nóng)業(yè)措施等影響下

15、，微生物的數(shù)量組成是不同的，因此，對(duì)了解不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化及挖掘所需的土壤微生物資源，與對(duì)了解土壤基本理化性質(zhì)一樣，仍具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。第一節(jié)一般土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)從自然界或混有雜菌的培養(yǎng)體系中將所需要的微生物在培養(yǎng)基上形成單個(gè)菌落，稱(chēng)為菌種分離。分離土壤微生物的方法很多，但是所有的方法都有一定的局限性，因此也各有利弊.常用的有稀釋平板法、MPN（mostProbablenumber）稀釋法和土粒法。一、稀釋平板法稀釋平板法是測(cè)定土壤中活的微生物數(shù)量最常用的一種方法。該方法操作簡(jiǎn)便，而且可以同時(shí)從土壤中分離獲取較多種類(lèi)的微生物，井進(jìn)行計(jì)數(shù)。（一）基本原理本方法是基于這

16、樣的假設(shè)，即當(dāng)已知質(zhì)量的土壤在適量的溶液中攪拌的時(shí)候，微生物與土粒分開(kāi)，這些分開(kāi)的微生物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)成為分散的菌落，根據(jù)菌落數(shù)換算得單位重量土壤中微生物的數(shù)量。土壤中微生物的數(shù)量很多，因此必須取少量樣品制成土壤懸液，然后稀釋?zhuān)拱l(fā)育在培養(yǎng)皿中的菌落可以很好地分散開(kāi)來(lái)，以便于計(jì)數(shù)和移植。（二）操作步驟1）用1100感量的天秤稱(chēng)取10g土樣加入盛有100mL無(wú)菌水的500mL三角瓶中。同時(shí)稱(chēng)取待測(cè)土樣10llg（記下準(zhǔn)確質(zhì)量），經(jīng)105（2烘干8h，置于干燥器中，待冷卻后稱(chēng)重，按下式計(jì)算土壤含水量的百分?jǐn)?shù)。土壤含水量（）=（濕土重干土重）/濕土重*1002）將盛有10g土樣和100mL

17、無(wú)菌水的三角瓶放在振蕩機(jī)上振蕩10min,使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液。3）土壤分散后，吸取1mL土壤懸液到9mL稀釋液中（或吸5mL到45mL稀釋液中），依次按10倍法稀釋?zhuān)ǔＯ♂尩?0-6。所用的吸管在每次吸取懸液時(shí),在稀釋中反復(fù)吸人吹出懸液35次,以減少因管壁吸附而造成的誤差，并使懸液進(jìn)一步分散。4）根據(jù)各類(lèi)微生物在土壤中的數(shù)量多少選擇經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的懸液接種。一般真菌采用的稀釋度為10-3一10-1，放線(xiàn)菌為10-510-3，細(xì)菌為10-610-4，每一稀釋度必須重復(fù)35次，重復(fù)越多，越準(zhǔn)確。5）土壤懸液接種刮刀法先于滅菌培養(yǎng)皿中傾注18mL左右選擇性培養(yǎng)基，凝固后，用1mL

18、無(wú)菌吸管于瑚9表面加0.05mL（相當(dāng)于1/20ml）或用無(wú)菌移液槍吸50UL一定稀釋度的土壤懸液，然后立即用玻璃刮刀將懸液均勻地涂抹于瓊脂表面。混菌法吸取1mL懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷至45C的選擇性培養(yǎng)基約15mL與培養(yǎng)皿中的土懸液充分混勻，待凝固后倒置保溫培養(yǎng)。6）接種了土壤懸液的培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后倒置于2830C恒溫箱中培養(yǎng)一定時(shí)間（細(xì)菌23天，真菌35天，放線(xiàn)茵57天）后取出，細(xì)菌和放線(xiàn)苗選取出現(xiàn)菌落數(shù)在20200的培養(yǎng)皿，真菌選菌落數(shù)在10100的培養(yǎng)皿，被擴(kuò)散性細(xì)菌或真菌菌落占據(jù)瓊脂表面15的培養(yǎng)皿應(yīng)該剔除，因?yàn)樗鼈円种屏似渌涞恼０l(fā)育，從而造

19、成試驗(yàn)誤差。7）結(jié)果計(jì)算用刮刀法接種的計(jì)算方法：用混菌法接種的計(jì)算方法：通常以cfu（colonyformingunit）/g千土表示。（三）注意事項(xiàng)1）用同一支吸管接種同一樣本不同稀釋度的懸液于培養(yǎng)皿時(shí)，應(yīng)從高稀釋度開(kāi)始，然后依次接種較低稀釋度的懸液。2）分離細(xì)菌時(shí)，為了避免由于某些細(xì)菌菌落擴(kuò)散造成誤差，倒皿時(shí)培養(yǎng)基溫度不宜太高或待倒人的培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿微啟，倒置于6070C烘箱中1520min,待瓊脂表面冷凝水烘干或隔夜平板經(jīng)檢查確認(rèn)無(wú)菌后，用同法涂抹土壤懸液。3）分離芽孢桿菌時(shí),應(yīng)事先將樣品中無(wú)芽孢細(xì)菌殺死。所以要預(yù)先選取適當(dāng)稀釋度的土壤懸液于7580C水浴中煮15rain,然后再

20、按上述方法涂抹于瓊脂表面。4）稀釋平板法可因下列原因造成誤差,因而對(duì)土壤中實(shí)際存在的微生物數(shù)量可能估計(jì)過(guò)低：土壤懸液中有的菌成群聚集在一起或附在土粒上未被分散，因此在乎板上形成的菌落數(shù)比實(shí)際菌數(shù)低；稀釋液可能殺死某些微生物，有的抱子在這種條件下不Q9發(fā)芽，因而不能發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的菌落；有的細(xì)胞在操作過(guò)程中被吸附在管壁上；培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有較高的選擇性，以致相當(dāng)一部分微生物不能正常發(fā)育形成苗落，5）稀釋平板法并不是對(duì)所有的微生物類(lèi)群都同樣適用，一般來(lái)說(shuō)這個(gè)方法最適用于苗體大小和重量都差不多的類(lèi)群，如細(xì)菌和酵母。放線(xiàn)苗和真菌因菌體的不同部分的大小和質(zhì)量相差較大，如菌絲、抱子和其他抱子器等質(zhì)量大小均

21、有較大差異。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，用此法所得菌落多數(shù)從抱子發(fā)育而來(lái)，而且與菌絲發(fā)育而成的菌落不能區(qū)分。6）用此法時(shí)干擾結(jié)果的因素較多，因此各個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)操作程序的每一細(xì)節(jié)都應(yīng)有自己的規(guī)定，以便于結(jié)果之間的相互比較。二、MPN稀釋法對(duì)具特殊生理功能的細(xì)菌，常采用稀釋法計(jì)數(shù)，又稱(chēng)最大或然數(shù)法。如硝化菌、反硝化菌、厭氧固氮菌、硫化苗、反硫化菌、纖維素分解菌等。（一）基本原理本方法是基于選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)的土壤懸液，接種在特定的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再檢查培養(yǎng)液中是否有該生理類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)。根據(jù)不同稀釋度接種管的生長(zhǎng)情況，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法求出每克土壤中某生理類(lèi)群的微生物數(shù)量。（二）操作步驟1）土壤懸液制備方法同稀釋平板法1

22、）一3）。2）根據(jù)微生物各類(lèi)群在土壤中的大概數(shù)量選擇5個(gè)相連的稀釋度，將不同的稀釋度懸液分別接種至不同培養(yǎng)基的試管中。每管接懸液ImL,每一稀釋度重復(fù)5管（35管均可，重復(fù)越多，結(jié)果越準(zhǔn)確），即一個(gè)樣品每種培養(yǎng)基25管。3）于28C培養(yǎng)714天，根據(jù)各生理群的生長(zhǎng)或反映，分別記載結(jié)果。4）根據(jù)各稀釋系列試管中有無(wú)待測(cè)微生物生長(zhǎng)或其生理反映的正負(fù)得出數(shù)量指標(biāo)，并根據(jù)重復(fù)數(shù)量不同而在相應(yīng)的稀釋法測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表中查出細(xì)菌近似值。應(yīng)用稀釋計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)時(shí)，菌液稀釋度要合適，要求在稀釋系列中最低稀釋度的所有重復(fù)都應(yīng)有菌生長(zhǎng)，而必須最后一個(gè)最高稀釋度所有重復(fù)都沒(méi)有微生物生長(zhǎng)。確定數(shù)量指標(biāo)系取稀釋系列中所有重復(fù)都有

23、生長(zhǎng)（或呈正反應(yīng)）的最高稀釋度為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字。例如，稀釋度10-110-210-210-4，10-5生長(zhǎng)情況+-+重復(fù)數(shù)55420數(shù)量指標(biāo)為542，由表查得近似值為25。如果在所有重復(fù)試管內(nèi)都有微生物生長(zhǎng)的稀釋度之后仍有三個(gè)數(shù)字，則將最后二個(gè)數(shù)字加到前一個(gè)數(shù)字上。例如，稀釋度10-110-210-310-410-5生長(zhǎng)情況+-+重復(fù)數(shù)5則數(shù)量指標(biāo)為542+2=5445）結(jié)果計(jì)算每克干土中菌數(shù)二設(shè)樣品含水量為20，則干土為80每克干土中菌數(shù)=25*102*100/80三、土粒法對(duì)于在土壤中數(shù)量較少的某些微生物，有人采用將土粒直接按種在選擇性培養(yǎng)基上的方法來(lái)分離計(jì)數(shù)。如好氧性自生固氮菌、纖

24、維素分解苗及其他種類(lèi)的微生物等。（一）基本原理本法是把供試土壤顆粒，排列在適于某一生理類(lèi)群微生物生長(zhǎng)的選擇性固體培養(yǎng)基上，這一類(lèi)微生物的南落圍繞著顆粒發(fā)育起來(lái)。由這些顆粒在試樣中所占的百分?jǐn)?shù)可以得到這類(lèi)菌在土壤中的含量及其近似值。（二）操作步驟1）取少量土樣加無(wú)菌水調(diào)成糊狀。2）用粗細(xì)適當(dāng)?shù)膱A頭玻璃棒沾糊狀土樣，點(diǎn)在已凝固的選擇性瓊脂平板上。3）于28C培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀(guān)察生長(zhǎng)情況，結(jié)果以百分?jǐn)?shù)表示。即第二節(jié)厭氧微生物的分離厭氧微生物與好氧微生物的根本差別在于二者的呼吸機(jī)制不同。好氧微生物將氧作為生物氧化作用的最終受氫體，只有在有氧條件下才能生活。而厭氧微生物則只能在無(wú)氧條件下進(jìn)行無(wú)氧呼吸，以

25、葡萄糖的氧化物作為受氫體，有氧時(shí)反而對(duì)其有毒害作用。因此，在分離和培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)必須為其提供這兩個(gè)條件。厭氧細(xì)菌的常用培養(yǎng)基見(jiàn)第四章第三節(jié)。這里介紹幾種厭氧培養(yǎng)方法。一、充氮厭氧培養(yǎng)法（一）培養(yǎng)原理用真空泵抽去真空干燥器中的空氣，用氮?dú)?、二氧化碳或氫氣代替真空干燥器中培養(yǎng)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，可得表面茵落。（二）操作步驟1）將接種了不同稀釋度土壤懸液的瓊脂平板或試管置真空干燥器中，同時(shí)在干燥器中放人盛有美藍(lán)氧化還原指示劑的試管（或小三角瓶），以檢驗(yàn)干燥器內(nèi)是否確為無(wú)氧狀態(tài)，若美藍(lán)指示劑為無(wú)色則表示已經(jīng)無(wú)氧，如果指示劑呈盤(pán)色則表示仍有氧存在。2）在干燥器口加封閉油膏，蓋緊，進(jìn)行抽氣和換氣。將盛氮?dú)饣驓?/p>

26、氣的鋼瓶與真空干燥器及氣體抽換裝置連接（圖7-1）。3）先將真空干燥器出口活塞2打開(kāi)，關(guān)閉活塞3，打開(kāi)活塞1，使真空干燥器、壓力表、氣候干燥塔與真空泵聯(lián)通，然后進(jìn)行抽氣，使氣壓下降至002005個(gè)大氣壓時(shí)，先關(guān)閉活塞1，再停止抽氣。4）小心轉(zhuǎn)動(dòng)活塞3或鋼瓶減壓閥，使氫氣或氮?dú)饩従徚鹘?jīng)洗氣瓶進(jìn)入真空干燥器（注意放氣勿過(guò)猛），充氣到0.80.9個(gè)大氣壓，將活塞3或鋼瓶減莊閥關(guān)閉，開(kāi)動(dòng)真空泵抽氣，然后打開(kāi)活塞1。抽氣到002005個(gè)大氣壓后再行灌氣。如此反復(fù)2或3次。5）最后一次將真空干燥器內(nèi)氣壓加到略小于1個(gè)大氣壓。6）關(guān)閉真空干燥器活塞2。取下干燥器并用螺旋皮管夾將其管口夾緊，以免漏氣。真空干燥

27、器置3CC恒溫室培養(yǎng)1014天，待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出單個(gè)菌落后，即可由真空干燥器取出培養(yǎng)皿，計(jì)算菌落數(shù)或挑菌移置斜面。二、焦性沒(méi)食子酸吸氧法該方法利用焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中能吸收游離氧氣，可創(chuàng)造厭氧條件。每克焦性沒(méi)食子酸在過(guò)量堿液中能吸收100mL空氣中的氧。其吸氧變化如下：（一）實(shí)驗(yàn)試劑美藍(lán)氧化還原指示劑。介紹兩種配方，第一種配方：A液：0.006mol/L氫氧化鈉（NaOH）。B液：0.015美藍(lán)溶液。C液：6葡萄糖溶液。以上三種溶液在使用時(shí)等量混合，加熱使美藍(lán)褪色，迅速放人厭氧培養(yǎng)容器中。第二種配方：A液；0.04%（m/v）美藍(lán)，溶于O.2mol/L磷酸鹽溶液（pH7.0）B液：0.5%

28、（m/V）抗壞血酸液ImL。C液：0.6%（m/v）瓊脂8mL（瓊脂用量還可減少），只要能夠呈凝膠狀即可。先加熱瓊脂溶液，然后加A液和B液于指形管（75mm*lmm）中，總量5mL。有氧時(shí)表面為藍(lán)色圈，無(wú)氧時(shí)五色。不用時(shí)塞緊指型管，以免完全氧化。此管可反復(fù)使用。若藍(lán)色延伸至1t2以上時(shí)，則要在沸水浴中使指示劑還原褪色后再用。（二）操作步驟于真空干燥器（或大試管）中，先加入焦性沒(méi)食子酸若干克，即根據(jù)容器的體積按Is焦性沒(méi)食子酸能吸收100mL空氣中的氧來(lái)計(jì)算其應(yīng)加入量，然后按焦性沒(méi)食子酸與10%NaOH的比為1：10,加入相應(yīng)體積的10%NaOH,立即將培養(yǎng)皿（或試管培養(yǎng)物）和加熱褪色后的美藍(lán)氧

29、化還原指示劑放人真空干燥器（或大試管）中，蓋緊密封，以免漏氣圖72）。置30C恒溫培養(yǎng)。其余步驟與上面敘述的相同。三、專(zhuān)性厭氧細(xì)菌的分離法在分離專(zhuān)性厭氧細(xì)菌時(shí)，要求將各操作過(guò)程盡可能少地接觸空氣，方法如下：（一）培養(yǎng)基的制備按分離的對(duì)象配制培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基應(yīng)除去其中的溶解氧，如圖7-3所示，于調(diào)配過(guò)程不斷通人經(jīng)過(guò)高溫爐去除了殘余氧氣的氮?dú)?。（二）培養(yǎng)基加入待分離懸濁液的方法配制后的培養(yǎng)基注人待測(cè)液時(shí)，仍要避免接觸空氣，如圖74所示，邊通氮?dú)庥谑⒂信囵B(yǎng)基的圓底燒瓶中，邊用滴管（使用前進(jìn)行干熱滅菌，180C,30min）將培養(yǎng)基移人含有1mL適當(dāng)稀釋度待測(cè)懸液的試管中，在培養(yǎng)基移注過(guò)程中，該試管內(nèi)

30、亦應(yīng)不斷通人氮?dú)庖则?qū)除管內(nèi)空氣。移注后立即塞緊塞子，將管中內(nèi)含物混勻，待瓊脂凝固后置恒溫室（30C）培養(yǎng)1014天，待管壁附著的瓊脂上長(zhǎng)出單個(gè)菌落后即行分離。（三）分離菌株于上述培養(yǎng)過(guò)程長(zhǎng)出菌落的培養(yǎng)管中，邊通入不含氧的氮?dú)膺呌勉K金絲挑菌，挑出的菌體立即接種在斜面培養(yǎng)基上。接種時(shí)，被移植的斜面瓊脂管亦處在不斷通氮?dú)獾那闆r下進(jìn)行（圖7-5）。移接后立即用橡皮塞密封斜面培養(yǎng)基試管，待長(zhǎng)出菌苔后備用。第三節(jié)土壤主要類(lèi)群微生物的分離與計(jì)數(shù)土壤微生物（soilmlcroorgamsm）是指生活在土壤中借用光學(xué)顯微鏡才能看到的徼/J、生物。它包括不同的類(lèi)群微生物，如細(xì)菌、放線(xiàn)菌以及具有完善細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的真核

31、生物。它們是土壤物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的重要參與者，在土壤形成和發(fā)育、土壤肥力演變、養(yǎng)分有效化和有毒物質(zhì)降解等方面起著重要作用。這里主要指土壤中的細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌，也就是通常所說(shuō)的土壤三大苗的分離與計(jì)數(shù)。一、好氧細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)細(xì)菌是土壤微生物中數(shù)量最多的一個(gè)類(lèi)群。土壤細(xì)菌是一類(lèi)單細(xì)胞、無(wú)完整細(xì)胞核的生物。它占土壤微生物總數(shù)的7090，在每克土壤中的細(xì)菌的數(shù)量可達(dá)幾億乃至百億個(gè)。細(xì)菌菌體通常很小，直徑為0、20、5口m，長(zhǎng)度約幾微米，因而土壤細(xì)菌生物量并不高。它們的種類(lèi)和生理作用也極其復(fù)雜。一般情況下所分離得到的大多數(shù)細(xì)菌是腐生性的，在土壤有機(jī)碳氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著巨大作用。測(cè)定土壤細(xì)菌的數(shù)量通常采用

32、平板培養(yǎng)法。（一）培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，又稱(chēng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，一般認(rèn)為這種培養(yǎng)基上發(fā)育的細(xì)菌數(shù)量最多。其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)一、（一）。若分離芽孢桿菌，采用牛肉膏蛋白胨加麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基參見(jiàn)第四章第三節(jié)一、（一）。在這種培養(yǎng)基上芽抱桿菌的菌落不擴(kuò)展，而且菌落特征比較典型和穩(wěn)定，可以將土壤中常見(jiàn)的幾種芽孢桿菌直接鑒別到種。當(dāng)然，這必須要有足夠的經(jīng)驗(yàn)。（二）操作步驟參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”。二、絲狀真菌的分離與計(jì)數(shù)土壤真菌是指生活在土壤中菌體多呈分枝絲狀菌絲體，少數(shù)菌絲不發(fā)達(dá)或缺乏菌絲的具真正細(xì)胞核的一類(lèi)微生物，為化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)型。土壤真菌數(shù)量約為每克土含2萬(wàn)10萬(wàn)個(gè)繁殖體，雖數(shù)

33、量比土壤細(xì)菌少，但由于真菌菌絲體長(zhǎng)，真菌苗體遠(yuǎn)比細(xì)菌大。據(jù)測(cè)定，每克表土中真菌菌絲體長(zhǎng)度lo100m，每公頃表土中真菌苗體質(zhì)量可達(dá)5005000kg。真菌是參與土壤中有機(jī)質(zhì)分解過(guò)程的主要成員之。它們能引起纖維素及其類(lèi)似化合物的分解作用，同時(shí)也能分解含氮的蛋白質(zhì)類(lèi)化合物而釋放出氨氣。由于它們具有強(qiáng)盛的酶系統(tǒng)，分解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)的能力特別強(qiáng)。因此，在沒(méi)有開(kāi)墾的土壤中，它們的數(shù)量并不比細(xì)菌少。絲狀真菌數(shù)量的多少可反映土壤肥力及通氣狀況。測(cè)定土壤絲狀真菌的數(shù)量一般也采用平板培養(yǎng)法。（一）培養(yǎng)基采用馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)二、（一）”。為了抑制大部分細(xì)菌及放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)，1

34、000mL培養(yǎng)基溶液中應(yīng)加1盂加拉紅（roseBengal）水溶液3.3mL。臨用時(shí)每100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素液O3mL（30rogL）。（二）操作步驟參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”。三、放線(xiàn)菌的分離與計(jì)數(shù)土壤放線(xiàn)菌是指生活于土壤中呈絲狀單細(xì)胞、革蘭氏陽(yáng)性的原核微生物。放線(xiàn)菌在土壤中的分布也很廣，其數(shù)量?jī)H決于細(xì)菌，通常是細(xì)菌數(shù)量的1%10%，每克土壤中有10萬(wàn)個(gè)以上放線(xiàn)菌，占了土壤微生物總數(shù)的5%30%，其生物量與細(xì)菌接近。它們也積極參與土壤中不含氮及含氮有機(jī)化合物的分解作用。多種放線(xiàn)菌還能產(chǎn)生抗生素物質(zhì)。因此，放線(xiàn)菌與土壤肥力以及有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和植物病害防治有著更密切的關(guān)系，也是研究土壤微生

35、物不可忽視的一部分內(nèi)容。土壤放線(xiàn)菌數(shù)量的測(cè)定一般也采用平板培養(yǎng)法。（一）培養(yǎng)基采用改良高氏I號(hào)培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)四、（一）”。臨用時(shí)在已熔化的高氏I號(hào)培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀溶液，以抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。每300mL培養(yǎng)基中加3%重鉻酸酸鉀lmL（100mg/L）。（二）操作步驟參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”。第四節(jié)土壤中功能微生物的測(cè)定土壤中存在著各種細(xì)菌生理群以及降解性微生物，其中主要的有纖維分解細(xì)菌、固氮細(xì)菌、氮化細(xì)菌、硝化細(xì)苗和反硝化細(xì)菌等。它們?cè)谕寥鲤B(yǎng)分元素循環(huán)和污染物降解轉(zhuǎn)化中起著重要作用。因此，分離和認(rèn)識(shí)土壤中各種功能微生物對(duì)土壤微生物資源利用與開(kāi)發(fā)具有重要意義。一、

36、氨化細(xì)菌的測(cè)定氮化細(xì)苗類(lèi)群參與土壤中有機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨氣的生物學(xué)過(guò)程，叫做氨化作用（ammonificafion）。由于這類(lèi)細(xì)菌的活動(dòng)，使植物不能利用的有機(jī)含氮化合物轉(zhuǎn)化為可給態(tài)氮，為植物及一些自養(yǎng)和異養(yǎng)微生物繁殖與活動(dòng)創(chuàng)造了良好的營(yíng)養(yǎng)條件。因此，分析土壤中這類(lèi)細(xì)菌的組成與數(shù)量是很必要的。（一）平板培養(yǎng)法1培養(yǎng)墓采用牛肉膏蛋白胨瑚S培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)2操作步驟參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”，其上生長(zhǎng)的好氧細(xì)菌，均屬氨化細(xì)菌。1、蛋白胨氨化培養(yǎng)基（表7-1）培養(yǎng)基在普通濾紙上過(guò)濾，裝入試管（1.8craXl8cra），每管裝121C下滅菌30min。每個(gè)樣品需培養(yǎng)基20支試管。表7

37、-1蛋白胨氮化培養(yǎng)基奈氏試劑：溶解2gKI于5mL蒸餾水中。在此溶液中加入Hgl2小粒至溶解飽和為止（32g）,將12.4gKOH溶于約40mL蒸餾水中。將此溶液倒人Hgl溶液中，加水至l00mL，操作步驟選取4個(gè)稀釋度（如10-910-6）的土壤懸液，每一稀釋度的懸液接種4支試管（即4次重復(fù)），每管接種1mL。另取，4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下培養(yǎng)3天、5天后分別進(jìn)行檢查，根據(jù)培養(yǎng)基的混濁度、菌膜、沉淀、氣味、顏色等變化來(lái)判斷氨化細(xì)菌的有無(wú)（與對(duì)照管比較）。第七天用奈氏試劑定性測(cè)試有無(wú)氨的產(chǎn)生。從培養(yǎng)試管中吸取1或2滴培養(yǎng)液于白瓷板孔中，如加入1或2滴奈氏試劑后出現(xiàn)

38、棕紅的或淺褐色沉淀，即表示培養(yǎng)基內(nèi)有氨的產(chǎn)生。從測(cè)定記錄結(jié)果，按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和茵的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“MPN稀釋法”計(jì)算結(jié)果。二、硝化細(xì)菌的測(cè)定土壤中的硝酸鹽類(lèi)的積累，主要是由氨化作用所產(chǎn)生的氨，通過(guò)硝化細(xì)菌的活動(dòng)（硝化作用）氧化為硝酸，再與土壤中的金屬離子作用形成硝酸鹽。因此，土壤中硝化細(xì)菌的存在與活動(dòng)，對(duì)于土壤肥力以及植物營(yíng)養(yǎng)有著重要的意義。氨氧化為硝酸，是由兩類(lèi)細(xì)菌經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段完成的。第一階段是氨氧化為亞硝酸，由亞硝酸細(xì)菌（氨氧化細(xì)菌）來(lái)完成；第二階段是由亞硝酸氧化為硝酸，由硝酸細(xì)菌（亞硝酸氧化細(xì)菌）完成，兩者統(tǒng)稱(chēng)為硝化細(xì)菌。土壤中硝化細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定，一

39、般情況下只測(cè)定亞硝酸細(xì)菌的數(shù)量。因?yàn)橥寥乐校趸饔玫牡谝浑A段和第二階段是連續(xù)進(jìn)行的。土壤中很少發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽的積累。測(cè)定參與第一階段的亞硝酸細(xì)菌的數(shù)量，即能說(shuō)明硝化細(xì)菌數(shù)量的多少。（一）亞硝酸細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定培養(yǎng)基采用改良的斯蒂芬森培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)第四章將培養(yǎng)基在普通濾紙上過(guò)濾，裝入試管（1.8cm*18cm），每管裝5mL，121C下滅菌30min。實(shí)驗(yàn)試劑格利斯試劑是由兩種溶液組成：A液：將0.5g對(duì)氨基苯橫酸加到150mL的20稀乙酸溶液中。B液：將1ga萘胺加到20mL蒸餾水和150mL20%的稀乙酸溶液中。3操作步驟選取6個(gè)稀釋度（如10-710-2）的土壤懸液，每一稀釋度的懸液

40、接種4支試管（即4次重復(fù)），每管接種1mL。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下培養(yǎng)14天后，吸取培養(yǎng)液5滴于自瓷板孔中，加入1或2滴格利斯試劑，如有亞硝酸（NO2存在，則呈紅色，表示有亞硝酸細(xì)菌存在。記錄測(cè)試結(jié)果。按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和菌的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“MPN稀釋法”計(jì)算結(jié)果。如需對(duì)亞硝酸細(xì)菌進(jìn)一步分離與純化，可吸取1mL培養(yǎng)物加入新鮮的亞硝酸細(xì)菌培養(yǎng)液中再培養(yǎng)，必要時(shí)可反復(fù)兩次進(jìn)行富集培養(yǎng)。吸取濃縮10倍的該細(xì)菌培養(yǎng)液2mL,加人到經(jīng)紫外線(xiàn)消毒的硅膠板上，涂勻，置于40C溫箱中干燥至平板表面無(wú)積水，然后將經(jīng)富集培養(yǎng)的樣品進(jìn)行懸液接種培

41、養(yǎng)。14天后可觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，然后制成涂片，經(jīng)簡(jiǎn)單染色，在油鏡下可見(jiàn)橢圓形或近于球形的菌體形態(tài)。（二）硝酸細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定1培養(yǎng)基采用硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)五（八）”。將培養(yǎng)基在普通濾紙上過(guò)濾，裝入試管（1.8em*l8em），每管裝5mL，121C下滅菌30min。2.實(shí)驗(yàn)試劑格利斯試劑：同前。二苯胺試劑:將0.5S五色二苯胺（diphenylamine）溶于20mL蒸餾水及100mL濃硫酸中。操作步驟選取5個(gè)稀釋度（如10-610-2”）的土壤懸液，每一稀釋度的懸液接種4支試管（即4次重復(fù)），每管接種1mL。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下

42、培養(yǎng)14天后，測(cè)定硝酸根的產(chǎn)生。吸取培養(yǎng)液5滴于白瓷板孔中，先加入1或2滴格利斯試劑，如不呈紅色，則表示亞硝酸已經(jīng)完全消失。此時(shí)，另吸取培養(yǎng)液5滴于白瓷板孔中+加入1或2漓二苯胺試劑，如呈藍(lán)色，則表示亞硝酸已氧化為硝酸（NO-）,說(shuō)明有硝酸細(xì)菌的存在。記錄測(cè)試結(jié)果。按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和菌的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“MPN稀釋法”計(jì)算結(jié)果。如需對(duì)硝化細(xì)菌進(jìn)一步分離與純化，可吸取1mL培養(yǎng)物加入新鮮的硝酸細(xì)菌培養(yǎng)液著中再培養(yǎng)，必要時(shí)可反復(fù)兩次進(jìn)行富集培養(yǎng)。吸取濃縮10倍的硝化細(xì)菌培養(yǎng)液2mL,加入到經(jīng)紫外線(xiàn)消毒的硅膠板上，涂勻，置于40C溫箱中干燥至平板表面無(wú)積水，然后將經(jīng)

43、富集培養(yǎng)的樣品進(jìn)行懸液接種培養(yǎng)。14天后可觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況。三、反硝化細(xì)菌的測(cè)定土壤中由于硝化作用所積累的硝酸，在厭氧條件下以no3或者no2代替O2作為最終電子受體，被反硝化細(xì)菌還原為亞硝酸、氨甚至氮?dú)獾龋Q(chēng)為廣義的反硝化作用。參與這一作用的細(xì)菌稱(chēng)為反硝化細(xì)菌（denitrifyingbacteria），也稱(chēng)為硝酸還原細(xì)菌。土壤中反硝化細(xì)菌多為兼性細(xì)菌，測(cè)定其數(shù)量一般采用稀釋平板法。（一）培養(yǎng)基采用反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)五（九）”。每支試管（1.8cm*18cm）中裝入10mL培養(yǎng)基（深層培養(yǎng)，以造成厭氧條件），在培養(yǎng)基中倒放人一小玻璃管（杜氏發(fā)酵管），121C下滅

44、菌30min。（二）實(shí)驗(yàn)試劑1）奈氏試劑：同前。2）格利斯試劑：同前。3）二苯胺試劑：同前。（三）操作步驟選取5個(gè)稀釋度（如10-710-3）的土壤懸液，每一稀釋度的懸液接種4支試管（即4次重復(fù)），每管接種1mL。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下培養(yǎng)14天后，檢查是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。如有細(xì)菌生長(zhǎng)，一般培養(yǎng)液變濁，甚至有時(shí)有氣泡出現(xiàn)，吸取1或2滴培養(yǎng)液于白瓷板孔中，如加入1或2滴奈氏試劑后出現(xiàn)棕紅色或淺褐色沉淀，即表示培養(yǎng)基內(nèi)有氨產(chǎn)生，同時(shí)用格利斯試劑和二苯胺分別檢查是否有亞硝酸和硝酸的存在。從測(cè)定記錄結(jié)果，按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和茵的近似值，參見(jiàn)本章

45、第一節(jié)“稀釋平板法”計(jì)算結(jié)果。如需對(duì)反硝化細(xì)菌進(jìn)一步分離與純化，可吸取1mL培養(yǎng)物加入新鮮的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中再培養(yǎng)，必要時(shí)可反復(fù)兩次進(jìn)行富集培養(yǎng)。吸取濃縮10倍的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液2mL,加入到經(jīng)紫外線(xiàn)消毒的硅膠板上，涂勻，置于40C溫箱中干燥至平板表面無(wú)積水，然后將經(jīng)富集培養(yǎng)的樣品進(jìn)行懸液接種培養(yǎng)。14天后可觀(guān)察茵落的生長(zhǎng)情況，并純化單菌落。如需鏡檢，可取無(wú)菌吸管1支，先用手指壓緊管口，放人培養(yǎng)瓶底部，再松手，此時(shí)培養(yǎng)液會(huì)自動(dòng)吸人，取出后涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，一般用酒石酸鉀鈉作為碳源的多為革蘭氏陰性的細(xì)桿菌。四、好氧性自生固氮細(xì)菌的測(cè)定土壤中的自生固氮微生物，包括好氧性自生固氮菌和厭氧性

46、自生固氮菌、固氮藻類(lèi)以及一些固定少量氮素的放線(xiàn)苗和真菌等，其中以好氧性自生固氮菌和厭氧性自生固氮菌的固氮能力較大，大氣中的氮素占空氣的70，但植物不能直接利用。固氮微生物卻具有固定大氣中氮素的能力，使氣態(tài)氮素轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟衫玫男螒B(tài)，這對(duì)土壤氮索積累及植物氮素營(yíng)養(yǎng)有重要意義。因此了解它們?cè)谕寥乐械臄?shù)量以及活動(dòng)強(qiáng)度，對(duì)研究土壤氮素循環(huán)有十分重要的作用。（一）平板培養(yǎng)法1培養(yǎng)基采用瓦克斯曼77號(hào)培養(yǎng)基，或阿須貝無(wú)氮瓊脂培養(yǎng)基，其具體配方參第四章第三節(jié)五”2操作步驟用上述培養(yǎng)基制成平板，每個(gè)土樣準(zhǔn)備培養(yǎng)皿9套。將稀釋度（如10-310-1）的土壤懸液0.05mL,分別滴加到瓊脂培養(yǎng)基的表面，用玻璃刮刀

47、刮勻后，于28C恒溫箱中培養(yǎng)7天后，參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”計(jì)算結(jié)果。在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的自生固氮苗的菌落特征是：微微突起，表面光滑或具有皺紋，呈黏液狀，有時(shí)還呈褐色，不透明，不染成紅色，埋藏菌落呈三角形或菱形。鏡檢細(xì)胞肥大，常呈“8”字形，且具莢膜。必須與微嗜氮的微生物加以識(shí)別，并最好用化學(xué)方法測(cè)定其固氮量。(二)稀釋法1.培養(yǎng)基采用阿須貝氏培養(yǎng)基，但不加瓊脂，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)五.(一)。將5mL培養(yǎng)基分裝于(1.8craX18cra)試管中，管中貼于內(nèi)壁放一濾紙條，一半浸入培養(yǎng)基內(nèi)，一半露于空氣中，121C下滅菌30min.2.操作步驟選取4個(gè)稀釋度(如10-410-1)的土

48、壤懸液，每一稀釋度的懸液接種4支試管(即4次重復(fù))，每管接種1mL。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下培養(yǎng)7天后，如濾紙上出現(xiàn)褐色菌落，則表示有自生固氮菌的生長(zhǎng)。按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和菌的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”計(jì)算結(jié)果。如需對(duì)好氧性自生固氮菌進(jìn)一步分離與純化，可吸取1mL培養(yǎng)物加入新鮮的固氮菌培養(yǎng)液中再培養(yǎng)，必要時(shí)可反復(fù)兩次進(jìn)行富集培養(yǎng)。吸取該培養(yǎng)液0.05ml,加入到平板上，涂勻，置于28C溫箱中培養(yǎng)7天后觀(guān)察菌落的生長(zhǎng)情況，并純化單菌落。十一、纖維分解菌的測(cè)定纖維素(cellulose)是組成植物組織的主要成分，約占植物組織的的

49、。土壤中植物殘?bào)w的分解主要是由微生物來(lái)進(jìn)行的，是土壤碳素循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者。纖維素分解菌有好氧與厭氧之分，土壤中纖維素的分解作用主要是由好氧性分解菌進(jìn)行的，如噬纖維素菌屬(Cytophaga)，具有很強(qiáng)的纖維素分解能力。除細(xì)菌外，真菌與放線(xiàn)菌的某些類(lèi)群也具有分解纖維素的能力。在厭氧條件下，分解纖維素的微生物是由一些產(chǎn)抱子桿菌，如奧氏纖維素芽抱桿菌(Bacillusomelianskii)和相類(lèi)似的少數(shù)種進(jìn)行的。它們不但枉大氣碳素循環(huán)中有重要作用，而且其分布與土壤性狀、土壤肥力有著密切的關(guān)系。因此，測(cè)定土壤中纖維素分解菌的數(shù)量是十分必要的。（一）好氧性纖維素分解菌1、平板法1）培養(yǎng)基米用赫奇遜培養(yǎng)

50、基，集體培養(yǎng)參見(jiàn)“第四章第二節(jié)五（五）。（2）操作步驟分別接種0.05mL稀釋度為10-310-1的土壤懸液于冷凝的平板培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀使其均勻涂抹于培養(yǎng)基的表面。然后用滅菌的鑷子夾取滅過(guò)菌的直徑與培養(yǎng)皿等大的濾紙,覆蓋于培養(yǎng)基上,再用干凈滅菌的玻璃刮刀壓平,置于盛有水的干燥器中,28條件下保濕培養(yǎng)14天后取出，計(jì)算黏液菌、弧菌、真菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量。參見(jiàn)本章第一節(jié)“稀釋平板法”計(jì)算結(jié)果。如需對(duì)好氧性纖維素分解菌進(jìn)一步分離與純化，可米用劃線(xiàn)法純化單菌落。2稀釋法（1）培養(yǎng)基采用赫奇遜培養(yǎng)基，不加瓊脂，其具體配參見(jiàn)“第四章第三節(jié)五（五），。將5mL培養(yǎng)基分裝于試管（1.80nXl8em）中，管

51、中貼于內(nèi)壁放一濾紙條，半浸入培養(yǎng)）R內(nèi)，一半露于空氣中，121C下滅菌30min。濾紙條是以普通的濾紙剪成5cmXO.7em的紙條。如呈酸性反應(yīng)，先以堿性溶液（在自來(lái)水中加入1或2滴濃堿液即可），浸泡45h，取出用自來(lái)水沖洗,烘于使用。（2）操作步驟用5個(gè)稀釋度（10-510-1）的土壤懸液接種，每管接土壤懸液LOmL，每個(gè)稀釋度的懸液重復(fù)4管。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液麗接種無(wú)菌水作對(duì)照。在接人土壤稀釋液時(shí)，需經(jīng)過(guò)露于液面的濾紙條流人培養(yǎng)基中。于280條件下培養(yǎng)14天，檢查各試管中濾紙條上細(xì)菌苗落的出現(xiàn)及濾紙變薄、斷裂、色素產(chǎn)生情況。從測(cè)定記錄結(jié)果，按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)

52、和茵的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“MPN稀釋法”計(jì)算結(jié)果，（二）厭氧性纖維素分解菌（1）培養(yǎng)基采用厭氧性纖維索分解菌培養(yǎng)基，其具體配方參見(jiàn)“第四章第三節(jié)五*（六）”。將上述培養(yǎng)基1015mL裝于試管中，并插入lcmXlOcm濾紙條一片或加入切成2mmX2mm大小濾紙片005g，121C下滅菌30min。（2）操作步驟用5個(gè)稀釋度（1010）的土壤懸液接種，每管接土壤懸液1.OmL,每個(gè)稀釋度重復(fù)4管。另取4支培養(yǎng)基不接種懸液而接種無(wú)菌水作對(duì)照。于28C條件下培養(yǎng)14天后（加濾紙小片者放一個(gè)月），取出檢查濾紙上的溶解區(qū)以及菌落或色斑情況，以判別有無(wú)厭氧分解菌。加濾紙片者培養(yǎng)一個(gè)月后取出振蕩觀(guān)察紙屑腐

53、爛情況。從測(cè)定記錄結(jié)果，按附錄中稀釋法四次重復(fù)測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表得出數(shù)量指標(biāo)和菌的近似值，參見(jiàn)本章第一節(jié)“MPN稀釋法”計(jì)算結(jié)果。如需繼續(xù)分離純化，可用纖維素瓊脂培養(yǎng)基，稀釋平板法接種，經(jīng)厭氧培養(yǎng)，可得到厭氧性纖維分解菌的純培養(yǎng)物。十二、光合細(xì)菌的測(cè)定光合細(xì)菌是一大類(lèi)具有光合色素，能在厭氧、光照條件下進(jìn)行光合作用的原核生物的總稱(chēng)，一般生長(zhǎng)在湖底土、河流底土、海底土和水稻土等生境中。光合細(xì)菌由四個(gè)科組成：著色菌科（紅硫菌科，又稱(chēng)紅色或紫色硫細(xì)菌）；綠菌科（又稱(chēng)綠硫細(xì)菌）；紅螺菌科（又稱(chēng)紅色或紫色非硫細(xì)菌）；綠色屈撓菌科（又稱(chēng)滑行絲狀綠色硫細(xì)菌）。前兩個(gè)科的光合細(xì)菌均為厭氧光臺(tái)細(xì)菌，但著色菌科細(xì)菌的硫磺顆

54、粒在細(xì)胞內(nèi)，而綠菌科細(xì)菌的硫磺顆粒卻在胞外，兩者都能以C02作為唯一或主要的碳源，以H2S作為光合反應(yīng)的供氫體，能源來(lái)自日光，屬光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型，后兩科的光合細(xì)菌都能利用各種有機(jī)碳化合物為碳源和光合反應(yīng)的供氫體，能源來(lái)自日光，屬光能有機(jī)異養(yǎng)型。其中，紅螺菌科細(xì)苗在有機(jī)污水治理、光合細(xì)菌飼料蛋白、天然色素以及光合細(xì)菌產(chǎn)氫等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，本節(jié)將介紹土壤中光合細(xì)菌的分離、純化常見(jiàn)方法。（一）培養(yǎng)基（表73）7-3光合細(xì)菌培養(yǎng)基（二）操作步驟稱(chēng)取60g適于光合細(xì)菌生長(zhǎng)的土壤，滅菌后裝入玻璃量筒內(nèi)，再加入采集的樣品水。根據(jù)欲分離的不同光合細(xì)菌選用上述相同的培養(yǎng)基100200mL，并與土壤攪

55、拌均勻，然后加流體石蠟（由液體石蠟和固體石蠟以1：1比例加熱混合而成）隔絕空氣，造成厭氧環(huán)境。在2535C溫度下，用5000100001x的光照強(qiáng)度進(jìn)行光照培養(yǎng)28周。這時(shí)，光合細(xì)菌在玻璃壁上呈菌落狀，布滿(mǎn)整個(gè)筒壁，呈紅色或綠色。然后，用吸管在細(xì)菌生長(zhǎng)良好的泥土層吸取泥水樣和細(xì)菌，移植至約50mL的試劑瓶中，再加入上述培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。用試劑瓶培養(yǎng)時(shí)，先裝入泥狀溶液，再把各種培養(yǎng)液裝滿(mǎn)瓶子，然后塞緊塞于，防止培養(yǎng)液溢出，保持厭氧條件。試驗(yàn)瓶的橡皮塞用膠布封好，以防止長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)液蒸發(fā)。在這個(gè)試劑瓶中不斷進(jìn)行富集培養(yǎng)，并將生長(zhǎng)良好的光合細(xì)菌懸浮液適當(dāng)稀釋?zhuān)趨捬鯒l件下繼續(xù)進(jìn)行光照培養(yǎng)。用堿性沒(méi)食子

56、酸法進(jìn)行厭氧平板培養(yǎng)，在g00050001x光照條件下進(jìn)行。把干燥器內(nèi)的空氣用真空泵減壓到3，再通人無(wú)菌的氫氣，進(jìn)行氣體置換造成厭氧條件，然后用堿性沒(méi)食子酸把殘余的氧氣除去把懸液和瓊脂培養(yǎng)基混勻后裝入已滅菌的細(xì)玻璃管中凝固，把玻璃管口兩端用橡皮塞塞緊后進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，在無(wú)菌條件下推出凝固瓊脂，或打碎玻璃管。將以上分離到的不同形態(tài)的菌株進(jìn)行反復(fù)分離純化，直到在顯微鏡下觀(guān)察菌體形態(tài)基本一致，純化工作才結(jié)束。菌株供鑒定用。十三、甲烷產(chǎn)生菌的測(cè)定大氣甲烷是引起全球氣候變暖的主要因素之一。大氣中的甲烷/L乎有一半來(lái)自于富含有機(jī)物的缺氧、多水的水田土壤、沼澤、濕地、水底淤泥等厭氧生境的生物過(guò)程。

57、這些甲烷在厭氧生境中由產(chǎn)甲烷細(xì)菌（methanebacteria）形成以后，經(jīng)土壤和水層逸散人大氣。因此，甲烷產(chǎn)生菌對(duì)自然界碳素循環(huán)起著重要作用。（一）培養(yǎng)基（表74）（二）操作步驟將熔化好裝有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)管，放置排列于水溫在4550C的水浴鍋中，每一富集培養(yǎng)處理，排列7或8支，每列前放一支同樣組分，僅缺少瓊脂的液體培養(yǎng)基，每處理重復(fù)1次。每支培養(yǎng)管5mL培養(yǎng)液中，用lmL注射器分別加入1%硫化鈉和5%碳酸氫鈉混合試劑、青霉素液各o.1mL。把相應(yīng)基質(zhì)的富集培養(yǎng)物在旋渦混合器上將富集絮狀物打散。用lmL滅菌注射器以氮?dú)饬飨慈パ鹾?，吸?.1mL富集培養(yǎng)物，迅速注入加有同一基質(zhì)的液體培養(yǎng)基中

58、，此管立即在旋渦混合g9上混勻，然后依次同法稀釋?zhuān)看蜗♂尯缶鶆蚧旌?。稀釋程度視富集培養(yǎng)物中產(chǎn)生甲烷細(xì)菌的數(shù)量而定，以最后2或3個(gè)稀釋度的培養(yǎng)管中出現(xiàn)10個(gè)以下單菌落為宜。在滾管機(jī)水槽中加入冰塊和冷水，使?jié)L管過(guò)程中水溫保持較低溫度，以便培養(yǎng)管中瓊脂培養(yǎng)基迅速凝固。啟動(dòng)滾管機(jī)，把巳接入的富集培養(yǎng)物瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)管平穩(wěn)放在滾軸與支托點(diǎn)之間，任意均勻轉(zhuǎn)動(dòng)。待瓊脂培養(yǎng)基在培養(yǎng)管內(nèi)壁凝固成為均勻透明的瓊脂薄膜為止。如無(wú)滾管機(jī)也可在一瓷盤(pán)中加水、冰塊和少量氯化鈉以降低溫度，用手滾動(dòng)進(jìn)行。30C培養(yǎng)培養(yǎng)10天后，以厭氧操作技術(shù)挑取滾管菌落，培養(yǎng)后再進(jìn)行厭氧滾管分離，多次反復(fù)直至純培養(yǎng)物。得到多株純培養(yǎng)物，

59、采用氣相色譜儀檢測(cè)是否能利用甲烷，并進(jìn)行熒光顯微鏡檢。十四、有機(jī)污染物降解菌的測(cè)定土壤中存在大量的微生物資源，它們是土壤環(huán)境的凈化器，對(duì)土壤環(huán)境修復(fù)發(fā)揮著不可替代的作用。因此，土壤中降解菌資源的篩選與分離成為土壤環(huán)境微生物修復(fù)研究中的重要工作。因此，本節(jié)以有機(jī)污染物（農(nóng)藥、酚、石油、多環(huán)芳烴及有機(jī)氯化合物等）為例，介紹土壤中商效降解菌的篩選、分離及純化常規(guī)方法。（一）培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽含有機(jī)污染物培養(yǎng)基（表75）（二）操作步驟稱(chēng)取2s有機(jī)污染土壤（也可從非污染土壤中篩選），接種于新鮮的100mL液體無(wú)機(jī)鹽含相應(yīng)有機(jī)污染物的培養(yǎng)基中，在30C，150r/rain搖床振藹培養(yǎng)35天后，吸取lmL轉(zhuǎn)接至新

60、鮮的上述培養(yǎng)基（必要時(shí)，有機(jī)污染物濃度也可逐一增加），連續(xù)富集，每周轉(zhuǎn)接1次，多次轉(zhuǎn)接后，用稀釋平板分離法在富集培養(yǎng)基上分離，反復(fù)劃線(xiàn)分離得到菌株。所得菌株重新轉(zhuǎn)接至含有機(jī)污染物的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，以驗(yàn)證菌株的降解能力。觀(guān)察記錄菌種的生長(zhǎng)狀況、菌落特征、鏡檢菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，以及生理生化和生態(tài)特征，革蘭氏染色、芽孢染色及鞭毛染色以及菌種鑒定。十五、重金屬抗性菌的測(cè)定土壤微生物可以積累和轉(zhuǎn)化環(huán)境中的重金屑，其中，生物積累機(jī)理主要表現(xiàn)在胞外絡(luò)合作用、胞外沉淀作用以及胞內(nèi)積累三種作用方式。由于微生物對(duì)重金屬具有很強(qiáng)的親和吸附性能，有毒金屬離子可以沉積在細(xì)胞的不同部位或結(jié)合到胞外纂質(zhì)上，或被輕度整合在