山大《醫(yī)學基礎化學》雙語課件11Spectrophotometry

1、Chapter Eleven Spectrophotometry Spectrophotometry, is one of the most widely used methods of analysis. It is used to measure the absorption capabilities of certain compounds with reference to wavelengths of light on the ultraviolet and visible light ranges. e.g. There is 10-8g Fe in 10ml solution,

2、if titrate it using KMnO4 standard solution (c=2.010-4 mol/L), only consumed 0.02ml KMnO4 standard solution The instrumentation is readily available and generally fairly easy to operate. It is very widely used in clinical chemistry, hygiene analysis, medicine analysisHigh sensitive, can used microan

3、alysis 1-10g/L ( 10-6 g/L )Spectrophotometry 11-1 Properties of Light11-2 Absorption of Light11-3 The Spectrophotometer11-4 Typical Analysis Procedures 11.5 分光光度分析法的誤差和測量條件的選擇 In spectrometric methods, the sample solution absorbs electromagnetic radiation from an appropriate source, and the amount a

4、bsorbed is related to the concentration and path length(cm) of the analyte in the solution. 11-2 Absorption of Light Beers law The amount of monochromatic radiation(單色光) absorbed by a sample is described by the Beer Lambert law, commonly called Beers law. Beer in 1729 and Lambert in 1760 recognized

5、that when electromagnetic energy is absorbed, the power of the transmitted energy decreases geometrically (exponentially指數(shù)). P0 ： power of incident radiation P ：power of transmitted radiation, T ：TransmittanceC： concentration(g/L)b ：path length(cm). c%T = 100 T P0PcbTransmittance透光度Prmore useful qua

6、ntity is the absorbance A : 當P0一定時，吸光度（A）與液層厚度（b）和 溶液濃度C有關： Po、c一定： Ab Po、b一定： Ac A = abc a is absorptivity (L/g.cm ) 吸光物質的性質、 入射光波長 及溫度等因素有關。Beers law A: the absorbance is a dimensionless（無量綱） ratio. c: the concentration of the sample is usually given in units of mole/L . b: the pathlength is commo

7、nly expressed in centimeters. :is the molar absorptivity, the unit that tells how much light is absorbed for a given wavelength has units of( Lmol-1cm-1) If A = 0, then no photons are absorbed. If A = 1.00, then 90% of the photons are absorbed; only 10% reach the detector. If A = 2.00, then 99% of t

8、he photons are absorbed; only 1% reach the detector透光率和吸光度光吸收曲線 最大吸收波長max選擇 用不同波長的單色光照射某一吸光物質測定其吸光度，以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制曲線。描述物質對不同波長光的吸收能力。例如：鄰二氮菲合鐵(II)配離子的反應：圖：不同濃度 鄰二氮菲合鐵(II)配離子的吸收光譜 max=510nm吸收曲線吸收曲線（3）吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據(jù)之一。吸收曲線的討論：（1）同一物質對不同波長的光吸收程度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長max 。 吸收曲線是定量分析中選

9、擇入射光波長的重要依據(jù)。（2）同種物質濃度不同，其吸收曲線形狀相似max不變。 在max處， A最大,并與濃度c 呈正比關系 ,測定最靈敏- 定量分析依據(jù)。（4）從吸收曲線形狀可以解釋物質的顏色。物質的顏色與吸收光顏色互為補色。光的互補：藍 黃注意：物質對光的吸收越多，呈顏色越深， 溶液濃度越濃。 11-3 The Spectrophotometer Major Components Light sourceWavelength SelectormonochromatorSamplecellLightdetectorindicatortungsten lampa gratingphototub

10、ecuvette scale 在紫外可見分光光度計中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源 1 光源 熱輻射光源 用于可見光區(qū)，如鎢燈 和鹵鎢燈； 氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈 和氘燈。單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準直鏡等部分。 2 單色器 單色器質量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質量。色散元件常用棱鏡和光柵。 吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。 3 吸收池 吸收池的種類很多，其光徑可在0.110cm之間，其中以1cm光徑吸收池最為常用。4 檢測器 檢測器的作用是檢測光信號，并將光信號轉變?yōu)殡娦盘枴，F(xiàn)今使用的分光光度計

11、大多采用光電管或光電倍增管作為檢測器。5 信號顯示系統(tǒng) 常用的信號顯示裝置有直讀檢流計，電位調節(jié)指零裝置，以及自動記錄和數(shù)字顯示裝置等。11-4 Typical Analytical Procedures First, measure the baseline using a blank sample. reagent blank containing all reagents, but with analyte replaced by distilled water. Second, measure the zero by inserting the beam block. This cor

12、rects the instrument for the detector background.1. Choice maximum absorbed wavelengh2. Determination of sample:1）Calibration curve method 2）Direct compare methodDetermination process of sample:Serum Iron Determination prepare a series of standards solution to establish a calibration curvethe unknow

13、ns be prepared using the same procedure as for standards solution 1) Calibration curve methodFigure 11- 5: Calibration curve showing for the (ferrozine)3Fe() complex . 2) Direct compare method（二）紫外吸收性質aa的一個重要光學性質是對光有吸收作用: 可見光區(qū)域均無光吸收 在遠紫外區(qū)（220nm）均有光吸收 在紫外區(qū)（近紫外區(qū)）（220nm300nm） 只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸三種AA有 光吸收能力，

14、(因為它們的R基含有苯環(huán)共 軛雙鍵)。 苯丙AA最大光吸收在259nm、 酪AA在278nm 色AA在279nm苯丙AA最大光吸收在259nm 257=2.0 x102 酪AA在278nm 275=1.4x103色AA在280nm 280=5.6x103蛋白質一般都含有這三種AA殘基，所以其最大光吸收在大約280nm波長處， 因此, 利用分光光度法依據(jù)是朗伯比爾定律 測定蛋 白質的含量。核酸的紫外吸收核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質，在260nm處核酸紫外吸收最強。核酸的紫外吸收是核酸定量測定的基礎。純DNA OD260/OD280=1.8純RNA OD260/OD280

15、=2.0天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123Example 1 A sample in a 1.0 cm cell is determined with a spectrometer to transmit 80% light at a certain wavelength. If the absorptivity of this substance at this wavelength is 2.0, what is the concentration of the substance(g/L).solution1T

16、he percent transmittance is 80%, and so T=0.80, a =2.0,b=1.0Example 2A solution containing 1.00mg iron (as the thiocyanate 硫氰酸鹽 complex) in 100mL was observed to transmit 70.0% of the incident light compared to an appropriate blank.(a) What is the absorbance of the solution at this wavelength?(b) Wh

17、at fraction of light would be transmitted by a solution of iron four times as concentrated?Solution 2(a): T=0.700(b): c=0.01g/L A=a b c 0.155=a b (0.0100g/L) a b=15.5L/gTherefore The absorbance of the new solution could have been calculated more directly: 顯色反應（color reaction） 顯色反應：待測物質是無色或很淺的顏色，需要選適

18、當?shù)脑噭┡c被測離子反應生成有色化合物再進行測定，此反應稱為顯色反應，所用的試劑稱為顯色劑（color reagent）。 按顯色反應的類型來分類，主要有氧化還原反應和絡合反應兩大類，而絡合反應是最主要的。顯色反應的選擇A 選擇性好，干擾少，或干擾容易消除;靈敏度高，有色物質的應大于104。B 有色化合物的組成恒定，符合一定的化學式。C 有色化合物的化學性質穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度基本恒定，不容易受外界環(huán)境條件的影響。D 有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，即顯色劑對光的吸收與絡合物的吸收有明顯區(qū)別，要求兩者的吸收峰波長之差(稱為對比度)大于60 nm。11.5 分光光度分析法的誤差和測量條件的選擇1 對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標準曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現(xiàn)象(吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引