中和試驗(yàn)檢測(cè)方法

1、實(shí)驗(yàn)六 血清中和試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解中和試驗(yàn)的基本原理和幾種不同的測(cè)定方法，掌握固定病毒稀釋血清法的操作步驟和計(jì)算方法及含義。二、原理 抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使后者喪失感染能力。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關(guān)系研究4、疫苗免疫原性的評(píng)價(jià)5、免疫血清的質(zhì)量評(píng)價(jià)6、測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中是否存在抗體四、材料 1、長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長(zhǎng)液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）6、待檢血清、陰性對(duì)照血清五、方法1、固定病毒稀釋血清法 將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般為100或200個(gè)TCID50、EID50或LD

2、50）混合感作一定時(shí)間以后，接種于敏感細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物，測(cè)定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物發(fā)生病毒感染的能力及其效價(jià)。 以能保護(hù)50%組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物不發(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中和效價(jià)（PD50）操作步驟：測(cè)定病毒液的TCID50將測(cè)好TCID50的病毒液稀釋成200個(gè)TCID50的病毒懸液。在96孔微量培養(yǎng)板中將血清（預(yù)先56滅活30min）作連續(xù)倍比稀釋（具體方法是在96孔板中先加入50l生長(zhǎng)液，再加50l待檢血清，混勻后，吸50l至下一孔，如此下去。一直到1:256），每個(gè)稀釋度作4孔。在上述各孔內(nèi)加入50l稀釋好的病毒液，混勻

3、后放入37 5%CO2培養(yǎng)箱中作用45min-60min。 同時(shí)設(shè)待檢血清毒性對(duì)照，陰、陽(yáng)性血清對(duì)照，病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照，其中病毒對(duì)照要作 200個(gè)TCID50、20個(gè)TCID50、2個(gè)TCID50、0.2個(gè)TCID50 4個(gè)不同濃度的對(duì)照。感作完成后每孔加入100l細(xì)胞懸液，放37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般要觀察5-7天。 結(jié)果計(jì)算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。血清稀 CPE 無(wú)CPE 累計(jì) 保護(hù)率%釋度 孔數(shù) 孔數(shù) CPE孔數(shù) 無(wú)CPE孔數(shù) 1:2（10-0.3） 0 4 0 15 100(15/15)1:4（10-0.6） 0 4 0 1

4、1 100(11/11) 1:8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5(7/8)1:16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7(4/6)1:32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7(1/6)1:64（10-1.8） 4 0 9 0 0(0/9)1:128（10-2.1） 4 0 13 0 0(0/13)距離比例=（高于50%的保護(hù)率-50% ）/ （高于50%的保護(hù)率低于50%的保護(hù)率） =（66.7-50）/（66.7-16.7） = 0.33lgPD50=高于50%的保護(hù)率血清稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例稀釋度對(duì)數(shù)的差=-1.2+0.33(-0.3)=-1.299 PD50=-1.

5、299的反對(duì)數(shù)=0.05=1/20 即1:20稀釋的待檢血清可保護(hù)50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE2、固定血清稀釋病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對(duì)照非免疫血清（對(duì)照組）和待檢血清同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每一組的TCID50、EID50或LD50，然后計(jì)算中和指數(shù)。操作步驟：將病毒作連續(xù)10倍稀釋將稀釋好的病毒接種96孔板，每個(gè)稀釋度接種一縱排共8孔，每孔50l，做兩塊板子。在其中一塊板子的每孔加入50l待檢血清（試驗(yàn)組），另一塊板子的每孔加入50l正常血清（對(duì)照組），混合后置37 5%CO2培養(yǎng)箱作用1h。然后在每孔中加入100l細(xì)胞懸液。設(shè)兩縱排正常細(xì)胞對(duì)照。置37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果。分別計(jì)算每組病毒的TCID50，然后計(jì)算血清的中和指數(shù)中和指數(shù)=試驗(yàn)組TCID50 /對(duì)照組T