03-水的細(xì)菌學(xué)檢查

1、水的細(xì)菌學(xué)檢查微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1學(xué)習(xí)水樣細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法。 2掌握水中大腸菌群的測(cè)定方法。 3了解大腸菌群的數(shù)量與生活飲用水的 重要性。 2生活用水的水源常被生活污水或工業(yè)廢水或人與動(dòng)物的糞便所污染，可能含有不同類型的微生物，有腐生性的和病原性的。腐生性微生物對(duì)人無害，而病原性微生物則能引起傳染病的發(fā)生。必須對(duì)生活用水及其水源進(jìn)行嚴(yán)格的細(xì)菌學(xué)檢查。 測(cè)定水樣是否合乎飲用標(biāo)準(zhǔn)，通常包括下列兩個(gè)項(xiàng)目： 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定 大腸菌群的測(cè)定 3細(xì)菌總數(shù)測(cè)定 水中細(xì)菌總數(shù)可說明被有機(jī)物污染的程度。細(xì)菌數(shù)越多，有機(jī)物質(zhì)含量越大。腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在營養(yǎng)豐富的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2、上進(jìn)行生長，出現(xiàn)肉眼可見的菌落。 細(xì)菌總數(shù)是指1 ml水樣在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37、24小時(shí)培養(yǎng)后，所生長的菌落數(shù)。 我國規(guī)定1 ml自來水中的總菌數(shù)不得超過100個(gè)。 二、實(shí)驗(yàn)原理4大腸菌群的測(cè)定 若水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染，然而腸道病原菌在水中容易死亡與變異，因此數(shù)量較少，要從中特別是自來水中分離出病原菌常較困難與費(fèi)時(shí)，這樣就要找到一個(gè)合適的指示菌，此指示菌要求是大量出現(xiàn)在糞便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是較易檢出的。 5若指示菌在水中不存在或數(shù)量很少，則大多數(shù)情況也保證沒有病原菌。最廣泛應(yīng)用的指示菌是大腸菌群(coliform group)。大腸菌群的定

3、義：一群好氧和兼性厭氧、革蘭氏陰性、無芽孢的桿狀細(xì)菌，并在乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)37 2448 h培養(yǎng)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。根據(jù)水中大腸菌群的數(shù)目來判斷水源是否被糞便所污染，并間接推測(cè)水源受腸道病原菌污染的可能性。 6我國規(guī)定每升自來水中大腸菌群不超過3個(gè)；若只經(jīng)過加氯消毒即供作生活飲用水的水源水，大腸菌群數(shù)平均每升不得超過1,000 個(gè)；經(jīng)過凈化處理及加氯消毒后供作生活飲用水的水源水，其大腸菌群數(shù)平均每升不得超過10,000 個(gè)7檢查大腸菌群的方法有多管發(fā)酵法與濾膜法兩種。多管發(fā)酵法使用歷史較久，又稱水的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，為我國大多數(shù)衛(wèi)生單位與水廠所采用；濾膜法是一種快速的替代方法，而且結(jié)果重復(fù)性好，又能測(cè)定大

4、體積的水樣，目前國內(nèi)已有很多大城市的水廠采用此法。 8多管發(fā)酵法測(cè)定水中大腸菌群的原理 多管發(fā)酵法包括：初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三部分。91初發(fā)酵試驗(yàn) 液體培養(yǎng)基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。 乳糖起選擇性碳源的作用，大腸菌群可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸（有機(jī)酸），產(chǎn)氣（CO2+H2）。 溴甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫藍(lán)色；酸性條件：黃色，變色點(diǎn)pH=6.7）。將水樣接種在具倒置杜漢氏小管的發(fā)酵管內(nèi)，于37下培養(yǎng)，24h后杜漢氏小管的頂端出現(xiàn)氣泡，表明有氣體產(chǎn)生，培養(yǎng)基混濁，顏色變黃，說明水中存在大腸菌群，視為陽性結(jié)果。10如有下列情況的出現(xiàn)，其結(jié)果判斷需謹(jǐn)慎（1）個(gè)別其他類型的細(xì)菌在上述條件下也

5、可能產(chǎn)氣，需進(jìn)行下述試驗(yàn)（即平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)）才能進(jìn)一步確證。 （2）培養(yǎng)24h后產(chǎn)酸，但未見產(chǎn)氣者，不能立即判斷為陰性結(jié)果，由于菌量少，也可能延遲至48h后才產(chǎn)氣，應(yīng)視為可疑結(jié)果，也需進(jìn)行下述試驗(yàn)（即平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)）進(jìn)一步確證，48h后仍不產(chǎn)氣，可判斷為陰性結(jié)果。 112平板分離 平板分離用培養(yǎng)基通常為：伊紅美藍(lán)瓊脂（eosin methylene blue agar， EMB agar），復(fù)紅亞硫酸鈉瓊脂（亦稱遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基Endos medium）。12（1）伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中含有伊紅與美藍(lán)這兩種苯胺類染料，它們不但可以抑制G+菌和一些難培養(yǎng)的G-菌，而且在低酸度時(shí)，兩種染料結(jié)

6、合形成沉淀，起著產(chǎn)酸指示劑的作用。大腸菌群因其強(qiáng)烈發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量的混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染料，伊紅與美藍(lán)結(jié)合，菌體被著上深紫色，在含有兩種染料呈紫色的培養(yǎng)基上，形成帶核心、具金屬光澤的菌落。 13深紫黑色、有金屬光澤。紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。淡紫紅色、中心顏色較深。在伊紅美藍(lán)這種鑒別性培養(yǎng)基上，大腸菌群呈現(xiàn)特征性菌落，因此，凡是出現(xiàn)這種菌落可確認(rèn)為是大腸菌群。14（2）復(fù)紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基中含有堿性復(fù)紅染料，大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)生的有機(jī)酸和乙醛與復(fù)紅反應(yīng)形成深紅色復(fù)合物，菌落呈現(xiàn)帶金屬光澤的深紅色。培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉可使復(fù)紅脫色，培養(yǎng)基為淡粉紅色，同時(shí)還可抑制其他雜菌生長

7、。在這種鑒別性培養(yǎng)基上，大腸菌群也呈現(xiàn)特征性菌落。1524h和48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的初發(fā)酵菌落均需在上述培養(yǎng)基中的一種，進(jìn)行平板劃線，分離出陽性菌落。 3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 陽性菌落經(jīng)涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經(jīng)過乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，可確認(rèn)為大腸菌群陽性結(jié)果。16三實(shí)驗(yàn)用品 培養(yǎng)基： 乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基 3倍濃縮乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基 伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（制成平板） 17四、實(shí)驗(yàn)操作 （一）細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 1. 水樣采集自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3 min滅菌，再擰開水龍頭流水5 min，以排除管道內(nèi)積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測(cè)。池水、

8、河水或湖水將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面1015 cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進(jìn)行檢測(cè)，或臨時(shí)存于冰箱，但不能超過24 h。18 2.細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定 (1)自來水 (2)池塘水、河水或湖水 水樣稀釋 吸取稀釋后水樣加入平板 向平皿內(nèi)傾注培養(yǎng)基(1520 mL) 37溫箱，倒置培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù) 193.菌落計(jì)數(shù)方法 （1）計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù) 。（2）選擇平均菌落數(shù)在30300之間稀釋度的平板。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，作為該水樣的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。 20 （3）若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落

9、數(shù)均在30300之間，則按兩個(gè)稀釋度菌落總數(shù)的比值來決定取數(shù)。如比值小于2，應(yīng)取兩者的平均數(shù)；如比值大于2，則取其中較小的菌落總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行。 21（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行報(bào)告。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行報(bào)告。 22四、實(shí)驗(yàn)操作 （二）多管發(fā)酵法測(cè)定水中的大腸菌群 1. 水樣采集 2. 自來水檢查 （1）初（步）發(fā)酵試驗(yàn) （2）平板分離 （3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 2324100ml

10、水量的陽性管數(shù)10ml水量的陽性管數(shù)Ol2每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)每升水樣中大腸菌群數(shù)023025四、實(shí)驗(yàn)操作 （二）多管發(fā)酵法測(cè)定水中的大腸菌群 1. 取池塘水、河水或湖水等的檢查 （1）將水樣稀釋成10-1 與10-2 。（2）吸取稀釋后水樣 。26（2）分別吸取1mL l0-2、10-1的稀釋水樣和1mL原水樣，各注入裝有10mL普通濃度乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10mL和100mL原水樣，分別注入裝有5mL和50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵液的試管（瓶）中。（3）平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。 27五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 池水、河水或湖水陽性結(jié)果記“+”；陰性結(jié)果記“-”。 查表2-14得每升水樣中