常見生物相容性實(shí)驗(yàn)匯總

1、常見生物相容性實(shí)驗(yàn)匯總細(xì)胞復(fù)蘇材料準(zhǔn)備：培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml離心管實(shí)驗(yàn)步驟：先將培養(yǎng)基配好并復(fù)溫，在15ml離心管中加入5ml培養(yǎng)基；準(zhǔn)備37C的水浴，取出凍存管后立即置于水浴中融化，確保細(xì)胞全部浸入液面，快速搖動(dòng)，1min內(nèi)使管內(nèi)的細(xì)胞融化，注意不要讓水沒過管口，液氮會(huì)從口子噴出，小心。把培養(yǎng)基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜內(nèi)操作。小心打開凍存管，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到有培養(yǎng)基的15ml離心管中。1200rpm離心3min,棄上清，加入6ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶（小瓶6ml培養(yǎng)基，大瓶10ml培養(yǎng)基）中，做好標(biāo)記（

2、細(xì)胞類型、傳代數(shù)、培養(yǎng)基、復(fù)蘇時(shí)間、復(fù)蘇人），置于CO2培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后視情況換液。復(fù)蘇后細(xì)胞生長狀況正常后，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，最好在第二次傳代后凍存若干管細(xì)胞，不可只取不存，在第三次傳代后可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。TIPS：解凍細(xì)胞必須迅速，防止細(xì)胞低溫?fù)p傷，慢凍速融。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。細(xì)胞傳代（TE消化法）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備事項(xiàng)：預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（可以省去）。用75%酒精擦拭雙手，生物安全柜經(jīng)過紫外線照射超過30min,實(shí)驗(yàn)前通風(fēng)至少開啟15分鐘讓空氣循環(huán)起來，櫥內(nèi)不要使用火焰燈

3、，它們會(huì)影響櫥內(nèi)空氣的流動(dòng)方式。實(shí)驗(yàn)前把可能用到的試劑、吸管及離心管等全部拿到廚內(nèi)，并正確擺放使用的器械，保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。材料準(zhǔn)備：TE消化液、FBS、對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、培養(yǎng)皿等實(shí)驗(yàn)步驟：觀察細(xì)胞生長狀況后，取出實(shí)驗(yàn)所需物品，可在50ml離心管中配制40ml培養(yǎng)基（4mlFBS+36mla-MEM）待用。用一次性吸管從細(xì)胞單層吸出培養(yǎng)基，緩慢加入PBS或者不含血清的培養(yǎng)基沒過細(xì)胞，搖晃洗滌培養(yǎng)皿12次。再吸出PBS或培養(yǎng)基，吸的越干凈越好，6cm（10cm）培養(yǎng)皿中加入600山（800卩l(xiāng)）TE（胰蛋白酶），以剛

4、剛沒過細(xì)胞為宜。（視細(xì)胞種類也可不洗滌直接加入TE消化液）稍加搖勻，使TE消化液均勻覆蓋皿內(nèi)所有細(xì)胞，置37C條件下溫育13分鐘。消化程度以用肉眼觀察當(dāng)培養(yǎng)皿晃動(dòng)時(shí)飄起單層細(xì)胞為準(zhǔn)，可在顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度，視細(xì)胞不同而調(diào)節(jié)。消化適度后，加入適量培養(yǎng)基23ml于培養(yǎng)皿中終止消化，沿四個(gè)方向吹洗培養(yǎng)皿，確保細(xì)胞均從板上消化下來，最后全部轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。用吸管將已經(jīng)消化的細(xì)胞輕輕吹打成細(xì)胞懸液。精確配平后放入臺(tái)式離心機(jī)內(nèi)1200rpm離心3分鐘。棄上清液，加入適量PBS,重懸后1200rpm離心3分鐘。棄上清液，先加入23ml含10%

5、血清的培養(yǎng)基于15ml離心管中，將適量細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，做好標(biāo)記（細(xì)胞類型、傳代數(shù)PxNy、培養(yǎng)基D-L-5、傳代時(shí)間、傳代比例1:5；操作人），置于CO2培養(yǎng)箱中37C培養(yǎng)，清理操作臺(tái)，處理垃圾，記錄筆記。TIPS：消化適度：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散，細(xì)胞從平板上脫落可以用槍頭吹打?qū)崿F(xiàn)，但必須觀察到細(xì)胞間已經(jīng)分離。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)

6、胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37C時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)，針對(duì)不同細(xì)胞，建議初次消化時(shí)均在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)以確定消化程度。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，女如D-Hanks液。EDTA可以螯合2價(jià)金屬離子，故常用TE溶液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)基或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用，利用培養(yǎng)基稀釋也可以達(dá)到一定效果。每次傳代可以按1:31:10等比例進(jìn)行，以ATCC數(shù)據(jù)建議和實(shí)際生長狀況考慮，請(qǐng)協(xié)商好細(xì)胞需要立

7、即使用還是長期培養(yǎng)，合理保持培養(yǎng)箱中不同細(xì)胞的平板數(shù)量。用一次性吸管吹勻細(xì)胞時(shí)，切勿產(chǎn)生大量氣泡，在氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的剪接力對(duì)活細(xì)胞有致命威脅。建議吸管在吸取液體前盡量排空氣體，緩慢松手以吸取更多液體，繼而以合適的力度吹勻細(xì)胞。細(xì)胞凍存材料準(zhǔn)備：TE消化液、FBS、對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基、50ml離心管若干、15ml離心管若干、一次性吸管若干、專用凍存塑料管（1ml）等實(shí)驗(yàn)步驟：1、將細(xì)胞凍存液（10%DMSO+90%FBS）配好并放置冰箱預(yù)冷；2、當(dāng)10cm培養(yǎng)皿中的RBMSC細(xì)胞匯合到80%-90%時(shí)，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來，1200rpm離心，去上清；3、加入PBS重懸細(xì)胞，以洗去殘留的胰蛋白酶，1

8、200rpm離心，去上清；4、加入1ml細(xì)胞凍存液重懸后，將細(xì)胞重懸液放入凍存管中，凍存管必須將蓋子蓋緊，防止液氮侵入，并做好標(biāo)記（細(xì)胞類型、培養(yǎng)代數(shù)、培養(yǎng)基、凍存時(shí)間、凍存人、編號(hào)）。按下列順序梯度降溫：室溫-4C（1020min）f冰箱冷凍室-20C（0.51.5h）低溫冰箱-80C（過夜）液氮罐-196C（長期）（冰上轉(zhuǎn)移）。5、整理，做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄（細(xì)胞信息、具體凍存位置、管數(shù)等）。TIPS：欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80-90%致密度。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞

9、活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但最好為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能，為了防止局部DMSO濃度過高，請(qǐng)滴加培e.f.g.養(yǎng)基并且不時(shí)搖晃，當(dāng)然，最佳的是配制好凍存培養(yǎng)基，加入離心管中對(duì)細(xì)胞沉淀小心吹打制懸。梯度降溫轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)注意放置冰盒上

10、，避免敏感溫度變化。不宜將凍存細(xì)胞放置在0C-60C這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。專用凍存塑料管，帶有螺旋的平底塑料蓋，并且可以耐受低溫，注意凍存時(shí)擰緊。細(xì)胞計(jì)數(shù)材料準(zhǔn)備：細(xì)胞計(jì)數(shù)器、Eppendorf管等實(shí)驗(yàn)步驟：制備細(xì)胞懸液，可稀釋數(shù)倍以使每小格的細(xì)胞數(shù)可數(shù)。取潔凈的細(xì)胞計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。將懸液搖勻，用移液器吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多），讓懸液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度

11、的升高，可用吸水紙吸去溝槽中流出的多余懸液。靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)區(qū)是由4個(gè)16格小方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（A、B、C、D）的細(xì)胞數(shù)，數(shù)完計(jì)4個(gè)大方格讀數(shù)的平均數(shù)。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如細(xì)胞位于大方格的粗線上計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。測數(shù)完畢，取下蓋玻片，噴酒精將細(xì)胞計(jì)數(shù)

12、板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干、濾紙吸干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存細(xì)胞計(jì)數(shù)板-計(jì)數(shù)公式：計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=16小格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)x104x稀#倍數(shù)1mmAFBG細(xì)網(wǎng)格線.006mm粗網(wǎng)格線0P014mmffTRSD幼鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取準(zhǔn)備好已滅菌的手術(shù)器械和需要用到的離心管、培養(yǎng)皿等器材，于紫外照射30min滅菌。2.先將培養(yǎng)基配好，并在培養(yǎng)皿中加入PBS和10%FBSMedium。將出生7-8天的SD幼鼠處死，噴酒精后放入超凈臺(tái)的培養(yǎng)皿中。左手拿鑷子將SD幼鼠后腿腳掌夾起，右手持剪刀沿著SD幼鼠后腿將皮剪開，且將皮剪至股骨部分，要將皮剪開點(diǎn)，以免沾

13、到毛發(fā)。找到股骨與身體相連的關(guān)節(jié)處剪斷，取出后腿，并將腳掌與脛骨相連位置的皮剪掉，去除腳掌,余下部分放置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。重新取新一套鑷子與剪刀，用鑷子將腿夾起，在脛骨與股骨關(guān)節(jié)相連處用剪刀剪斷，得到分離的脛骨與股骨。左手用鑷子將脛骨節(jié)氣，右手持剪刀對(duì)骨頭進(jìn)行剔肉，盡量將骨頭上的肉剔干凈后，剪斷脛骨兩端的關(guān)節(jié)，使脛骨兩端相通后放入裝有10%FBSMedium的培養(yǎng)皿中，股骨處理與脛骨相同。用lml注射器插入到骨髓腔中，并不斷用medium進(jìn)行吹打，直至腔體發(fā)白為止，再用lml槍頭吹打培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，以免細(xì)胞成團(tuán)。用細(xì)胞濾網(wǎng)對(duì)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液進(jìn)行過濾，去除液體中的組織和肉末，將濾液放入l

14、0cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。第二天，去除上清液，PBS清洗兩次（要沿壁加PBS,以免將貼壁不牢固的細(xì)胞吹起），再加入10%FBSMedium培養(yǎng)。（由于剛提取的細(xì)胞中含有多種雜質(zhì)，剛提取的細(xì)胞經(jīng)過過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞上清液渾濁屬于正?，F(xiàn)象，在提取后的兩天內(nèi)，細(xì)胞要每天換液，且換液時(shí)候加PBS和10%FBSMedium時(shí)候必須緩慢沿壁加入，以免將細(xì)胞吹起。）2天換液一次，等到細(xì)胞長滿之后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳至第三代即可進(jìn)行凍存和做實(shí)驗(yàn)用。CCK-8實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎疾旌辖鸶男郧昂髮?duì)對(duì)細(xì)胞毒性的變化細(xì)胞：小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1,大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞RBMSC實(shí)驗(yàn)原理：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被

15、活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。保存條件：4C干燥避光保存，有效期一年（推薦）。-20C干燥避光保存，有效期二年。直接在材料上種細(xì)胞的CCK8實(shí)驗(yàn)方案準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯，將材料放置于燒杯中，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物,用75%的乙醇滅菌10min，將材料轉(zhuǎn)移至24孔板中，用PBS清洗兩次，盡量減少清洗時(shí)間，再用培養(yǎng)基清洗一遍，加入

16、800卩1培養(yǎng)基使材料浸沒在培養(yǎng)基中（若材料為鈦合金，可把75%滅菌后的材料放置于超凈臺(tái)，再用紫外照射一段時(shí)間后，將材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培養(yǎng)基進(jìn)行清洗。）取70%-80%對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清a-MEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，在材料上種細(xì)胞，密度為3*104/孔（可根據(jù)材料調(diào)整細(xì)胞密度），使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面（先加入800l培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。若有氣泡，戳破。再以轉(zhuǎn)圈的方式加入200l細(xì)胞重懸液至材料表面，輕微震蕩），5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。每個(gè)材料4個(gè)復(fù)孔（若材料為鈦合金

17、，則可將細(xì)胞懸液配成配制濃度為2X104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板，每孔500口L。48孔板，每孔300p!。）由于鎂合金與CCK8會(huì)產(chǎn)生假陽性結(jié)果，所以在檢測吸光度的時(shí)候，需要將細(xì)胞消化后再與CCK8進(jìn)行孵育：待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天（每天需更換新鮮培養(yǎng)基），棄培養(yǎng)基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，將材料轉(zhuǎn)移至別的空白孔中，每孔加入200卩1胰酶消化1-2min后，在顯微鏡下觀察control組的細(xì)胞是否消化下來，如沒有消化下來,用槍吹打至細(xì)胞完全消化后，每孔加入500卩110%胎牛血清a-MEM培養(yǎng)液終止消化，120

18、0rpm離心5min,棄上清，加入400卩l(xiāng)10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng),于酶標(biāo)儀450nm波長測定其吸光度（其他材料：待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)分別培養(yǎng)1,3,7天，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次（PBS需吸干），清洗后，將材料轉(zhuǎn)移至別的空白孔中，每孔加入400pl10%CCK8的不含血清的培養(yǎng)基（10%CCK8溶液須提前配置好），避光培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng),于酶標(biāo)儀450nm和650nm波長測定其吸光度。）實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：種3*104/孔細(xì)胞于24孔板中，加入培養(yǎng)基分別孵育1,3,7天后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2-3次（PBS需吸

19、干），每孔加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度。（若為鎂合金的control組，則應(yīng)將control組中的細(xì)胞消化下來，再與CCK8進(jìn)行孵育?？瞻讓?duì)照：在空白孔中加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。備注：一個(gè)方塊材料為1cm2，一塊材料消耗1ml培養(yǎng)基在材料上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需每天進(jìn)行換液，防止鎂合金腐蝕對(duì)細(xì)胞造成影響。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。特別重要的是，在加入CCK8之前，必須把材料轉(zhuǎn)移至其

20、他空白孔中,以免貼壁在材料外的細(xì)胞造成的實(shí)驗(yàn)誤差。材料浸提液CCK8的實(shí)驗(yàn)方案1、對(duì)材料先進(jìn)行封膠處理，封膠時(shí)底面只弄一次，盡量平整、薄。封膠完畢后，在干燥箱中存放3天，多余的膠用手術(shù)刀切掉，盡量使底部保持平整。在用于浸泡之前，用2000#砂紙對(duì)WE43再次進(jìn)行打磨，以去除表面的氧化膜。2、準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯，在燒杯中滅菌，材料正面向上，盡量避免碰到尖銳物。將材料于75%的乙醇中滅菌10min,再用PBS清洗3次，轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入培養(yǎng)基后在桌面來回動(dòng)10-20s。3、材料與a-MEM+雙抗培養(yǎng)基在5%CO2，37C條件下孵育3天（lml/cm2）。4、提取上層液在4C中保存，使用前用0.22

21、pm的濾頭過濾除菌（加過雙抗可不滅菌），離心去上清液（液體有揮發(fā)就補(bǔ)齊），4C保存，材料回收。5、細(xì)胞用a-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+100U/ml雙抗培養(yǎng)。6、取70%-80%對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗滌，用含10%胎牛血清-MEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，在96孔板上種細(xì)胞，密度為5*103/孔，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。24h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入材料提取液90pl+10plFBS（10%）。進(jìn)一步稀釋成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90卩l(xiāng)培養(yǎng)基和10plFBS位對(duì)照組，每一樣品設(shè)5個(gè)復(fù)孔。37C培養(yǎng)1,3,7天，棄提取液，PBS洗2-3次，每

22、孔加入100卩l(xiāng)不含血清的10%CCK8培養(yǎng)4h,終止培養(yǎng)，于酶標(biāo)儀450nm波長測定其吸光度?？瞻讓?duì)照:在空白孔中加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的10%CCK8溶液，避光培養(yǎng)4h，測定450nm的吸光度即為空白對(duì)照。按細(xì)胞增值度法計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率（Relativegrowthrate，RGR），并按表1的要求，將RGR值轉(zhuǎn)化成六級(jí)，評(píng)定材料毒性。RGR（%）=（材料組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）X100%表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)定結(jié)果0級(jí)1級(jí)2級(jí)3級(jí)4級(jí)5級(jí)RGR(%)210075-9950-7425-491-240評(píng)定結(jié)合格合格結(jié)合細(xì)胞不合不合格不合格果形態(tài)綜合格評(píng)價(jià)注意事項(xiàng)：由

23、于使用96孔板進(jìn)行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意蒸發(fā)問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，所以還原劑（例如一些抗氧化劑）會(huì)干擾檢測，如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設(shè)法去除。用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒有氣泡，否則會(huì)干擾測定。細(xì)胞CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照下圖:1B014080IncubationTime(day)Fig.15.InvitrocellviabilityofMC3T3-E1pre-oteoblastscu

24、lturedintheextractionmediumoftheuntreatedandNd-implantedWE43for1and3days.100Extract70%ExtractRW50%Extract010%Extractaba&cWE43b&dNd-implantedWE43如圖所示，相同濃度浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)1天和3天后，100%WE43浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性比較大，細(xì)胞存活率分別為60%和40%左右，而釹元素等離子注入WE43100%浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)1天和3天后，細(xì)胞存活率分別為90%和100%左右，且在低濃度情況下釹元素等離子注入WE43能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，表明經(jīng)過改性后的WE4

25、3具有良好的生物相容性。Improvementofcorrosionresistanceandbiocompatibilityofrare-earthWE43magnesiumalloybyneodymiumself-ionimplantation,CorrosionScience94(2015)142-55.細(xì)胞骨架和DAPI染色（細(xì)胞粘附測試）定義：細(xì)胞骨架是由蛋白質(zhì)絲搭建起的骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),主要包括微管，微絲，中間纖維。它們對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞、基因表達(dá)等都起到重要作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕容^材料表面改性前后早期細(xì)胞直接粘附的狀態(tài)細(xì)胞：小鼠胚

26、胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1原理：利用抗原-抗體反應(yīng)原理，就是以一抗作為探針，它與目的蛋白作用并連接，再用帶有熒光（或同位素）標(biāo)記的二抗與一抗作用，最后顯色，發(fā)光位置就有目的蛋白。羅丹明熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細(xì)胞的F-actin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。DAPI為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化，固定過和沒有固定過的活細(xì)胞均可用DAPI染色。實(shí)驗(yàn)方案：準(zhǔn)備一個(gè)小燒杯，將材料浸沒在裝有乙醇的小燒杯中滅菌10-15min。將材料放置24孔板中用PBS震蕩洗兩次，培養(yǎng)基洗一次。材料放置孔板中部。細(xì)

27、胞以5*104/孔接種，使細(xì)胞懸液均勻的鋪滿整個(gè)材料表面，孵育5h。（先加入800卩1培養(yǎng)基（含血清），觀察是否浸沒了樣品，若不夠再加一些。若有氣泡，戳破。再加入200卩l(xiāng)細(xì)胞重懸液至材料表面，輕微震蕩。）（若材料為鈦合金，則可將細(xì)胞懸液配成配制濃度為2X104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分別注入已置入材料的無菌24孔板。）細(xì)胞孵育5h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS震蕩清洗兩次（24h時(shí)間點(diǎn)：加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄上清，用PBS振蕩清洗兩次），3.7%甲醛（PBS中）在室溫下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。加入0.1%（體積比）TritonX-100（PBS中）破膜5-8min，棄去T

28、ritonX-100上清液，PBS洗3次。在暗室中，取5卩16.6pM羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽用PBS稀釋至200卩1（終濃度為165nM，加入鬼筆環(huán)肽（覆蓋即可，用完可以回收利用），室溫避光孵育40min,吸出染液，用PBS清洗洗3次。6.加入DAPI溶液室溫下染色3-5min,棄去染液，用PBS洗3次，加入PBS,熒光顯微鏡觀察，并拍照記錄。省染料的做法：取封口膜一塊，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使細(xì)胞直接接觸染料染色，注意過程中染料不能干。正置熒光顯微鏡觀察法：取干凈載玻片，將材料放在載玻片上（事先泡在PBS中，取出時(shí)用吸水紙輕輕拭干，有細(xì)胞的表面朝上放置）。打開顯微鏡，熒光，電腦。先在顯

29、微鏡以（X100。即（10倍物鏡。觀察整體情況。熒光：1通道：DAPI，2通道：FITC,3通道：羅丹明觀察：1.細(xì)胞骨架形態(tài)是否發(fā)生變化肌動(dòng)微絲是否出現(xiàn)增粗細(xì)胞間連接是否增多細(xì)胞形態(tài)：多角形變成梭形，偽足明顯增多注意：DAPI和鬼筆環(huán)肽具有劇毒性，在使用的時(shí)候應(yīng)盡量小心，一定要帶手套操作，避免將染料弄到皮膚上。細(xì)胞骨架和DAPI熒光染色圖片結(jié)果如下圖：Zn-PIIIAg-PIII*4SOjua亀.*%摯琴.iA*仏.1*e廠b,SOiaZn/Ag630AnnexinV-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測，PI紅色熒光(流式Ex=488，Em630)通過FL2或FL3檢測，建議使

30、用FL3。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為(FITC-/PI-)；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為FITCLOGFLUOR(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。rai.AnnexinV-FITC和碘

31、化丙頊染色后的沐式削胞僅卷測效呆屈正常的活細(xì)胞不被A肋芒inV-FITC和膜猶丙呢染色圏中左下部井h罰亡早朋的細(xì)胞僅趙AnnatinV-FTTC色.他化丙噬勢(shì)色呈陰性(圖呼右下部分h壞死細(xì)胞和時(shí)亡晚期的細(xì)胞可低同時(shí)feAiinrxinV-FITC和碘化丙喘錨色(昭中右上部井h罔中左上卻分出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的栓測溟芒，熒光顯微照相操作方法：滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞；對(duì)于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。a.將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對(duì)照組;b.用冰冷PBS洗滌細(xì)胞兩次;在500yL的B

32、indingBuffer中加入2yLAnnexinV-FITC,5yLPI，混勻；將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻覆蓋；避光、室溫反應(yīng)5min。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片(FITC和Rhodamine)觀察AnnexinV-FITC熒光信號(hào)呈綠色，PI熒光信號(hào)呈紅色結(jié)果判斷：結(jié)合AnnexinV-FITC的凋亡細(xì)胞的質(zhì)膜將顯示綠色光圈；膜結(jié)構(gòu)不完整的壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞在整個(gè)核區(qū)被PI染成紅色而質(zhì)膜為AnnexinV-FITC陽性呈現(xiàn)為綠色光圈。Anrwxin仏FH匸和讀比禹瞅肥觸色妊黑國.隅巾鰥色黃怎*3Annesin仏FJPC酗色陰性伺軋紅色

33、茨光為琪比丙味黑苗陽世卿fL儀刪色英光期色的為閒亡第胞，盛縫色卻紅魚熒itSSt的是壞視細(xì)胞未議蔬光熱色的為JE常第庖=HUVECScells實(shí)驗(yàn)protocolTranswell1實(shí)驗(yàn)用品：小室：coster的24孔板的transwell的8pm。上層培養(yǎng)液：上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2%BSA?；|(zhì)膠：常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和W型膠原，Matrigel是BD公司生產(chǎn)的，是一種細(xì)胞外基質(zhì)，4度時(shí)是液體，在37度會(huì)逐漸凝固成膠狀，不可逆。使用前于4C冰箱冰水混合物中融化過夜下層培養(yǎng)液：下層常用含5%10%FBS的培

34、養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個(gè)人認(rèn)為，F(xiàn)BS仍是最合適的。包被基底膜：用50mg/LMatrigel1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4C風(fēng)干。水化基底膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37C，30min。制備細(xì)胞懸液2.1制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h，進(jìn)一步去除血清的影響。2.2消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗12遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至110X105，最好不要超過5

35、X105。接種細(xì)胞3.1取細(xì)胞懸液100200pl加入Transwell小室，24孔板小室一般200pl。3.224孔板下室一般加入500pl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。（這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。）培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。5細(xì)胞染色用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞染色：推薦采用0.1%結(jié)晶紫染色。(這種方法有如下優(yōu)勢(shì)：(1).

36、不需要固定細(xì)胞，直接染色即可。(2).配制簡單方便。(3).染色后可以用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm測其0D值，間接反映細(xì)胞數(shù)。)顯微鏡照相和細(xì)胞計(jì)數(shù)：取若干個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)一般采用5-10個(gè)，隨機(jī)選取，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。另：值得注意的是，有侵襲能力的細(xì)胞才可用于Transwel1侵襲實(shí)驗(yàn)。建議實(shí)驗(yàn)前先用酶譜法檢測MMPs的表達(dá)，特別是MMP-2的表達(dá)。如果不清楚細(xì)胞MMPs的表達(dá)情況，就盲目進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)造成不必要的浪費(fèi)。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N,BD有售)，這樣做的目的是使穿過膜的細(xì)胞更好地附著

37、在膜上，也可用膠原(collagen)或明膠(gelatin)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)鋪板前用記號(hào)筆在孔底部畫4-5條平行線(方便拍照時(shí)區(qū)域定位)；鋪滿六孔板細(xì)胞，貼壁；用10ul槍頭和直尺于垂直平行線方向進(jìn)行劃痕，4-5條，PBS洗一遍；3換含不同藥物濃度的無/有血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；4.不同時(shí)間取不同位置觀察劃痕距離并顯微鏡拍照。免疫熒光一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1、片子處理將新片子用1%的HCl泡片子1h,再用75%的乙醇溶液泡0.5h以上，用紗布擦干凈即可備用2、試劑配備透化液0.2%TritonX-100/PBS封閉液5%BSA/PBST(可以加0.2%TritonX-100)抗體稀釋液2%BSA/PBST(

38、可以加0.2%TritonX-100)DAPI染液0.2-lyg/yl一抗稀釋1:100-1:500（依據(jù)抗體說明書）1:100-1:500二抗稀釋（避光）注：DAPI先用超純水配成5mg/ml的儲(chǔ)存液，保存在-20C，此乃原始儲(chǔ)存液。將此原始儲(chǔ)存液1:50稀釋成100yg/ml的儲(chǔ)存液，染色時(shí)根據(jù)情況的不同1:100-1:500稀釋成工作液，此工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，遺傳所四樓正置顯微鏡1:500稀釋即可；所里共聚焦顯微鏡稀釋比例需為1:100。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、培養(yǎng)基不棄，加27yl/ml的甲醛室溫固定10min2、PBS洗3次，5min/次，洗時(shí)輕輕搖晃3、用透化液室溫透化10min4、

39、PBS洗3次，5min/次5、用封閉液37C封閉1h6、PBS洗3次，5min/次7、加入一抗室溫孵育40min，如果雙標(biāo)，這兩種一抗可以一起加8、PBST洗3次，5min/次9、加入二抗室溫孵育30min,此后的過程都需要避光10、PBST洗3次，5min/次11、稀釋DAPI染液（儲(chǔ)存液濃度lOOpg/pl）,加入DAPI染液室溫避光染色2-10min12、PBST洗3次，5min/次13、抗淬滅劑封片，必要時(shí)可用指甲油將邊緣封住，用正置顯微鏡或用共聚焦顯微鏡觀察即可。注：1、細(xì)胞數(shù)不用太多（約50%），細(xì)胞數(shù)過多會(huì)造成透化、抗體孵育等不充分2、如果細(xì)胞貼壁不牢，可以適當(dāng)延長固定時(shí)間（10

40、-30min）3、如果雙標(biāo)，一抗一定選擇不同源性的，并且要相應(yīng)的選擇好二抗。一般來說，F(xiàn)ITC的二抗特異性好，背景低；羅丹明的二抗背景較高4、DAPI染色需要摸索，染得過亮或過弱都不好小管形成實(shí)驗(yàn)1、4C過夜溶解基質(zhì)膠（基質(zhì)膠只有在4C的時(shí)候才是液態(tài)），培養(yǎng)基，槍頭盒，96孔板和滅菌EP管需提前放置冰箱預(yù)冷。2、實(shí)驗(yàn)時(shí)取出預(yù)冷的槍頭以無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液1:3（培養(yǎng)基：膠）稀釋基質(zhì)膠，此步驟要迅速（混勻時(shí)千萬注意不要吹起氣泡）3、以150-200ul/cm2生長面積的比例（蓋住底面高出2-3mm即可，一般取100ul）加入稀釋好的基質(zhì)膠至96孔板中（加膠時(shí)千萬不要吹起氣泡，氣泡是戳不掉的

41、，直接影響成膠）。將96孔板放置在培養(yǎng)箱中1h讓膠凝固。4、將細(xì)胞以專用培養(yǎng)基+10%專用血清的培養(yǎng)液稀釋以2*104/well/100ul的濃度加入96孔板（可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行稀釋：1、可以先加浸提液50ul，再加入50ul細(xì)胞懸液，防止細(xì)胞被液體沖亂；2、也可直接先用浸提液和細(xì)胞懸液在ep管中混勻，再加入100ul于96孔板基質(zhì)膠中），前后微微反動(dòng)孔板使細(xì)胞均勻鋪展，注意避免液體傾出；5、將孔板放入37C培養(yǎng)箱中孵育4,8,10,12,16h后于顯微鏡下觀察成管現(xiàn)象，尋找環(huán)狀的細(xì)胞管。觀察：小管與小管之間的連接數(shù)小管的長度及小管的管徑大小注意：每個(gè)樣品做兩個(gè)孔即可。成環(huán)與細(xì)胞的密度有關(guān)，細(xì)

42、胞少則無法成環(huán)，細(xì)胞太多會(huì)大片生長，也無法成環(huán)，可以做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)探索下細(xì)胞的密度。血管形成實(shí)驗(yàn)需要高濃度的基質(zhì)膠，基質(zhì)膠濃度太低膠原蛋白等含量不夠很難成管。系時(shí)候成管所需時(shí)間較長。在顯微鏡下觀察，膠時(shí)三維的，所以細(xì)胞長在上面不可能完全聚焦清楚，拍照時(shí)應(yīng)選較為清晰呈現(xiàn)小管的圖片即可。在拍照的時(shí)候最好找同一個(gè)視野進(jìn)行拍照，最好為中部。因?yàn)檫吘壭?yīng)，孔邊上的細(xì)胞更易成環(huán)。血液相容性一、溶血率實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測含銅鈦合金對(duì)血液中紅細(xì)胞的破溶血作用實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、陰性對(duì)照組（PBS）,陽性對(duì)照組（超純

43、水）取新鮮抗凝血8mL，加PBS10mL稀釋（4:5）抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金與適量無菌PBS混合，按照材料表面積與浸提液體積比為1.25cm2/10mL的標(biāo)準(zhǔn)，每組各3管（24孔板加厚：5.28cm2，24孔板：3.96cm2，?。?.20cm2，單位面積的液體體積相同即可）陰性對(duì)照組3管，每管加同批號(hào)PBS10mL。陽性對(duì)照組3管，每管超純水10mL全部試管浸入37C水浴槽中30min，每管加稀釋血0.2mL,輕輕混勻后置于37C水浴槽中繼續(xù)保溫60min取各試管內(nèi)液體3000rpm離心5min，吸取上清150uL

44、放入96孔板,于分光光度計(jì)545nm波長處測定吸光度取3次實(shí)驗(yàn)的平均值計(jì)算溶血率（Hemolysisrate，HR）:HR=（樣品吸光度-陰性對(duì)照吸光度）/（陽性對(duì)照吸光度-陰性對(duì)照吸光度）X100%按ISO規(guī)定溶血率三5%,則材料符合醫(yī)用植入材料的溶血實(shí)驗(yàn)要求；溶血率5%,則表示實(shí)驗(yàn)材料有溶血作用。Ilbk2Valuerofopiccaldensinaibdhaemclysispercwit-ngsfwdifkreniironbnwdfoamsOpliLalderiibityHacrn戶i譏足PtisdcKecorn曲葉甌1.00hvegjLivgcrflErcI汕島Fe0.0487土0.0

45、03673.467土ft.557Fe-CKTsO.U3413土D.JU3333-72XJ0310D.OWJ土0.DO2671.090=1=0.41(SinteredmetallicfoamsforbiodegradablebonereplacementMaterials,JPorousMater(2014)21:131-40;DOI10.1007/s10934-013-9757-4二、粘附在材料表面的紅細(xì)胞的SEM實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測血液中紅細(xì)胞在不同合金表面的粘附狀態(tài)實(shí)驗(yàn)步驟：1、實(shí)驗(yàn)材料：抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6A1-4V合金、稀土含銅鈦合金，純鈦、純銅、鈦銅合金、2

46、、取新鮮抗凝血8mL,加PBS10mL稀釋（4:5）3、抗菌Ti-6Al-4V-5Cu合金、普通Ti-6Al-4V合金、稀土含銅鈦合金,純鈦、純銅、鈦銅合金與適量稀釋血液混合后，37C培養(yǎng)箱中孵育30min。4、棄血液，PBS洗兩次，每個(gè)樣品加入800uL的2.5%的戊二醛進(jìn)行固定（室溫60min）,然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。5、使用30%，50%，60%,70%,90%,100%的酒精逐步脫水，每次5min6、HCP-2臨界點(diǎn)干燥儀干燥2小時(shí)7、樣品上銅臺(tái)，Pelco.Sc-7自動(dòng)鍍金儀鍍金8、SEM鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。Asurface-erodingpoly(1,3-t

47、rimethylenecarbonate)coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689說明：正常紅細(xì)胞為圓形面包圈形狀，當(dāng)紅細(xì)胞形狀變成不規(guī)則時(shí)，說明材料對(duì)紅細(xì)胞有溶血作用，血液相容性不理想。血小板粘附實(shí)驗(yàn)材料數(shù)量：每種材料2個(gè)樣品，1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2個(gè)平行樣。PRP（富血小板血漿）waspreparedbycentrifugingw

48、holebloodfor10minat1000rpm.（血小板在上層清液）PRPwasdrippedontothesample（300uL/孔）platesandincubatedat37Cforlh。（材料先放入24孔板,PBSwasusedtoremovenon-adherentplatelets（2）每孔加入300uL的2.5%的戊二醛進(jìn)行固定（室溫60min）,然后用PBS緩沖液輕輕沖洗2遍，每次5min。使用30%,50%,60%,70%,90%,100%的酒精逐步脫水，每次5minHCP-2臨界點(diǎn)干燥儀干燥2小時(shí)樣品上銅臺(tái)，Pelco.Sc-7自動(dòng)鍍金儀鍍金SEM鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

49、Asurface-erodingpoly（l,3-trimethylenecarbonate）coatingforfullybiodegradablemagnesium-basedstentapplications:Towardbetterbiofunction,biodegradationandbiocompatibility,ActaBiomaterialia9(2013)8678-689說明：血小板是由紅骨髓中巨核細(xì)胞破碎后形成的一種無色、體積小、形態(tài)不規(guī)則的小體，初生時(shí)體積較大，衰老時(shí)則較小，平均壽命為3-5天。血小板具有粘附于異物表面的功能，可發(fā)生粘附、變形、聚集、釋放等反應(yīng)，相同實(shí)

50、驗(yàn)條件下，若材料表面上的血小板粘附數(shù)量少，聚集少，變形少（血小板不長出多余偽足），則表面其血液相容性好。粘附在異物表面的血小板主要分為五類形狀：圓形，樹突狀，散布樹枝狀，鋪展和充分鋪展。蛋白粘附實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎床牧系鞍渍掣角闆r。實(shí)驗(yàn)背景：細(xì)胞在生物材料表面的粘附是通過生物識(shí)別過程來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)生物材料與血液、組織液以及含有血清的培養(yǎng)基接觸時(shí)，材料的表面會(huì)迅速地吸附一層蛋白質(zhì)分子，然后才是細(xì)胞到達(dá)材料的表面，即細(xì)胞通過整合素與生物材料相黏附。材料表面性質(zhì)通過影響粘連蛋白的黏附來影響細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)原理：BCA（Bicinchoninicacid）法是目前應(yīng)用比較廣泛的蛋白質(zhì)濃度測定方法?；陔p縮脲反應(yīng)，即在

51、堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+，產(chǎn)生一種紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的吸光值，該反應(yīng)產(chǎn)物的量與蛋白質(zhì)濃度成正比。材料數(shù)量：每種材料,1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2個(gè)平行樣。實(shí)驗(yàn)步驟：消毒材料分組：Ti，Ti-5Cu,TC4,TC4-5Cu,Cu,稀土鈦（6種材料，3個(gè)平行樣）。材料編號(hào)，將不同型號(hào)材料分別植入24孔板和48孔板，每孔加1000uL（24孔板）和600ul（48孔板）培養(yǎng)液（a-MEM）（無細(xì)胞），將各培養(yǎng)板置于37C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。4h后取出24孔板和48孔板，吸棄培養(yǎng)液，生理鹽水沖洗3遍,將材料轉(zhuǎn)移至新的24孔板和四十八孔板內(nèi)（材料和板孔相差不大可不換新的

52、板），在新的培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入0.2%tritonx-100裂解液500ul（24孔板）和300ul（48孔板）過夜，4度。取裂解液25ul于96孔板,再加入200ul的BCA（A液:B液=50:1），37C孵育30min后，96孔板于酶標(biāo)儀下檢測吸光值OD。（562nm）根據(jù)擬合好的標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計(jì)算蛋白總量，式中X為OD值,Y為蛋白質(zhì)濃度，單位為（ug/ml）。EZZ3JDBMIIHF-JDBMz.o-21.Q-D.5-1d1DdFig.3DegradaLJOiiraieotJUBMandHF-JDBMforIdacidJUdimmersiontestinDMEM+K)%FBSutider

53、cellcultureconditioncalculatedbymasslossmethod(*FHCI(pHB6)10%SOS忙咯過Kt醸錢TEMED1ft%GoifeOLSMTris-Md(pHB創(chuàng)10%SDS10%過BE酸黏TEMED1?%GelHsO30%Acrylamide1.SMTri-HCI蟲衛(wèi))10%SOS苗第過磕醸蛀TEMED15MiH?O30%crylandig1；MPisHCIeHfi.E)10%過it皤卷TEMED耳0(M.6M.3.0血.0121.1.o./段1$1.71.30.050.05也血1.61.10.0500503830611呂22.d.aC67511_M4,2.2Qo.c-4.03.32.60.1fl.1Cl.d043.34.0站0101(100496A-17.3