實(shí)驗(yàn)二免疫熒光課件

1、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在原位觀察到化學(xué)成分,提供什么信息？1.推測(cè)化學(xué)成分（大分子）的可能功能2.觀察生理、病理狀態(tài)下的大分子動(dòng)態(tài)變化定位的變化量的巨大變化3.指示大分子所在的特異細(xì)胞，觀察細(xì)胞在組織的分布及在生理病理狀態(tài)下的變化細(xì)胞化學(xué)1.保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)；2.防止細(xì)胞的自溶，以免使抗原擴(kuò)散至組織間質(zhì)； 3.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固;4.保持組織或細(xì)胞化學(xué)成分的某些屬性,如抗原性或核酸雜交活性。固定（Fixation)特點(diǎn)1.原位：怎樣做到組織/細(xì)胞的原位？ 根據(jù)組織類型，選擇合適的固定劑 特點(diǎn)2.細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)及可見(jiàn)性酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原位雜交技術(shù)放射自顯影酶+底物反應(yīng)顯色反應(yīng)抗

2、原+抗體反應(yīng)顯色反應(yīng)放射性同位素衰變和射線的釋放反應(yīng)感光核酸雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰庖邿晒饧夹g(shù)的基本原理熟悉細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的方法了解在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中如何獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果人體和其他多細(xì)胞生物都由細(xì)胞按特定方式有序構(gòu)建皮膚組織死去的角質(zhì)化細(xì)胞表皮細(xì)胞真皮細(xì)胞基膜細(xì)胞內(nèi)錨定蛋白（與骨架附著）跨膜黏附蛋白（黏附分子）細(xì)胞內(nèi)錨定蛋白（Vinculin）位于質(zhì)膜胞質(zhì)面，提供細(xì)胞骨架成分附著點(diǎn)。錨定連接的構(gòu)成：跨膜黏附蛋白細(xì)胞骨架（actin）實(shí)驗(yàn)原理原位檢測(cè)抗原抗體特異反應(yīng)間接法 間接熒光抗體染色法示意圖抗原抗體熒光素標(biāo)記的抗抗體激發(fā)光顯示熒光Vinculin的檢測(cè)肌動(dòng)蛋白：細(xì)胞骨架微絲的單體

3、鬼筆環(huán)肽：是一種高親和力F肌動(dòng)蛋白探針， 可與F肌動(dòng)蛋白特異結(jié)合。四甲基羅丹明(TRITC)： 激發(fā)光/發(fā)射光波長(zhǎng): 540/565 nm， 紅色熒光染料。羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽可特異性的標(biāo)記F肌動(dòng)蛋白，并發(fā)出具有獨(dú)一無(wú)二的高亮度和光穩(wěn)定性的紅色熒光。 skin fibroblast labeled with rhodamine phalloidin.實(shí)驗(yàn)原理微絲骨架的檢測(cè)熒光探針實(shí)驗(yàn)用品固定液：4%多聚甲醛封閉試劑：10%正常山羊血清0.2%Triton X-100一抗：小鼠源抗Vinculin單克隆抗體 （abcam）二抗: Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG （invitro

4、gen）羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽： （ Rhodamine Phalloidin，invitrgen）DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）：（碧云天）PBS洗滌緩沖液：PH7.4試劑Hela細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)皿熒光顯微鏡材料及儀器一，細(xì)胞制備和細(xì)胞固定實(shí)驗(yàn)步驟將細(xì)胞鋪在24孔板中將細(xì)胞培養(yǎng)至所需密度固定染色或保存PBS洗滌實(shí)驗(yàn)步驟二，細(xì)胞免疫熒光（ICC）染色0.2%TritonX處理5min 封閉室溫30min4過(guò)夜371-2小時(shí)375-10min熒光顯微鏡觀察加入一抗 加入二抗和鬼筆環(huán)肽加入DAPI復(fù)染PBS洗滌PBS洗滌PBS洗滌實(shí)驗(yàn)結(jié)果紅色：微絲綠色：vinculin藍(lán)色：細(xì)胞核注意事項(xiàng) 細(xì)

5、胞密度: 60-70% 防止細(xì)胞污染 固定時(shí)間: 一般5-30min 漂洗: 必要時(shí)用恒溫?fù)u床搖洗 激光共聚焦顯微鏡: 專用培養(yǎng)皿細(xì)胞污染免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)標(biāo)記物 1. 免疫熒光技術(shù) 2. 免疫酶技術(shù) 3. 免疫親和技術(shù) 4. 免疫膠體金技術(shù)特異大分子在組織細(xì)胞原位的定位、定性“Step by step”實(shí)驗(yàn)步驟固定fixation包埋embedding切片sectioning抗原修復(fù)antigen retrieval封閉blocking一抗孵育1st Ab incubation二抗孵育2nd Ab incubation酶底物顯色enzyme substrate封片和觀察Mounting/obs

6、ervation實(shí)驗(yàn)樣本優(yōu)點(diǎn)不足保持細(xì)胞、組織形態(tài)容易保存需進(jìn)行石蠟包埋，染色前需脫蠟需要進(jìn)行抗原修復(fù)1，石蠟切片（Paraffin-emnedded sections）石蠟包埋乙醇梯度脫水：50%、70%、80%每次1h, 95%、100%各兩次1h.二甲苯兩次1h.恒溫箱中浸蠟兩次4小時(shí)。使用包埋機(jī)包埋。脫蠟/復(fù)水1.65烤片1h。2.二甲苯兩次5min。3.乙醇梯度復(fù)水：100%、95%、70%、50%、30%每次5min。4.水/PBS漂洗5min。實(shí)驗(yàn)樣本2，冰凍切片（Frozen sections）優(yōu)點(diǎn)不足 操作步驟簡(jiǎn)單，時(shí)間短， 適用于活檢 抗原活性保存較好 形態(tài)較石蠟包埋的樣本

7、差 冰晶的形成可能會(huì)影響細(xì)胞、 組織結(jié)構(gòu) 切片不易保存 冰凍切片HE染色石蠟切片HE染色固定正確的固定是免疫組織化學(xué)方法的關(guān)鍵，免疫組化無(wú)法檢測(cè)一個(gè)已經(jīng)不存在的抗原組織塊迅速浸入固定液，最大限度保護(hù)抗原。樣本不要太大，保證完全浸潤(rùn)。固定液濃度：濃度越大，固定程度越好。固定時(shí)間與溫度：時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，固定程度越深。交聯(lián)試劑如：中性甲醛溶液、多聚甲醛、福爾馬林等，有利于保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但是會(huì)產(chǎn)生蛋白交聯(lián)，降低抗原性，因此需要進(jìn)行抗原修復(fù)。有機(jī)試劑如：預(yù)冷的甲醇、乙醇、丙酮等，它們會(huì)吸去脂類使細(xì)胞脫水，并使蛋白變性，這種固定方法不需要再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透。灌注固定：將固定液通過(guò)內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)灌注到組織中，

8、特別是腦組織的取材！抗原修復(fù)福爾馬林或多聚甲醛固定會(huì)導(dǎo)致蛋白交聯(lián)，而解交聯(lián)的過(guò)程稱為抗原修復(fù)。蛋白水解酶37孵育10-20min。對(duì)樣本損害較小，冰凍切片適用。切片置于加熱至98 的修復(fù)液中約25min。熱抗原修復(fù)（HIER）高壓蒸汽法微波法水浴加熱法酶抗原修復(fù)（PIER）胰蛋白酶（Trypsin）胃蛋白酶（Pepsin）蛋白酶K（Proteinase K）熱抗原修復(fù)封閉正常動(dòng)物血清：不能與一抗同源最好是二抗同源牛血清白蛋白BSA降低非特異性結(jié)合（如免疫球蛋白IgG登）所造成的背景染色沒(méi)有封閉，高背景有封閉，低背景封閉標(biāo)記方法封閉方法使用HRP標(biāo)記物0.3%H2O2室溫孵育10-15min使用

9、AP標(biāo)記物0.24mg/ml的左旋四咪唑加到染料溶液中使用生物素標(biāo)記物封閉試劑盒使用熒光標(biāo)記物用含0.3M甘氨酸的封閉液封閉通透（permeabilization） 當(dāng)抗體檢測(cè)位于細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白時(shí)(包括抗 原表位在胞內(nèi)段的跨膜蛋白)，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行通透。 將樣品在含0.1-0.2%Triton X-100的PBS中孵 10min。 使用預(yù)冷的甲醇或丙酮固定則不需要通透 。一抗孵育建議濃度每一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)都要找出合適的抗體濃度，使得特異性染色最大化并減少背景二抗孵育酶偶聯(lián)二抗 - 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）， 堿性磷酸酶（AP）熒光偶聯(lián)二抗 - Alexa Fluor, DyLight, FIT

10、C, PE生物素 - 使用親和素（avidin）偶聯(lián)的HRP 進(jìn)行信號(hào)放大酶標(biāo)還是熒光標(biāo)？石蠟切片適合使用酶標(biāo)顯色系統(tǒng)甲醛固定會(huì)增加自發(fā)熒光組織內(nèi)某些成分如collagen會(huì)有自發(fā)熒光冰凍切片適合使用熒光標(biāo)簽細(xì)胞樣本、冰凍切片不需要甲醛類固定液長(zhǎng)時(shí)間處理，避免自發(fā)熒光使用熒光標(biāo)簽的好處:能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)蛋白，可以分開(kāi)觀察，也可以merge到一起可以觀察共定位（co-localization）復(fù)染底物顯色標(biāo)記酶底物產(chǎn)物顏色HRPDAB棕黃色AEC紅色DAB+nickel enhancer黑色APBCIP/NBT藍(lán)紫色萘酚AS-MX+fast red紅色顯色時(shí)鏡下觀察顯色程度，確定顯色時(shí)間！免疫

11、組化：蘇木素(藍(lán)色)，核固紅（紅色）免疫熒光：DAPI、Hoechst封片并觀察免疫組化：中性樹(shù)膠免疫熒光：50%、75%或95%甘油 抗熒光淬滅封片液 抗熒光淬滅封片液（含DAPI）在切片上蓋上玻片來(lái)保存和保護(hù)切片，并能提升影像的質(zhì)量。沒(méi)有信號(hào)/染色常見(jiàn)問(wèn)題 使用陽(yáng)性對(duì)照 優(yōu)化抗原修復(fù)條件 增加抗體濃度 信號(hào)放大（生物素-親和素系統(tǒng)） 無(wú)抗原，用原位雜交技術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)樣本里沒(méi)有目標(biāo)抗原或抗體的特異性不好NeuN在成熟神經(jīng)元中特異表達(dá)GFAP在膠質(zhì)細(xì)胞中特異表達(dá)高背景染色高背景蓋過(guò)特異染色常見(jiàn)問(wèn)題 降低抗體濃度 優(yōu)化封閉條件 縮短抗原修復(fù)時(shí)間 使用陰性對(duì)照高背景低背景不正確的信號(hào) 調(diào)整固定方法 優(yōu)化抗原修復(fù)條件 抗體的特異性不高抗原染色位置不正確常見(jiàn)問(wèn)題4%PFA固定甲醇固定Hela細(xì)胞Rabbit monoclonal to