利用RNA-Seq技術(shù)鑒定擬南芥不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

1、利用RNA-Seq技術(shù)鑒定擬南芥不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 /cjbcn DOI: 10.13345/j.cjb.140529 April 25, 2015, 31(4): 552?565 ?2015 Chin J Biotech, All rights reserved 王興春1,2，陳釗3，樊娟1，何苗苗1，韓淵懷2,4，楊致榮3 1 山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西 太谷 030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801 3 山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西 太谷 030801 4 農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西 太原 030031 摘 要: 轉(zhuǎn)錄調(diào)

2、控是不定芽再生過程的主要調(diào)控方式之一，但具體機制尚需進一步研究。為此，利用基于Illumina HiSeq? 2000測序平臺的RNA-Seq技術(shù)分析了不定芽再生缺陷突變體be1-3和野生型WS在愈傷形成和不定芽再生過程以及野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達的轉(zhuǎn)錄因子 (Transcription factor，TF) 編碼基因。結(jié)果表明：與野生型WS相比，be1-3在脫分化過程差異表達的TF編碼基因有155個，其中表達量上調(diào)的97個，表達量下調(diào)的58個；在再分化過程差異表達的TF編碼基因有68個，其中表達量上調(diào)的40個，表達量下調(diào)的28個；而在野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變的過程，總

3、共檢測到231個差異表達的TF編碼基因，包括160個表達量上調(diào)的基因和71個表達量下調(diào)的基因。其中，MYB-related (v-myb禽成髓細胞瘤病毒癌基因) 家族的不定芽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因ART1在be1-3突變體脫分化階段的表達量提高了3 217倍，是表達量上調(diào)最大的TF編碼基因。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該基因過量表達導致愈傷形成和不定芽再生缺陷，并抑制了幼苗特別是主根的生長發(fā)育，表明該基因是愈傷形成和不定芽再生過程的一個負調(diào)控因子。本研究不僅加深了人們對不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的認識，而且為今后不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了大量候選基因信息。 關(guān)鍵詞: 不定芽再生，愈傷組織形成，RNA-Seq

4、，轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，擬南芥 Received: November 4, 2014; Accepted: December 11, 2014 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31100235), Natural Science Foundation of Shanxi (No. 2013011028-1), Shanxi Scholarship Council of China (No. 2010050). Corresponding author: Xingchun Wang. Tel: +86-

5、354-6287191-307; E-mail: Zhirong Yang. Tel: +86-354-6288341; E-mail: 國家自然科學基金 (No. 31100235)，山西省自然科學基金 (No. 2013011028-1)，山西省回國留學人員科研資助項目 (No. 2010050) 資助。 網(wǎng)絡出版時間：2015-02-03 網(wǎng)絡出版地址：/kcms/detail/11.1998.q.20150203.1622.003.html Xingchun Wang1,2, Zhao Chen3, Juan Fan1, Miaomiao He1, Yuanhuai Han2,4, a

6、nd Zhirong Yang3 1 College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China 2 Institute of Agricultural Bioengineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China 3 College of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China

7、 4 Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, Shanxi, China Abstract: Transcriptional regulation is one of the major regulations in plant adventious shoot regeneration, but the exact mechanism remains unclear. In our stu

8、dy, the RNA-seq technology based on the Illumina HiSeq? 2000 sequencing platform was used to identify differentially expressed transcription factor (TF) encoding genes during callus formation stage and adventious shoot regeneration stage between wild type and adventious shoot formation defective mut

9、ant be1-3 and during the transition from dedifferentiation to redifferentiation stage in wildtype WS. Results show that 155 TFs were differentially expressed between be1-3 mutant and wild type during callus formation, of which 97 genes were up-regulated, and 58 genes were down-regulated; and that 68

10、 genes were differentially expressed during redifferentiation stage, with 40 genes up-regulated and 28 genes down-regulated; whereas at the transition stage from dedifferentiation to redifferention in WS wild type explants, a total of 231 differentially expressed TF genes were identified, including

11、160 up-regualted genes and 71 down-regulated genes. Among these TF genes, the adventious shoot related transcription factor 1 (ART1) gene encoding a MYB-related (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) TF, was up-regulated 3 217 folds, and was the highest up-regulated gene during be1-3 ca

12、llus formation. Over expression of the ART1 gene caused defects in callus formation and shoot regeneration and inhibited seedling growth, indicating that the ART1 gene is a negative regulator of callus formation and shoot regeneration. This work not only enriches our knowledge about the transcriptio

13、nal regulation mechanism of adventious shoot regeneration, but also provides valuable information on candidate TF genes associated with adventious shoot regeneration for future research. Keywords: adventious shoot regeneration, callus formation, RNA-Seq, transcription factor, transcriptional regulat

14、ion, Arabidopsis thaliana 作為植物再生完整植株的主要方式之一， 不定芽再生不僅廣泛應用于植物快速繁殖，而 且是利用生物技術(shù)進行作物遺傳改良的前提和 基礎1。植物激素尤其是細胞分裂素和生長素是 影響不定芽再生的最主要因素。經(jīng)典的擬南芥 兩步不定芽再生法即是通過調(diào)控這兩種激素的 比例來實現(xiàn)的：第一步，將擬南芥外植體在含 有高濃度2,4-D的愈傷誘導培養(yǎng)基 (Callus induction medium，CIM) 上進行預培養(yǎng)。經(jīng)過預培養(yǎng)，即可在外植體中柱鞘部位形成愈傷組織2；第二步，將愈傷組織再轉(zhuǎn)移到含有高濃度細胞分裂素的不定芽誘導培養(yǎng)基 (Shoot inductio

15、n medium，SIM) 繼續(xù)培養(yǎng)，即可分化出不定芽3。因此，人們曾經(jīng)樂觀地認為只要合理調(diào)控細胞分裂素和生長素的比例，所有植物的組織或器官都能經(jīng)過不定芽再生出完整植 cjb ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2015 Vol.31 No.4 株。但時至今日，有些植物的離體再生仍非常困難，這極大地限制了基因功能的研究和重要農(nóng)藝性狀基因的應用。長期以來，人們普遍認為愈傷組織的形成是體細胞重編程從而回到一種未分化狀態(tài)的過程。但Sugimoto等4的研究表明，各種器官形成的愈傷組織基因表達模式與根頂端分生組織的基因表達模式類似；

16、而且愈傷組織和側(cè)根的起始受到相同基因的調(diào)控，影響擬南芥?zhèn)雀l(fā)育的基因同樣也會影響植物離體器官發(fā)生。該研究從根本上改變了人們認為愈傷組織是未分化的細胞這一傳統(tǒng)觀念，使人們對不定芽再生機制有了更清晰的認識。 上述細胞分裂素和生長素調(diào)控不定芽再生的過程實質(zhì)上是相關(guān)基因被激活或抑制的過程，在這一過程中轉(zhuǎn)錄因子起著極其重要的作用5。LBD (Lateral organ boundaries domain) 家族的LBD16、LBD17、LBD18和LBD29位于生長素信號下游，在CIM培養(yǎng)基上被迅速誘導表達6。這4個基因中的任何一個過量表達都會促進愈傷組織的形成；相反，功能缺失后導致愈傷形成能力受阻，表

17、明LBDs轉(zhuǎn)錄因子是愈傷形成所必需的6。類似的，細胞分裂素早期響應的關(guān)鍵因子B型ARR在不定芽再生過程也起著關(guān)鍵的作用，而B型ARR是一類MYB轉(zhuǎn)錄因子7-8。APETALA2 (AP2) 家族的ESR1 (Enhancer of shoot regeneration 1) 是細胞分裂素信號下游的調(diào)控因子，過量表達ESR1及其同源基因ESR2可以促進不定芽的再生9-11。對ESR1和ESR2功能缺失突變體esr1和esr2的分析表明，單突變體不定芽再生能力都明顯下降，而且esr1 esr2雙突變體不定芽再生能力比任何一個單突變體都差，暗示了這兩個基因存在功能冗余11。AP2家族的另一成員RAP

18、2.6L的表達量在不定芽分 /cjbcn 化過程中顯著增加，而該基因的突變則影響了芽分生組織特異基因的表達從而導致不定芽分化頻率降低12。LFY (Leafy) 轉(zhuǎn)錄因子是一個調(diào)控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子13。當LFY基因過量表達時，擬南芥根外植體可以直接再生出花器官，表明花發(fā)育相關(guān)基因在花器官離體再生過程也同樣起著重要的作用14。盡管如此，人們對不定芽再生過程仍缺乏系統(tǒng)深入的認識。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得大規(guī)模系統(tǒng)分離和鑒定不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子成為可能15-17。 最近，我們在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個編碼糖苷水解酶13家族的BE1 (Branching enzyme 1) 基因，

19、該基因的EMS點突變體be1-3愈傷形成和不定芽再生嚴重受阻18。為了闡明不定芽再生過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，我們利用RNA-Seq技術(shù)檢測了be1-3突變體與野生型在愈傷形成和不定芽再生兩個階段以及野生型從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達的基因，從中發(fā)現(xiàn)一大批相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并對其中一個負調(diào)控因子ART1 (Adventious shoot related transcription factor 1) 基因進行了深入研究。這些基因可作為不定芽再生轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究的候選基因，其分離和鑒定將有助于全面解析不定芽再生調(diào)控網(wǎng)絡。 1 材料與方法 1.1 植物材料和培養(yǎng)條件 RNA-Seq所用的擬南芥Ara

20、bidopsis thaliana材料為Wassilewskija (WS) 野生型和be1-3突變體18-19。雌激素誘導的條件性過量表達轉(zhuǎn)基因種子來自歐洲擬南芥種質(zhì)中心 (European Arabidopsis Stock Centre，NASC) 的 TRANSPLANTA種質(zhì)20。除非特別說明，擬南芥種子均播種于1/2 MS培養(yǎng)基：2.3 g/L MS基本鹽 (Murashige and Skoog Basal Medium w/Vitamins，PhytoTechnology Laboratories，貨號M519)、2%蔗糖和0.8%的瓊脂粉，pH值5.8。擬南芥幼苗和外植體生長

21、溫度均為22 。采用T8 LED燈管照明，燈管紅、藍、橙和白光燈珠的比例6211。光周期為16 h光照/8 h黑暗交替，光照強度為80?120 mol/(m2s)。 1.2 愈傷組織和不定芽的誘導 愈傷組織和不定芽的誘導參照王興春等17-18 的方法進行：用剪刀剪取20?30 mol/(m2s)弱光下培養(yǎng)的擬南芥下胚軸，置于CIM培養(yǎng)基誘導愈傷，7 d后再轉(zhuǎn)移到SIM培養(yǎng)基誘導不定芽。CIM和SIM的配方詳見王興春等17-18的報道。 1.3 總RNA的提取和RNA-Seq高通量測序及測序數(shù)據(jù)分析 RNA-Seq實驗材料為在CIM培養(yǎng)7 d的 WS (命名為WS-CIM7) 和be1-3 (命

22、名為be1-CIM7) 以及在SIM培養(yǎng)2 d的WS (命名為WS-SIM2) 和be1-3 (命名為be1-SIM2)。為了提高實驗結(jié)果的準確性并節(jié)約測序費用，我們進行了3次生物學重復。3次重復的樣品分別提取RNA，然后等量混合用于RNA-Seq測序，測序反應僅進行1次。首先稱取100 mg外植體材料，將其放入裝有液氮的研缽中，快速研磨成粉末；然后利用康為世紀公司含DNase的植物RNA提取試劑盒 (貨號CW0559) 提取總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進行。RNA-Seq高通量測序利用Illumina HiSeq? 2000測序儀進行。測序產(chǎn)生的圖像數(shù)據(jù)首先經(jīng)堿基識別 (Base ca

23、lling) 轉(zhuǎn)為原始堿基序列數(shù)據(jù)，然后去除含有接頭的 序列和低質(zhì)量的序列，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)稱之為有效讀段 (Clean reads)。對有效讀段進行測序質(zhì)量評估、比對統(tǒng)計、測序飽和度分析和在參考基因上的分布分析，全部分析合格的即可用于基因的差異表達分析?；虮磉_量的計算采用RPKM法進行21，根據(jù)兩個樣本間基因的RPKM值來篩選差異表達的基因。差異表達基因的篩選參照Audic等22的方法進行，將錯誤發(fā)現(xiàn)率 (False discovery rate，F(xiàn)DR) 0.001且差異倍數(shù)不低于2倍即|log2|1的視為差異表達基因。 1.4 不定芽再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選和分類 為了篩選差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，

24、我們將所 有差異表達的基因映射到Gene ontology (/) 數(shù)據(jù)庫進行基因注釋 (Gene annotation)，然后根據(jù)其參與的生物過程 (Biological process) 進行分類，GO term為0001071具有核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的即為不定芽再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。所篩選到的轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)PlantTFDB 3.023進行分類。 1.5 雌激素誘導基因過量表達 愈傷形成階段雌激素誘導及觀察方法：在 CIM培養(yǎng)基中添加10 mol/L的17 -雌二醇 (貨號E-8875，Sigma-Aldrich)，培養(yǎng)7 d。然后，利用Olympus BX51顯微鏡觀察拍照。不定芽再生階段

25、雌激素誘導方法：弱光培養(yǎng)的擬南芥下胚軸在無17 -雌二醇的CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，然后再轉(zhuǎn)移到含有10 mol/L的17 -雌二醇的SIM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。擬南芥幼苗的雌激素誘導方法：將擬南芥種子播種在含有不同濃度 17 -雌二醇的1/2 MS培養(yǎng)基，4 低溫春化2 d，取出后置于擬南芥培養(yǎng)間培養(yǎng)。 cjb ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2015 Vol.31 No.4 2 結(jié)果與分析 2.1 RNA-Seq測序結(jié)果評估 為了解析be1-3突變體在愈傷形成和不定 芽再生兩個階段以及野生型WS從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異

26、表達的TF編碼基因，我們選取了在CIM培養(yǎng)7 d的WS (WS-CIM7) 和be1-3 (be1-CIM7) 以及在SIM培養(yǎng)2 d的WS (WS-SIM2) 和be1-3 (be1-SIM2) 進行RNA-Seq分析。經(jīng)測序WS-CIM7、be1-CIM7、WS-SIM2和be1-SIM2 4個樣品分別得到10 184 656、10 898 770、9 399 484和9 788 169條有效讀段 (表1和表2，以及王興春等17的數(shù)據(jù)，NCBI Sequence Read Archive accession No.分別為SRR1144842、SRR1144843、SRR1144844、和S

27、RR1144845)，其有效讀段分別占99.59%、99.55%、99.55%和99.56%。然后，將WS-CIM7、be1-CIM7、WS-SIM2和be1-SIM2樣品的有效讀段分別與擬南芥基因數(shù)據(jù)庫進行比對分析，結(jié)果表明匹配讀段 (Total mapped reads) 分別占92.96%、92.90%、93.13%和93.02% (表1和表2，以及王興春等17的數(shù)據(jù))。測序飽和度分析表明，這4個樣品檢測到的基因數(shù)在測序量較小時均隨著測序量的增加而增加；當測序量達到4 M時，其增長趨于平緩；而當測序量達到8 M時，檢測到的基因數(shù)趨于飽和 (圖1A和1B，以及王興春等17)。而這4個樣品的

28、測序量均在9 M以上，因此可以認為測序基本覆蓋細胞中表達的全部基因，具有代表性。隨后，我們又分析了有效讀段在擬南芥參考基因上的分布情況，由圖1C和1D 以及王興春等17的數(shù)據(jù)可知這4個樣品的有效讀段分布均勻性較好，表明mRNA是隨機打斷的。綜上所述，這4個樣品測序質(zhì)量較高，可用于下一步差異表達基因的研究。 /cjbcn 2.2 愈傷形成過程差異表達的TF編碼基因 對CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的WS和be1-3 外植體的RNA-Seq數(shù)據(jù)進行差異比較分析，共篩選出1 860個差異表達的基因，其中TF編碼基因為155個，約占總差異表達基因的8.3% (表3)。這155個TF編碼基因中，be1-3外植

29、體中表達量上調(diào)的有97個，表達量下調(diào)的有58個。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這155個轉(zhuǎn)錄因子屬于26個家族，主要涉及激素信號轉(zhuǎn)導、脅迫響應和根毛或側(cè)根的發(fā)生以及生長發(fā)育的調(diào)控等過程24-26。值得一提的是，BE1基因的突變導致ESR2 (AT1G24590) 基因的表達量下降了5.05倍。該基因在不定芽再生過程起著重要的作用11，但對脫分化的影響還需要進一步研究。 表1 樣品be1-CIM7測序讀段與擬南芥參考基因的比對統(tǒng)計結(jié)果 Table 1 Alignment statistics of be1-CIM7 sequencing reads to reference genes in Arabidop

30、sis thaliana Map to gene Reads number Percentage (%)Total mapped 10 898 770 100.00 Perfect match 10 125 443 92.90 2 bp mismatch 6 301 969 57.82 Unique match 3 823 474 35.08 Multi-position match6 507 183 59.71 Total unmapped 3 618 260 33.20 表2 樣品be1-SIM2測序讀段與擬南芥參考基因的比對統(tǒng)計結(jié)果 Table 2 Alignment statistic

31、s of be1-SIM2 sequencing reads to reference genes in Arabidopsis thaliana Map to gene Reads number Percentage (%)Total mapped 9 788 169 100.00 Perfect match 9 104 737 93.02 2 bp mismatch 5 636 215 57.58 Unique match 3 468 522 35.44 Multi-position match5 821 034 59.47 Total unmapped 3 283 703 33.55 圖

32、1 RNA-Seq測序質(zhì)量評估 Fig. 1 RNA-Seq quality assessment. (A, B) Sequencing saturation analysis of be1-CIM7 (A) and be1-SIM2 (B). (C, D) Sequencing randomness analysis of be1-CIM7 (C) and be1-SIM2 (D). 2.3 不定芽再生早期差異表達的TF編碼基因 為了解析不定芽再生早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機 制，我們比較了野生型WS擬南芥外植體從脫分化 (樣品WS-CIM7) 向再分化 (樣品WS-SIM2) 轉(zhuǎn)變過程差異表達的基因。

33、如表4所示，共檢測到231個差異表達的TF編碼基因，其中表達量下調(diào)的為71個，表達量上調(diào)的有160個。值得注意的是，ESR1和RAP2.6L基因的表達量分別上調(diào)了7.59倍和2.25倍，而這兩個基因已經(jīng)被證明是不定芽再生過程的關(guān)鍵基因9,12。除此之外，NAC家族的CUC1 (Cup shaped cotyledon 1) 和CUC2的表達量也大幅上調(diào)，分別上調(diào)了8.94倍和5.09倍，這一結(jié)果與Che等12的研究是一致的。 為了深入了解不定芽再生早期的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制并解析be1-3突變體不定芽再生障礙的原因，我們進一步比較了在SIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的be1-3 (be1-SIM2) 和WS

34、(WS-SIM2) 外植體中差異表達的基因。共檢測到832個差異表達基因，其中68個基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，占8.17% (表5)。這些轉(zhuǎn)錄因子涉及20個家族，其中數(shù)目最多的為NAC家族、ERF家族和WRKY家族，分別為13個、9個和8個 (表5)。 2.4 過量表達ART1基因抑制了不定芽再生 由于擬南芥be1-3突變體中柱鞘發(fā)育異常， 從而導致外植體愈傷組織形成受阻18。我們推測，be1-3外植體愈傷形成缺陷的表型可能與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。為了證實這一推測，并驗 cjb ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2015 Vol.3

35、1 No.4 表3 愈傷形成過程be1-3與WS野生型相比差異表達的TF編碼基因 Table 3 Differential expressed TF encoding genes between be1-3 and WS wild type at callus formation stage Family ARF B3 bHLH bZIP C2H2 Differential expressed/total Down-regulated genes TF genes 1/22 9/66 AT3G61970 AT1G26680 AT4G01580 AT3G11580 AT3G18960 AT1G4

36、9475 AT5G58280 AT2G24700 13/145 AT4G01460 AT3G21330 AT1G71200 AT4G37850 AT4G36930 1/74 AT3G58120 13/100 AT1G03840 AT3G45260 AT1G75710 AT3G20880 Up-regulated genes AT2G33860 AT4G31615 C3H DBB Dof EIL ERF 1/50 1/11 3/36 1/6 25/123 G2-like GATA GRAS HD-ZIP HSF MIKC M-type MYB MYB_ related NAC 3/42 4/30

37、 2/34 4/49 2/24 3/42 2/66 13/144 5/66 19/113 AT3G20640 AT3G07340 AT4G30980 AT3G56770AT5G65320 AT5G43650 AT1G10585 AT4G33880 AT3G19580 AT1G08290 AT2G28200 AT5G25160AT5G03510 AT1G10480 AT1G26590 AT1G27730AT1G68360 AT5G44260 AT2G31380 AT3G50410 AT2G46590 AT1G51700 AT5G21120 AT5G05410 AT1G24590 AT5G6159

38、0 AT1G22190AT4G36900 AT2G46310 AT5G07580 AT5G53290 AT5G61890 AT5G47230 AT5G52020 AT3G11020AT5G51190 AT3G61630 AT3G16770 AT3G50260 AT5G61600 AT1G12610 AT4G34410 AT5G47220AT1G77640 AT1G44830 AT2G44840 AT2G38340 AT1G33760 AT1G68670 AT1G25550 AT1G14600 AT2G45050 AT3G50870 AT2G18380 AT5G26930 AT1G14920 A

39、T3G03450 AT4G17460 AT2G18550 AT3G61890 AT4G17710 AT3G51910 AT2G41690 AT4G11880 AT1G71692 AT4G22950 AT1G18750 AT1G17310 AT3G24310 AT5G57620 AT2G47190 AT1G14350AT2G31180 AT5G67300 AT5G12870 AT4G13480AT5G10280 AT1G06180 AT5G60890 AT4G37780 AT1G08810 AT1G71030 AT5G37260 AT2G46410 AT5G58900 AT3G10590 AT5

40、G39820 AT1G69490 AT1G26870 AT5G39610 AT4G01540 AT1G52880 AT3G12977 AT5G18270AT3G29035 AT1G12260 AT2G18060 AT3G44290 AT5G62380 AT1G28470 AT1G02220 AT1G52890 AT5G64060AT3G01600 AT5G14490 AT1G75430 AT5G11060 AT1G62990 AT5G41410 AT3G27010 AT5G03680 AT5G28300 AT1G20700 AT1G46480 AT5G05770 AT5G64810 AT5G2

41、2570 AT2G40750 AT3G56400AT2G25000 AT1G80840 AT1G69810 AT2G30250 AT4G23810 AT4G22070 AT3G24500 AT3G62100 AT1G15580 AT3G44550 AT2G43060 AT4G32280 AT2G27380 AT2G24340 TALE TCP Trihelix WOX WRKY Others 4/22 1/24 2/28 3/16 10/72 8 /cjbcn 表4 野生型擬南芥外植體從脫分化向再分化轉(zhuǎn)變過程差異表達的TF編碼基因 Table 4 Differential expressed

42、TF encoding genes in wild type between dedifferentiation and redifferentiation stages Differential Family expressed/total Down-regulated genes TF genes AP2 5/22 AT5G10510 AT1G51190 AT5G17430 AT5G10510 ARF B3 bHLH 1/22 4/66 24/145 AT3G61830 AT5G58280 AT5G65320 AT4G37850 AT5G56960 AT2G43140 AT5G15160

43、AT1G74500 AT3G25710 Up-regulated genes AT4G37750 AT2G46870 AT4G31650 AT1G01030 AT1G68810 AT4G29100 AT3G20640 AT2G46510 AT2G24260 AT4G30980 AT1G27660 AT1G32640 AT3G07340 AT1G62975 AT2G22760 AT5G58010 AT1G66470 AT1G27740 AT5G43650 AT2G40200 AT4G21340 AT2G36270 AT1G77920 AT1G49720 AT5G24800 AT1G06850 A

44、T1G13600 AT5G10970 AT2G29660 AT2G28200 AT5G03510 AT2G37430 AT5G59820 AT2G02070 AT1G27730 AT5G57520 AT5G67450 AT3G53600 AT2G40140 AT3G55980 AT5G48250 AT5G24930 AT4G39070 AT2G28510 AT1G51700AT5G60850 AT3G16770 AT5G13330 AT4G17500 AT2G23340 AT4G32800 AT4G17490 AT4G25490 AT3G50260 AT5G47230 AT5G51190 AT

45、1G77640 AT5G47220 AT4G25470 AT3G60490 AT1G12610 AT4G34410 AT5G61600 AT4G25480 AT1G12980 AT1G19210 AT5G25810 AT5G19790 AT5G21960 AT1G74930 AT4G28140 AT2G44840 AT2G40970 AT1G49560 AT1G14600 AT2G40260 AT5G59570 AT2G45050 AT5G59450 AT3G03450 AT4G37790 AT4G40060 AT3G61150 AT3G61890 AT1G69780 AT3G01220 AT

46、1G26960 AT5G03720 AT3G22830 AT4G24540 AT5G57620 AT2G31180 AT2G36890 AT5G10280 AT5G16600 AT5G60890 AT3G12720 AT2G38090 AT1G22640 AT1G57560 AT5G05790 AT3G49690 AT1G34670 AT5G23000 AT3G02940 AT4G05100 AT3G24310 AT1G17950 AT2G16720 AT1G73410 AT1G66230 AT3G61250 AT5G12870 AT3G30210 AT5G14340 bZIP C2H2 6/

47、74 13/100 AT3G20880 AT3G57670 C3H CO-like DBB Dof ERF 2/50 3/17 2/11 5/36 35/123 AT5G57660 AT2G21320 AT3G47500 AT4G00940 AT5G18560 AT4G11140 AT1G24590 AT4G23750 AT5G07310 AT3G23240 AT1G75490 AT1G36060 AT3G61630 G2-like GATA GRAS HD-ZIP HSF MIKC M-type MYB 6/42 3/30 3/34 13/49 3/24 3/42 1/66 32/144 A

48、T5G42630 AT3G50870 AT2G18380 AT3G54220 AT4G21750 AT4G17460 AT5G66700 AT4G04890 AT1G17920 AT2G01430 AT3G51910 AT3G02310 AT2G45660 AT1G17310 AT3G62610 AT1G14350 AT1G14350 AT1G48000 AT2G02820 AT3G47600 AT4G34990 cjb ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2015 Vol.31 No.4 MYB_ related NAC

49、5/66 23/113 AT3G09600 AT1G71030 AT3G15510 AT1G52880 AT1G26870 AT5G39610 AT1G54330 AT5G14000 AT5G37260 AT5G58900 AT3G10590 續(xù)表4 SBP TALE TCP Trihelix WOX WRKY ZF-HD others 1/17 5/22 1/24 1/28 2/16 8/72 2/17 19 AT3G11260 AT4G27310 AT5G54470 AT4G15248 AT2G46990 AT3G15540 AT3G62100 AT3G24500 AT5G22500 AT

50、1G20065 AT4G23800 AT2G07677 AT5G24120 AT1G01010 AT4G29230 AT5G13180 AT3G12977 AT1G77450 AT4G28500 AT1G28470 AT5G53950 AT1G62700 AT2G43000 AT5G64530 AT4G10350 AT3G15170 AT1G12260 AT1G71930 AT5G62380 AT1G02250 AT2G42200 AT5G11060 AT2G16400 AT1G62990 AT5G02030 AT4G32980 AT5G23280 AT5G03680 AT1G46480 AT

51、3G56400 AT2G25000 AT2G38470 AT4G23810 AT4G18170 AT1G80840 AT5G24110 AT5G41570 AT1G69600 AT1G75240 AT2G36740 AT1G51950 AT4G28490 AT1G04240 AT1G04250 AT5G25890 AT3G44550 證所篩選轉(zhuǎn)錄因子的真實性，我們從表3中選取了一個MYB-related家族的AT3G10590基因進行了深入研究。該基因在be1-3突變體和野生型外植體中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)分別為13和0，RPKM值分別為3.217和0.001，表達量上升了3 217倍，是所有基因中上調(diào)倍

52、數(shù)最大的一個，故將其命名為ART1 (Adventious shoot related transcription factor 1) 基因。此外，我們從NASC獲得了ART1基因的兩個雌激素誘導過量表達的轉(zhuǎn)基因株系 TPT_3.10590.1F 和 TPT_3.10590.1I。由于TPT_3.10590.1F和TPT_3.10590.1I在所有的實驗中表型類似，只是TPT_3.10590.1I的表型比TPT_3.10590.1F的更強，因此在本文僅給出TPT_3.10590.1I的結(jié)果，并將其命名為ART1OE (ART1 overexpression)。 為闡明ART1在不定芽再生過程的

53、作用，分別將ART1OE和Col-0野生型的下胚軸培養(yǎng)在0和10 mol/L雌二醇的CIM培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d 后，無論是在0還是10 mol/L雌二醇CIM培養(yǎng)基上培養(yǎng)的Col-0野生型下胚軸頂端和中柱都已經(jīng)膨大形成愈傷組織，且二者無明顯差異 (圖2A和2B)，表明雌二醇對愈傷的形成無顯著影響。與野生型類似，無雌二醇CIM上培養(yǎng)的ART1OE外植體頂端因形成大量愈傷而膨大成球狀 (圖2C)，而雌二醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體頂端僅稍微變粗 (圖2D)。類似的，ART1OE外植體中柱鞘部位在無雌二醇時膨大形成了突起 (圖2E)，而在雌二醇培養(yǎng)基上的則無明顯變化 (圖2F)。然后，將無雌二醇CIM培養(yǎng)

54、的外植體分別轉(zhuǎn)到0和10 mol/L雌二醇的SIM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。14 d后，無論是否有雌二醇，野生型外植體都可以分化出綠芽 (圖2G和2H)，但ART1OE僅在無雌二醇的培養(yǎng)基上能分化出綠芽，在雌二醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)時僅有少數(shù)綠點 (圖2I和2J)。這表明，ART1基因是愈傷形成和不定芽再生過程的一個負調(diào)控因子。 /cjbcn 表5 不定芽再生早期be1-3中差異表達的TF編碼基因 Table 5 Differential expressed TF encoding genes in be1-3 at the early stage of adventious shoot formation F

55、amily AP2 ARF B3 bHLH bZIP C2H2 CO-like Dof ERF G2-like GATA GRAS HD-ZIP MIKC MYB MYB_ related NAC Differential expressed/total TF genes 1/22 1/22 5/66 2/145 1/74 3/100 1/17 2/36 9/123 1/42 1/30 1/34 4/49 2/42 6/144 1/66 13/113 Down-regulated genes AT3G20840 AT1G26680 AT1G01030 AT3G61970 AT3G18960 A

56、T1G74500 AT1G66470 AT3G58120 AT1G75710 AT1G25440 AT1G28310 AT1G77640 AT4G27950 AT1G14600 AT2G45050 AT3G03450 AT4G17460 AT4G11880 AT1G49010 AT3G12820 AT5G10280 AT3G16350 AT1G33280 AT4G10350 AT5G39820 AT1G26870 AT4G32980 AT2G18350 AT2G33860 AT4G31615 AT5G22890 AT3G46080 AT4G00940 AT3G11020 AT2G46310 A

57、T1G12980 AT5G18560AT3G61630 AT2G38340 AT1G74930 AT5G52170 AT2G46680 AT4G17710 AT5G20240 AT1G34670 AT1G48000 AT4G37780 AT3G04060 AT2G18060 AT5G64060 AT1G02250AT3G01600 AT3G15510 AT1G02230 AT1G02220AT5G14490 AT2G40750 AT5G13080 AT5G64810 AT2G30250AT5G22570 AT1G66600 AT5G01900 AT2G21900 AT3G15540 AT3G4

58、4550 AT2G21650 AT3G24500 Up-regulated genes TALE WRKY ZF-HD Others 1/22 8/72 1/17 4 2.5 過量表達ART1基因抑制了幼苗的生長發(fā)育 上述結(jié)果是在離體條件下獲得的，為解析 ART1基因在幼苗生長和發(fā)育中作用，將ART1OE播種在不同濃度的17 -雌二醇培養(yǎng)基上。結(jié)果表明，在無誘導劑的培養(yǎng)基上，ART1OE幼苗生長發(fā)育完全正常 (圖3A)，然而在雌激素 培養(yǎng)基上，幼苗生長發(fā)育緩慢，根系變短 (圖3B3F)。而且誘導劑的濃度越高，這種表型也越嚴重 (圖3B3F)。在10 mol/L 17 -雌二醇培養(yǎng)基上，ART1

59、OE的主根不能伸長，而且長出大量毛狀根系 (圖3E和3F)。這表明，ART1基因在植物生長發(fā)育和離體器官再生過程都起著重要的作用。 cjb ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2015 Vol.31 No.4 圖2 過量表達ART1基因抑制了不定芽再生 Fig. 2 Overexpression of ART1 inhibits adventious shoot regeneration. (AF) Hypocotyl segments of wildtype (A and B) and ART1OE (CF) cultured for 7 d on CIM containing 0 (A, C and E) or 10 (B, D and F) mol/L estradiol. The top (AD) or the middle (E and F) hypocotyl segments were photographed with a Olympus BX51 microscopy. (GJ) Hypocotyl segments of wildtype (G and H) and ART1OE (IJ) were cultured for 14 d on SIM containing 0 (G and I