人工低密度脂蛋白與紫杉醇油酸為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向藥物遞送載體

1、Z HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/journal/01683659 o 走在ScienceDirect上控釋期刊 雜志控釋 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/journal/01683659/124/3 o 轉(zhuǎn)到表的內(nèi)容，此卷/問題 124卷，第3期2007年12月20日，頁(yè)163-171合成納米低密度脂蛋白與紫杉醇油酸為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤靶向藥物遞送載體摘要低密度脂蛋白（LDL）受體已顯示在GBM腫瘤細(xì)胞中上調(diào)體外，因而對(duì)治療劑的遞送的潛在分子靶標(biāo)。一種合成納米LDL（nLDL）粒子是作為通過將親脂性前體藥

2、物，紫杉醇油酸鹽，進(jìn)入粒子靶向GBM細(xì)胞的藥物遞送載體。含紫杉醇油酸酯（nLDL-PO）納米LDL是通過將包含脂質(zhì)結(jié)合基序和低密度脂蛋白受體（LDLR）結(jié)合載脂蛋白B-100的結(jié)構(gòu)域，其包括磷脂酰膽堿，甘油三油酸酯，和紫杉醇的脂質(zhì)乳劑的合成肽構(gòu)建油酸。紫杉醇油酸鹽摻入脂質(zhì)顆粒的核心。nLDL-PO細(xì)胞存活在GBM細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)是時(shí)間，濃度和細(xì)胞系依賴。細(xì)胞殺傷觀察短的藥物孵化，并在6小時(shí)表現(xiàn)出飽和。在LDL受體抑制劑，蘇拉明的存在nLDL-PO細(xì)胞存活的提高，這表明該藥物是通過LDL受體傳遞?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)有力地表明，在合成的納米LDL中可以將親脂性藥物，并且能夠殺死GBM細(xì)胞。nLDL-

3、PO具有作為一種選擇性藥物遞送載體用于通過LDL受體靶向GBM腫瘤的潛力。關(guān)鍵詞低密度脂蛋白;膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;紫杉醇;低密度脂蛋白受體;脂肪乳劑1。介紹膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的是，占近40的原發(fā)性腦腫瘤在成人高度侵略性的惡性腫瘤 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib1 1。傳統(tǒng)的治療包括手術(shù)后放療和化療有成效有限，中位生存時(shí)間為確診大約為1年。尤其是全身化療交付提供了基本福利到GBM患者，其效用受到質(zhì)疑 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/ar

4、ticle/pii/S016836590700497X l bib2 2。藥物可施用于患者的量是由高的全身毒性和眾多的副作用的限制。一種用于規(guī)避與化療相關(guān)的毒性是開發(fā)車輛的選擇性靶向上調(diào)腫瘤細(xì)胞上的細(xì)胞受體 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib3 3。這樣的靶向藥物遞送載體必須提供高劑量的藥物的腫瘤，同時(shí)保留周圍的健康組織的潛力。七GBM細(xì)胞系的研究顯示，這些細(xì)胞已上調(diào)低密度脂蛋白受體（LDLR）s和128,000與950,000與不同的受體每個(gè)細(xì)胞的受體的數(shù)量 HYPERLINK

5、http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib4 4。研究LDLR的正常大鼠和猴腦組織中的分布表明，正常腦組織，尤其是神經(jīng)元，具有相對(duì)低的LDLR數(shù)量 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib5 5。如此看來，該低密度脂蛋白受體是選擇性遞送的抗腫瘤化合物的GBM一個(gè)潛在的分子靶標(biāo)。有人曾建議血漿衍生的LDL，對(duì)于LDLR的主要配體，可作為藥物遞送系統(tǒng)的腫瘤表達(dá)LDLR HYPERLINK http:/www

6、.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib6 6和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib7 7。LDL是一種疏水性的脂質(zhì)，主要是膽甾醇酯與少量的三酸甘油酯，它可用于親脂性藥物摻入的芯組成的22-27納米的顆粒。表面由磷脂，未酯化膽固醇和載脂蛋白B-100（載脂蛋白B）的一個(gè)分子的 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X

7、l bib8 8。載脂蛋白B是550000沓糖蛋白具有9個(gè)氨基酸（殘基3359-3367），其作為用于LDL受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib9 10。結(jié)合后在網(wǎng)格蛋白小窩的低密度脂蛋白受體，LDL是通過細(xì)胞內(nèi)吞作用和動(dòng)作內(nèi)化入其中pH值下降會(huì)導(dǎo)致受體的LDL解離核內(nèi)體。該受體被再循環(huán)回到細(xì)胞表面，而LDL被移動(dòng)到那里的粒子被降解溶酶體 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700

8、497X l bib10 10。在以前的研究中，抗癌藥物已被直接地加載到血漿LDL HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib11 11或LDL的脂質(zhì)核心分別代替藥物 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib12 12， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib13 13， H

9、YPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib14 14， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib15 15， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib16 16， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836

10、590700497X l bib17 17， 18和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib19 19。天然LDL，雖然是不太理想的作為靶向劑，因?yàn)樗请y以大量地分離，并且是可變的成分和尺寸。另一種方法中使用的重構(gòu)的LDL由含藥物的穩(wěn)定的脂質(zhì)乳劑的純化載脂蛋白B HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib20 20， HYPERLINK http:/www.sciencedir/s

11、cience/article/pii/S016836590700497X l bib21 21， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib22 22和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib23 23。的載脂蛋白B蛋白，然而，是難以分離，由于其大尺寸和聚集傾向，因此不用于產(chǎn)生重組的LDL的大批量有用。最近的研究表明創(chuàng)建一個(gè)合成的LDL顆粒的可行性。兩個(gè)這樣的研究，開發(fā)了一種合成的

12、LDL顆粒作為替換為血清中的細(xì)胞培養(yǎng)基用脂質(zhì)乳劑和載脂蛋白B的低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的肽 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib24 24和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib25 25。這種合成的顆粒能夠通過經(jīng)LDL受體交付膽固醇的細(xì)胞，支持細(xì)胞生長(zhǎng)。在另一種方法中，我們最近描述的合成納米顆粒的LDL（nLDL），作為治療GBM一個(gè)潛在的藥物遞送載體 HYPERL

13、INK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26。該nLDL是由脂肪乳劑和一種獨(dú)特的雙功能肽，其包含脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和9個(gè)氨基酸的LDLR結(jié)合結(jié)構(gòu)域。我們的新nLDL模仿的血漿提取低密度脂蛋白的行為，并能針對(duì)低密度脂蛋白受體的GBM細(xì)胞的。該顆粒的脂質(zhì)核心有把親脂性的細(xì)胞毒性藥物的潛力，但是這尚未得到證實(shí)。本研究的目的是要表明，我們的合成nLDL可以在文化傳遞的親脂毒性抗癌藥物的有效載荷，以GBM細(xì)胞。紫杉醇的親脂性衍生物，紫杉醇油酸酯（PO） HYPERLINK http:/www.science

14、dir/science/article/pii/S016836590700497X l bib27 27，被用來作為一個(gè)試驗(yàn)藥物。這樣的前藥通過破壞所需的細(xì)胞分裂的正常微管動(dòng)力學(xué)導(dǎo)致細(xì)胞死亡 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib28 28。我們表明，合成的納米LDL裝載紫杉醇油酸酯（nLDL-PO）進(jìn)入細(xì)胞通過低密度脂蛋白受體，并能夠在培養(yǎng)殺死GBM細(xì)胞。2。材料和方法2.1。物料三油精（TO），膽甾醇油酸酯（CO），紫杉醇，油酰氯，乙腈，三氟乙酸（TFA），丁基化羥基甲苯（BHT）

15、，和1無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Sigma公司。最小必需培養(yǎng)基（MEM），胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶-EDTA是從加州大學(xué)舊金山分校細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備獲得的。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）購(gòu)自Invitrogen公司獲得的。蘇拉明從AXXORA，LLC（圣地亞哥，CA）獲得。蛋黃磷脂酰膽堿（PC）中的自Avanti極性脂質(zhì)獲得的。脂蛋白缺乏血清（LPDS）從Intracel（弗雷德里克，MD）獲得。用于生產(chǎn)nLDL-PO的29個(gè)氨基酸的肽被前面描述的 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S01683659

16、0700497X l bib26 26和肽從生物合成公司（路易斯維爾，TX）獲得的在大于95的純度通過HPLC分析測(cè)定的。2.2。紫杉醇油酸酯的合成紫杉酚（100毫克，0.117毫摩爾）加入到10 mL的火焰干燥的圓底燒瓶中，并在惰性氣氛（氬氣）下放置。干燥氯仿溶液中加入（1毫升），并將反應(yīng)冷卻至0。幾分鐘后1.3當(dāng)量的油酰氯（50.3微升，0.152毫摩爾），接著加入三乙胺（20.8微升，0.152毫摩爾）。將反應(yīng)維持在015分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝?。在室溫?小時(shí)后，將反應(yīng)混合物稀釋，用5毫升氯仿中，將有機(jī)層依次用10碳酸氫鈉水溶液（5mL）中。除去有機(jī)層，水層用氯仿（25毫升）萃取兩次。將合

17、并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾并除去溶劑。將粗殘余物溶解于250L的1甲醇/氯仿，并使用由100毫升1甲醇/氯仿，100mL的梯度溶劑系統(tǒng)通過快速柱色譜（硅膠25g，用Whatman 60埃,230-400目）進(jìn)行純化1.5甲醇/氯仿和最后2甲醇/氯仿，直到完全洗脫產(chǎn)物。鑒定通過薄層色譜級(jí)分含有紫杉醇油酸鹽（RF 0.37，3甲醇/氯仿，玻璃背硅膠板Analtech Uniplate鋼板，250微米厚，5厘米10厘米，4mm時(shí)，熒光指示劑254nm的用UV ）并合并，得到119毫克無色泡沫（91收率），將其在使用前在真空下徹底干燥。該產(chǎn)物的身份通過在Bruker的Avance 300 MHz核磁

18、共振儀（加州大學(xué)伯克利分校）核磁共振和通過在Finnigan LCQ雙核儀器質(zhì)譜驗(yàn)證。2.3。藥物定量反相高效液相色譜法（HPLC）協(xié)議的開發(fā)是為了量化紫杉醇和紫杉醇油酸鹽中的乳劑和合成納米LDL。樣品上附著在Perkin Elmer 200系列高效液相色譜機(jī)器和吸光度月神5C-18分析柱（2504.6毫米的Phenomenex）執(zhí)行讀取227納米（珀金埃爾默200系列紫外/可見光檢測(cè)器）。紫杉醇油酸鹽洗脫含0.05TFA的乙腈以1.0毫升/分鐘的流速，并且具有約11分鐘的柱保留時(shí)間。紫杉醇，另一方面，洗脫用0.05TFA的50:50的乙腈 - 水，以0.5毫升/分鐘的流速，并且具有約25分鐘

19、的柱保留時(shí)間。峰下面積采用數(shù)值積分（辛普森法則）計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用溶解在甲醇中已知量的紫杉醇和紫杉醇油酸鹽的開發(fā)。2.4。生產(chǎn)合成納米低密度脂蛋白與紫杉醇油酸（nLDL-PO）脂肪乳劑形成如前所述 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26。乳液包括PC和在3:2的摩爾比（PC：11.25毫克，TO：8.73毫克）。紫杉醇油酸鹽溶解在甲醇中，并添加到初始的脂質(zhì)混合物。脂質(zhì)和藥物進(jìn)行了氮?dú)庀赂稍?。tris-鹽水緩沖液（6毫升，20毫摩爾Tris，pH 7.2）中導(dǎo)入干燥的脂類和藥

20、物，并且然后將溶液旋渦處理在低設(shè)置1分鐘。將該溶液超聲處理（布蘭森洗凈器，索尼）為35分鐘，在設(shè)定3，在冰上，以破壞較大的脂質(zhì)復(fù)合物。超聲處理的顆粒進(jìn)行紡絲，20分鐘，以3000rpm的轉(zhuǎn)速，以除去顆粒和未結(jié)合的藥物。使用如前面所描述的阿凡提極性脂質(zhì)擠出脂質(zhì)乳劑擠出 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26和最終的乳液過濾通過0.22微米過濾滅菌。乳液與藥物結(jié)合在2.15微米（1.27毫克/毫升）的合成肽。將混合物輕輕渦旋混合1分鐘，然后孵育30分鐘，在室溫下進(jìn)行。未結(jié)合的肽除

21、去透析的Tris-生理鹽水緩沖液，在4，在24小時(shí)的時(shí)間間隔兩個(gè)變化。2.5。組成和顆粒大小粒子的脂質(zhì)成分，使用從光（里士滿，弗吉尼亞州）的酶比色測(cè) 定法測(cè)定甘油三酯和磷脂。蛋白定量的馬克韋爾方法 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib29 29。紫杉醇油酸鹽和紫杉醇濃度通過如上所述的反相HPLC測(cè)定。nLDL-PO來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的組合物進(jìn)行了測(cè)定脂質(zhì)和蛋白組成的可重復(fù)性。顆粒的大小由負(fù)染色電子顯微鏡如前所述測(cè)定 HYPERLINK http:/www.sciencedir/scie

22、nce/article/pii/S016836590700497X l bib30 30。2.6。細(xì)胞培養(yǎng)HeLa細(xì)胞得自ATCC并培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液含10FBS（37，5CO2）。GBM細(xì)胞系（SF-767，U-251，SF-763）是從腦腫瘤研究中心（加州大學(xué)舊金山分校，加利福尼亞州）的組織庫(kù)取得及所描述的卡拉漢生長(zhǎng)本質(zhì) HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib11 11在老鷹的最低必需培養(yǎng)基（MEM）的補(bǔ)充有1非必需氨基酸，1g / L的葡萄糖，0.292克/ L谷氨酰胺，2.2

23、 g / L的碳酸氫鈉和10胎牛血清。2.7。熒光顯微鏡為研究確定的攝取熒光標(biāo)記的顆粒，細(xì)胞鋪板在5104，每孔的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)室康II，2 -孔室玻片。允許細(xì)胞脂蛋白缺乏的胎牛血清（LPDS）在上述MEM被放置于細(xì)胞之前生長(zhǎng)48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)是成倍增長(zhǎng)的細(xì)胞，在大約70匯合，除了LPDS媒體24 h后進(jìn)行的。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞用PBS含1無脂肪酸BSA洗滌兩次。細(xì)胞固定在PBS中的4多聚甲醛中15分鐘，在室溫下PBS中漂洗后。熒光顯微鏡進(jìn)行了使用蔡司200M AXIOVERT光學(xué)顯微鏡。數(shù)字圖像被捕獲的圖像專業(yè)軟件。熒光圖像在40的放大倍率獲得的。2.8。直接成像顯微鏡之前和之后添加nLDL-

24、PO的活細(xì)胞上觀察蔡司200M AXIOVERT光學(xué)顯微鏡。數(shù)字圖像被捕獲的圖像專業(yè)軟件。2.9。nLDL-PO毒性的測(cè)定以確定細(xì)胞毒性暴露于nLDL-PO，將細(xì)胞在96孔板（Nunc公司）的200L的媒體鋪板于2500個(gè)細(xì)胞/孔。允許細(xì)胞脂蛋白缺乏的胎牛血清（LPDS）在上述MEM或DMEM被放置于細(xì)胞之前生長(zhǎng)48小時(shí)。實(shí)驗(yàn)是指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞中，在大約40匯合時(shí)，除了LPDS媒體的24小時(shí)后進(jìn)行了。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)基從細(xì)胞中除去和新鮮的培養(yǎng)基100L的比例添加。該CellTiter96非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定法（Promega）中，使用根據(jù)制造商的指示來量化細(xì)胞的存活。吸光度在同一天被讀取

25、570 nm處的分子器件光譜最大340酶標(biāo)儀。為了確定的細(xì)胞存活，吸光度值標(biāo)準(zhǔn)化抵銷收到的Tris-緩沖鹽水同等音量控制井。細(xì)胞存活的作圖（-軸）對(duì)藥物濃度（x軸，對(duì)數(shù)的底數(shù)2級(jí)）。在IC50，這是為了殺死半數(shù)細(xì)胞所需的濃度，進(jìn)行測(cè)定。2.10。統(tǒng)計(jì)學(xué)生的噸檢驗(yàn)（雙尾）用于測(cè)定IC之間顯著差異50或在實(shí)驗(yàn)藥物濃度。P-值小于0.05被認(rèn)為是顯著。3。結(jié)果3.1。nLDL-PO表征我們以前表明，合成的納米LDL配制的磷脂酰膽堿的摩爾比（PC）：三油酸甘油酯（TO）：（CO）3點(diǎn)02分01秒的膽固醇油酸酯包含在最終只有一小部分的CO（3）產(chǎn)品 HYPERLINK http:/www.science

26、dir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26。因此，我們測(cè)試了CO在乳劑是否有必要為PO摻入nLDL，發(fā)現(xiàn)CO的存在或不存在對(duì)PO結(jié)合（數(shù)據(jù)未顯示）沒有影響。因此，膽固醇油酸酯被排除在今后所有的乳液配方。以確定最佳的藥物濃度對(duì)于生產(chǎn)含藥乳液，PO加入到初始的脂質(zhì)混合物（PC：TO，3:2）在不同濃度（0.083-0.67毫克/毫升）和PO的摻入量為量化，如圖 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig1 所示。1A。紫杉醇油酸摻入

27、出現(xiàn)飽和周圍0.33毫克/毫升PO它產(chǎn)生的PO 48.56.5，回收率在最后的乳液，所有進(jìn)一步的研究進(jìn)行了在這個(gè)PO濃度。在乳劑的制造中，觀察并溶解在甲醇中在玻璃上超聲處理管的壁中的殘基。甲醇的樣品通過HPLC運(yùn)行和PO的量進(jìn)行定量。它被確定PO沒有結(jié)合到乳液中已經(jīng)吸附在玻璃上。以確定是否有在PO與非衍生紫杉醇的摻入有差別，乳液與任何紫杉醇或紫杉醇油酸等摩爾量進(jìn)行。紫杉醇油酸鹽示范顯著更大的摻入比紫杉醇（脂質(zhì)乳劑P= 0.004）。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig1 圖。1乙演

28、示中摻入紫杉醇油酸鹽相比，紫杉醇與紫杉醇的衍生化的增加的親脂相一致的4倍增加。圖。1。紫杉醇油酸納入脂肪乳劑。a）注冊(cè)成立的PO在一個(gè)范圍0.083-0.67毫克/毫升到乳液;飽和度約發(fā)生0.33毫克/毫升的采購(gòu)訂單。B）紫杉醇與紫杉醇為油酸脂乳液的摻入，PO的初始金額為0.3毫米。藥品注冊(cè)成立肽結(jié)合的C）的影響; 2.15微米（1.27毫克/毫升）肽使用。肽對(duì)PO注冊(cè)成立四）影響。紫杉醇油酸鹽和紫杉醇濃度通過反相HPLC定量。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)單獨(dú)生產(chǎn)的乳液的平均值SD。的水平欄表示由發(fā)現(xiàn)顯著差異噸測(cè)試。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/arti

29、cle/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)該nLDL-PO的最終制劑（重量）為：肽，286，PC，402;于，267;和PO，61（= 3）。以確定是否PO的存在改變了肽結(jié)合到乳液中，乳液具有和不具有PO的肽含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。如見于 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig1 圖。1C，PO的存在不影響該肽結(jié)合到乳液的能力。另外，通過添加肽含有PO乳劑沒有顯著影響乳液（中的藥物含量 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/

30、pii/S016836590700497X l fig1 圖1D）。總而言之，這些結(jié)果表明，PO結(jié)合到顆粒的核心。該nLDL-PO顆粒電子顯微鏡顯示，他們主要是圓形，8-15納米直徑的顆粒。3.2。nLDL-PO在SF-767細(xì)胞攝取之前我們已經(jīng)表明，如果沒有藥物的合成nLDL由GBM細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)化 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26。要驗(yàn)證加載nLDL與PO不會(huì)改變粒子的吸收，F(xiàn)ITC標(biāo)記的nLDL-PO顆粒培養(yǎng)與SF-767 GBM細(xì)胞系在37前3小時(shí)（1.5微米肽在2

31、00微升的媒體）熒光顯微鏡。如見于 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig2 圖。2A，F(xiàn)ITC標(biāo)記的nLDL-PO是由SF-767細(xì)胞內(nèi)化。圖。2。的nLDL-PO和細(xì)胞殺傷通過nLDL-PO細(xì)胞攝取。A）FITC標(biāo)記nLDL-PO的細(xì)胞攝取的代表圖像。左：細(xì)胞的明場(chǎng)圖像，中東：通訊FITC標(biāo)記nLDL（1.5微米肽），右的熒光圖像：FITC標(biāo)記的肽相應(yīng)的熒光圖像與細(xì)胞核用DAPI染色合并。B）在nLDL-PO細(xì)胞殺傷HeLa細(xì)胞。該IC50為6.5微米（24小時(shí)）和0.7微米（72

32、小時(shí)）為nLDL-PO。C）細(xì)胞由nLDL-PO殺SF-767細(xì)胞。該IC50為7.9微米（24小時(shí)）和3.6微米（72小時(shí)）為nLDL-PO。數(shù)據(jù)代表了三個(gè)不同的孔的平均值標(biāo)準(zhǔn)差。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)與單獨(dú)導(dǎo)出nLDL-PO，取得了類似的結(jié)果。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)3.3。與HeLa細(xì)胞和SF-767細(xì)胞的毒性研究以前的工作由Lundberg等人 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S01683659070049

33、7X l bib27 27表明，裝有油酸紫杉醇脂質(zhì)乳劑能有效殺滅HeLa細(xì)胞培養(yǎng)。我們利用這些細(xì)胞，與GBM細(xì)胞系SF-767一起，以確定合成納米低密度脂蛋白裝有PO是否可以殺死細(xì)胞的培養(yǎng)。在 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig2 圖2B-C，這兩個(gè)細(xì)胞系暴露于用于評(píng)估可達(dá)72小時(shí)，細(xì)胞存活的范圍PO（0.63-20微米）的。很明顯，細(xì)胞殺傷與nLDL-PO是時(shí)間和濃度依賴性，其中72小時(shí)暴露是顯著大于在每一種情況下24小時(shí)。在72小時(shí)后，將集成電路50對(duì)HeLa細(xì)胞為0.7M相比

34、，3.6M為SF-767細(xì)胞。在兩種細(xì)胞系中，nLDL-PO證明顯著更大的細(xì)胞殺傷作用比單獨(dú)PO。這些結(jié)果表明，nLDL-PO可以殺死細(xì)胞，并比單獨(dú)的藥物更有效。要驗(yàn)證細(xì)胞的殺傷，而不是細(xì)胞的生長(zhǎng)遲緩，發(fā)生，直接圖像顯微鏡使用（ HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig3 圖3）。引入nLDL-PO之前，健康SF-767細(xì)胞被看作簇梭形細(xì)胞（ HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fi

35、g3 圖3中的A）。溫育不含藥物72小時(shí)的對(duì)照細(xì)胞顯示細(xì)胞表示細(xì)胞的持續(xù)增長(zhǎng)（的緊密堆積的單層 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig3 圖3的B）。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig3 圖。3一個(gè)72小時(shí)的溫育與nLDL-PO（20M和5M的PO，分別）之后的C-D顯示細(xì)胞。在藥物濃度較高時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞都死了，而在低濃度少數(shù)細(xì)胞似乎都活了下來。孵育單獨(dú)紫杉醇油酸酯（

36、5M）或nLDL無藥物（8M肽）72小時(shí)額外的細(xì)胞，表現(xiàn)出細(xì)胞的緊密堆積的單層（數(shù)據(jù)未示出），類似于對(duì)照細(xì)胞沒有藥物。圖。3。SF-767細(xì)胞的前孵育nLDL-PO后直接圖像照片。細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中孵育nLDL-PO之前72小時(shí)。A）緊接孵化與藥物細(xì)胞，B）在沒有nLDL-PO的72小時(shí)生長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞融合。C）細(xì)胞后72 h后用20微米nLDL-PO，只有小圓形死細(xì)胞均可見，D）細(xì)胞后72 h后用5微米nLDL-PO。細(xì)胞的數(shù)量被大大減少相比，“B”和只有少數(shù)細(xì)胞似乎是可行的。圖片拍攝于一個(gè)10的放大倍率。在右下角欄標(biāo)記表示約110微米。 HYPERLINK http:/www.scien

37、cedir/science/article/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)為了模仿臨床藥代動(dòng)力學(xué)，用快速藥物消除，將細(xì)胞脈沖孵育nLDL-PO為1，3，6，12，24，或72小時(shí)之后，洗滌細(xì)胞并培養(yǎng)在無藥物培養(yǎng)基中的72小時(shí)總孵化時(shí)間。集成電路50（ HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig4 圖4）減少為培養(yǎng)時(shí)間與nLDL-PO增加，但是6和12小時(shí)（集成電路之間的相同5010M）。IC5012小時(shí)和24小時(shí)之間的降低，但為24和72小時(shí)之間是相同的（IC503M）

38、。在IC初始高原50于12小時(shí)顯示飽和度在藥物的吸收，這是受體介導(dǎo)的攝取低密度脂蛋白受體的特征。所有其他的細(xì)胞進(jìn)行了研究，用更短的孵育時(shí)間與nLDL-PO（即3小時(shí)或6小時(shí)）。圖。4。時(shí)間和濃度對(duì)SF-767細(xì)胞殺傷通過nLDL-PO的影響。細(xì)胞暴露于nLDL-PO（0.08-20微米的藥物）的時(shí)間（1，3，6，12，24，72 h）本nLDL-PO被刪除后，沒有藥物的新鮮培養(yǎng)基可變長(zhǎng)度，加入細(xì)胞對(duì)于一個(gè)72小時(shí)總孵化。該nLDL-PO濃度在其中50的細(xì)胞存活觀察（IC50值）分別為：20M（1小時(shí)），13.3M（3小時(shí)），9.9M（6小時(shí)），9.8M（12小時(shí)），3.5M （24小時(shí)），和3

39、.4M（72小時(shí)）。數(shù)據(jù)代表在同一試驗(yàn)內(nèi)三次重復(fù)的平均值標(biāo)準(zhǔn)差。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)與單獨(dú)衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的結(jié)果。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)3.4。nLDL-PO需要攝取低密度脂蛋白受體我們先前的研究顯示 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26認(rèn)為nLDL攝取阻斷低密度脂蛋白受體抑制劑，蘇拉明 HYPERLINK http:/www.science

40、dir/science/article/pii/S016836590700497X l bib31 31。以證明通過LDLR發(fā)生的藥物遞送，細(xì)胞用10MnLDL-PO加蘇拉明（10毫米），用于除去后兩種化合物和新鮮培養(yǎng)基而不nLDL-PO和抑制劑溶液中加入額外69 H 3小時(shí)潛伏期（共72個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)）。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l fig5 圖。5表明，細(xì)胞殺死了顯著（P= 0.001），效率較低（51存活），當(dāng)LDLR被阻斷與蘇拉明相比無蘇拉明（12存活）的控制。后者的支持，該

41、藥物通過低密度脂蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞的前提。圖。5。蘇拉明對(duì)nLDL-PO細(xì)胞殺傷效率的影響。nLDL-PO（10M）加入到SF-767細(xì)胞有和沒有10mM的蘇拉明3小時(shí)的nLDL-PO和蘇拉明除去之后;新鮮培養(yǎng)基而不藥物加入到細(xì)胞中的72小時(shí)總孵化。數(shù)據(jù)代表了三個(gè)不同的孔的平均值標(biāo)準(zhǔn)差。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)與單獨(dú)衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的結(jié)果。的水平欄表示由發(fā)現(xiàn)顯著差異噸測(cè)試。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)3.5。細(xì)胞的存活與SF-767，SF-763和U-251細(xì)胞的比較這是以

42、前觀察到不同的GBM細(xì)胞系中有每個(gè)細(xì)胞LDL受體的數(shù)量可變的 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib4 4。為了確定細(xì)胞受體數(shù)量是否會(huì)影響細(xì)胞的殺傷通過nLDL-PO，三GBM細(xì)胞系SF-763，SF-767和U-251細(xì)胞有950,000，288,000，128,000和每個(gè)受體細(xì)胞，分別進(jìn)行了檢查。細(xì)胞與不同濃度的藥物（0.08-20微米）的用于除去藥物后6小時(shí)和新鮮的培養(yǎng)基沒有藥物溶液中加入66小時(shí)溫育（72小時(shí)總孵化）。 HYPERLINK http:/www.scienced

43、ir/science/article/pii/S016836590700497X l fig6 圖。6表明，在IC50值分別為：SF-763，2.2微米，SF-767，7.5微米，和U-251，6.9微米。有顯著差異（P0.05）之間的IC50相比，SF-767和U-251細(xì)胞其中SF-763細(xì)胞更敏感的藥物為SF-763。在IC之間未觀察到細(xì)胞的殺傷無差異50SF-767和U-251細(xì)胞。圖。6。（：，：288,000，和U-251：128,000感受器每個(gè)細(xì)胞SF-767 950,000 SF-763）nLDL-PO對(duì)表達(dá)不同的低密度脂蛋白受體數(shù)目3 GBM細(xì)胞株存活率的影響。細(xì)胞與nLD

44、L-PO為除去nLDL-PO后6小時(shí)和新鮮培養(yǎng)基而不藥物加入到細(xì)胞中的72小時(shí)總孵化。數(shù)據(jù)代表了三個(gè)不同的孔的平均值標(biāo)準(zhǔn)差。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)與單獨(dú)衍生批次nLDL-PO，并且得到相似的結(jié)果。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X 圖選項(xiàng)4。討論高級(jí)別膠質(zhì)瘤難以治療，因?yàn)樗麄兂砷L(zhǎng)積極和細(xì)胞胰島經(jīng)常保持腫瘤手術(shù)切除后。這些殘余細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。近年來，重點(diǎn)用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤，以及其他類型的腫瘤，已經(jīng)成為特定分子靶的鑒定用于藥物遞送。這樣的分子靶點(diǎn)可以最大限度地減少對(duì)周圍正常組織的毒性作用。表皮生長(zhǎng)因子受體

45、 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib32 32，血小板衍生生長(zhǎng)因子受體 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib33 33，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib34 34，人類表皮受體2型 HYPERLINK http:/www.scienc

46、edir/science/article/pii/S016836590700497X l bib35 35，和白細(xì)胞介素13受體的 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib36 36已被證明是向上在膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)控。而LDL受體是稀疏正常腦組織 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib5 5，我們?cè)砻?，人類GBM細(xì)胞系表達(dá)高水平的LDL受體 HYPERLINK http:/www.

47、sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib4 4，這表明LDL受體可能代表一個(gè)唯一的目標(biāo)，可用于直接交付化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的對(duì)流增強(qiáng)交付技術(shù) HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib37 37。而血腦屏障（BBB）可能擁有的LDL受體，可以發(fā)揮內(nèi)吞或transcytose低密度脂蛋白 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l

48、 bib38 38， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib39 39和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib40 40，GBM腫瘤缺乏BBB HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib2 2和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science

49、/article/pii/S016836590700497X l bib41 41。其中內(nèi)皮細(xì)胞中的健康組織的BBB將受到由LDL受體的程度靶向治療是未知的。我們已經(jīng)使用雙功能肽，其具有與LDL受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接到一個(gè)18個(gè)氨基酸的兩親性-螺旋先前生成的合成納米LDL HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26其中目標(biāo)上的GBM細(xì)胞系中的低密度脂蛋白受體。我們目前的做法是，以確定是否nLDL可以將脂溶性藥物的有效載荷，如果這種藥物運(yùn)載工具可以殺死GBM細(xì)胞系。紫杉醇油酸鹽，紫杉醇

50、的親脂衍生物，被用來作為模型藥物。紫杉醇促進(jìn)微管蛋白的聚合。形成在紫杉醇的存在下，微管是非常穩(wěn)定和功能失調(diào)，從而引起細(xì)胞死亡通過破壞所需的細(xì)胞分裂的正常微管動(dòng)力學(xué)。紫杉醇已證明在原發(fā)性上皮性卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，頭頸部，非小細(xì)胞肺癌，與艾滋病相關(guān)的卡波氏肉瘤的治療抗癌活性 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib28 28。雖然紫杉醇表明承諾在為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前研究，它是無效的在全身輸送應(yīng)用 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/articl

51、e/pii/S016836590700497X l bib2 2和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib42 42。這些問題都與紫杉醇的溶解性差并且它無法穿過血-腦屏障相關(guān)聯(lián) HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib43 43。直接配送方式，如對(duì)流增強(qiáng)交付，表明承諾在提高藥物的有效性在腦腫瘤 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/arti

52、cle/pii/S016836590700497X l bib44 44 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib44 ，但紫杉醇治療是通過藥物的毒性仍然僅限于健康組織。盡管我們的制劑的nLDL-PO是對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性較低（IC50：700納米，72小時(shí)）比標(biāo)準(zhǔn)的Cremophor EL：乙醇紫杉醇制劑（IC50：50納米，48小時(shí)） HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib2

53、7 27，nLDL-PO中與直接交付方式組合可能導(dǎo)致藥物在腦腫瘤細(xì)胞的高與積累，因?yàn)樗哪繕?biāo)是優(yōu)先表達(dá)于GBM細(xì)胞的低密度脂蛋白受體的能力，周圍的健康組織減少損傷。目前的研究已經(jīng)證明加載脂溶性藥物到nLDL的可行性，并表明，該遞送載體可以殺死GBM細(xì)胞。紫杉醇的毒性，但是，依賴于細(xì)胞的分裂和許多細(xì)胞在不斷增長(zhǎng)的腦瘤不積極分裂 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib45 45， HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016

54、836590700497X l bib46 46和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib47 47。因此，紫杉醇可能不是最佳的藥物治療這些腫瘤。細(xì)胞毒性藥物，而非細(xì)胞周期依賴性可能為靶向藥物遞送載體更好的有效載荷。在這方面，親水性藥物可以通過化學(xué)修飾的建議轉(zhuǎn)化為疏水性藥物前體由幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib15 15， HYPERLINK http:/ww

55、w.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib16 16和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib27 27，從而增加了藥物可以通過nLDL被潛在地靶向GBM的軍火庫(kù)。紫杉醇油酸鹽，最初是由倫德伯格等人描述。 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib27 27，被摻入到脂質(zhì)乳劑。類似的方法被用來羅德里格斯等人 HY

56、PERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib48 48。這一提法被認(rèn)為是獲得載脂蛋白E（apoE基因），其中結(jié)合的LDL受體。然而，載脂蛋白E另外結(jié)合到低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP），這是由神經(jīng)元在整個(gè)大腦表達(dá) HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib49 49。因此，這種制劑，不同于我們的粒子，沒有特別的靶向腫瘤細(xì)胞，并可能會(huì)導(dǎo)致大量的正常腦組織的非特異性攝取和不良的副作用。在目前的

57、研究中，我們已經(jīng)表明，nLDL保留了其對(duì)目標(biāo)LDLR能力，盡管加入紫杉醇油酸酯的制劑。我們觀察到在IC中的高原506和12小時(shí)的溫育與nLDL-PO之間的值。這一結(jié)果與我們以前的研究相一致 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26，其中熒光標(biāo)記nLDL吸收在6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)飽和。攝取的這種飽和指示的受體介導(dǎo)的過程。的低密度脂蛋白受體抑制劑，蘇拉明，由Schneider等所示的存在 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/

58、S016836590700497X l bib31 31由低密度脂蛋白受體阻斷LDL攝取，顯著隨nLDL-PO驗(yàn)證需要的官能LDLR的高效細(xì)胞治療的SF-767細(xì)胞的細(xì)胞存活殺戮。這些結(jié)果與我們以前的研究相一致 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib26 26，其中熒光標(biāo)記nLDL針對(duì)性的低密度脂蛋白受體和吸收阻斷蘇拉明。在這些研究中，我們也能證明nLDL可以阻止血漿來源的LDL結(jié)合，并通過低密度脂蛋白受體攝取，進(jìn)一步證實(shí)了nLDL通過低密度脂蛋白受體進(jìn)入細(xì)胞。由于nLDL-PO目前的

59、研究顯示，以行為類似于nLDL沒有藥物，這是一個(gè)跡象表明，盡管另外的藥物，nLDL保留對(duì)目標(biāo)LDLR的能力。低密度脂蛋白受體的在我們的研究中測(cè)試的GBM細(xì)胞株數(shù)量從128,000至950,000元細(xì)胞，其中SF-763細(xì)胞，其中有受體的人數(shù)最多，展出最貧窮的細(xì)胞存活與它的高受體的數(shù)量一致。在U-251細(xì)胞系與受體128,000每個(gè)細(xì)胞和SF-767與288,000感受器每個(gè)細(xì)胞擁有相等的生存和生存期大于SF-763細(xì)胞。這些結(jié)果與我們以前的研究，我們注意到的是攝取熒光標(biāo)記nLDL顆粒是依賴于低密度脂蛋白受體的數(shù)量在細(xì)胞表面的對(duì)比 HYPERLINK http:/www.sciencedir/s

60、cience/article/pii/S016836590700497X l bib26 26。細(xì)胞殺死，但是，是與其它因素，如細(xì) 胞對(duì)藥物和藥物抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以從細(xì)胞中除去藥物的敏感性的藥物既吸收的功能;因此，它是不足為奇的細(xì)胞存活率為不完全依賴于低密度脂蛋白受體數(shù)目。血漿LDL和HDL顆粒不會(huì)在腦脊髓液中發(fā)現(xiàn) HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S016836590700497X l bib5 5和 HYPERLINK http:/www.sciencedir/science/article/pii/S0168365907