DB32-T 3762.17-2021新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品-（高清現(xiàn)行）

1、ICS 13.100C 50DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 32/T 3762.172021新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范第 17 部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品Technical specifications for SARS-CoV-2 detectionPart 17: Pseudovirus positive control material for nucleic acid detection2021- 12 - 09 發(fā)布2022 - 01 - 09 實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB32/T 3762.172021 PAGE * ROMAN II目次前言II范圍1規(guī)范性引用文件1術(shù)語和定

2、義1縮略語2技術(shù)要求2試劑和材料3儀器和設(shè)備3假病毒原液的技術(shù)要求3質(zhì)控品的制備5質(zhì)控品的技術(shù)要求5前言DB32/T 3762新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范目前分為以下部分：第1部分：生物樣本采集、運輸和保存；第2部分：病毒分離與鑒定；第3部分：核酸熒光PCR檢測程序；第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫擴增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測程序；第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測程序；第7部分：空氣樣本檢測與評估；第8部分：物體表面檢測與評估；第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測與評估；第10部分：微量血清中和試驗；第11部分：全基因組高通量測序；第12部分：藥物體外抗病毒效果測

3、定；第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測程序；第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測程序；第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測程序；第16部分：核酸數(shù)字PCR法；第17部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品；第18部分：規(guī)模化核酸檢測程序。本文件為DB32/T 3762 的第17部分。本文件按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：南京市計量監(jiān)督檢測院、江蘇省疾病預(yù)防控制中心、蘇州市疾病預(yù)防控制中心。 本文件主要起草人：林婧、朱立國、

4、林學(xué)勇、胡寧、胡啟龍、王尚君、范宇宸、朱文、張雨晨、洪捷、談忠鳴、夏瑜、樊歡、鄧斐。DB32/T 3762.172021 PAGE 6新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范 第 17 部分：核酸檢測用假病毒陽性質(zhì)控品范圍本文件規(guī)定了新型冠狀病毒核酸檢測用假病毒類弱陽性質(zhì)控品的術(shù)語和定義、縮略語、試劑和材料、 儀器和設(shè)備、假病毒原液的技術(shù)要求、質(zhì)控品的制備和質(zhì)控品的技術(shù)要求。本文件適用于新型冠狀病毒核酸檢測用假病毒類弱陽性質(zhì)控品的技術(shù)要求以及評價方法。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最

5、新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法JJF 1006一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范JJF 1343標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1質(zhì)控品 control material用于體外診斷的質(zhì)量控制物質(zhì)，是一種旨在用于醫(yī)學(xué)用途的檢測系統(tǒng)中使用的物質(zhì)、材料、物品或 設(shè)備，其目的是評價或驗證測量精密度、測量準(zhǔn)確度、由于試劑或分析儀器的變化檢測系統(tǒng)可能產(chǎn)生的 分析偏差等性能特征，可用于能力驗證、實驗室內(nèi)質(zhì)量控制。3.2假病毒 pseudovirus一種具有病毒擬似的物理結(jié)構(gòu)和特異性核酸序列的病毒樣粒子，其分析特性與真實

6、病毒相似，但不 具備自我復(fù)制和感染的能力。3.3假病毒質(zhì)控品 pseudovirus control material由假病毒原料定量分裝后制成，能夠參與到病毒檢測從提取到擴增的全過程；具有生物安全性的同 時可作為測量標(biāo)準(zhǔn)，用于病毒核酸定性和定量測量方法的驗證評價以及實驗室的質(zhì)量控制。3.4計量溯源性 metrological traceability通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標(biāo)準(zhǔn)的值能夠與規(guī)定的參考標(biāo)準(zhǔn)（通常是與國家測量標(biāo)準(zhǔn)或國際測量標(biāo)準(zhǔn)）聯(lián)系起來的特性。3.5同源性 homology兩個核酸分子的 HYPERLINK /item/%E6%A0%B8%E8%8

7、B%B7%E9%85%B8 核苷酸序列間的相似程度。本文指假病毒質(zhì)控品中目的基因序列與相應(yīng)的真實病毒 參考毒株序列的一致性。3.6均勻性 uniformity同一批次生產(chǎn)的假病毒質(zhì)控品，每個最小包裝單元含有等量的目標(biāo)假病毒的狀態(tài)。通過測量取自不 同包裝單元或取自同一包裝單元的、特定量的樣品，定量測量結(jié)果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，則可認(rèn)為 質(zhì)控品所含目標(biāo)假病毒的量是均勻的。3.7穩(wěn)定性 stability假病毒質(zhì)控品在特定的保存條件和保存時間內(nèi)，假病毒的量保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力。縮略語下列縮略語適用于本文件。DMEM ：Dulbecco改良培養(yǎng)基（Dulbeccos modified eagles

8、 medium） PCR ：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）qPCR ：熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction）RT-PCR ：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction）RT-qPCR ： 逆轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction）RNase ：核糖核酸酶（ribonuclease）技術(shù)要求假病毒質(zhì)控品的技術(shù)要求主

9、要分為兩個方面，包含對假病毒原液的技術(shù)要求，如假病毒內(nèi)靶標(biāo)RNA 序列的同源性、假病毒原液的雜質(zhì)殘留等；還包含對質(zhì)控品成品的技術(shù)要求，如靶標(biāo) RNA 定值、均勻性、穩(wěn)定性等。假病毒質(zhì)控品必須同時滿足以下 8 點技術(shù)要求，才能作為新型冠狀病毒核酸檢測用的弱陽性質(zhì)控品：用于制備質(zhì)控品的原料假病毒含有與新冠核酸檢測的靶標(biāo) RNA 序列一致的 RNA ；用于制備質(zhì)控品的假病毒原液不含有 cDNA 雜質(zhì)；用于制備質(zhì)控品的假病毒原液無菌；質(zhì)控品的靶標(biāo) RNA 濃度為試劑盒檢出限的 1.5-3 倍左右，且定值結(jié)果具有計量溯源性；質(zhì)控品同批次均勻性合格；質(zhì)控品短期、長期及極端環(huán)境下穩(wěn)定性合格；質(zhì)控品適用于至少

10、 8 款獲批上市的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。試劑和材料無酶水：GB/T 6682 中的一級水，應(yīng)為無 RNA 酶的水。PCR 、RT-PCR 、RT-qPCR 、數(shù)字 PCR 相關(guān)試劑：商品化試劑。PCR 引物、探針：參照權(quán)威機構(gòu)公布的序列或自行設(shè)計。RNase ：商品化試劑。無 RNA 酶的各型號槍頭、EP 管、PCR 管、離心管、試管：商品化耗材。本文件中所有的化學(xué)試劑，除特別說明外，全部為分析純級別試劑。儀器和設(shè)備生物安全柜。普通離心機、冷凍離心機。恒溫水浴鍋。PCR 儀。核酸電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。熒光定量 PCR 儀。數(shù)字 PCR 系統(tǒng)。各型號移液器。培養(yǎng)箱。假病毒原液的技術(shù)要求靶標(biāo)

11、 RNA 序列同源性的檢測檢測方法RT-PCR 檢測提取假病毒的 RNA 作為模板。選用中國疾病預(yù)防控制中心或世界衛(wèi)生組織推薦的（見表 1）或根據(jù)靶標(biāo) RNA 自行設(shè)計的引物進行 RT-PCR 擴增。設(shè)置以水為模板的陰性對照，以含靶標(biāo) RNA 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板的陽性對照。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、回收反應(yīng)產(chǎn)物。表 1 中國疾病預(yù)防控制中心、世界衛(wèi)生組織推薦的新型冠狀病毒核酸檢測引物和探針序列目標(biāo)基因引物/探針序列（53）ORF1abFCCCTGTGGGTTTTACACTTAARACGATTGTGCATCAGCTGAP5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3N

12、FGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATRCAGACATTTTGCTCTCAAGCTGP5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3EFACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTRATATTGCAGCAGTACGCACACAP5-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ-3測序及溯源性分析將 的產(chǎn)物測序。測序結(jié)果與相應(yīng)的新型冠狀病毒核酸檢測靶標(biāo) RNA 的參考序列進行比對。結(jié)果判定在 RT-PCR 陰性對照和陽性對照都成立的情況下：若滿足假病毒 RNA 的 RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陽性且測序結(jié)果比對一致，則為合格；若假病

13、毒 RNA RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果為陰性，則表明假病毒未包裹病毒 RNA ，或假病毒核酸提取失敗，應(yīng)重新制備假病毒或提取核酸。cDNA 雜質(zhì)的檢測檢測方法分別以未做核酸提取的假病毒原液和假病毒中提取的 RNA 為模板，使用推薦的或自行設(shè)計的引物和探針或商品化試劑盒進行 qPCR 擴增。設(shè)置以水為模板的陰性對照，以重組質(zhì)粒為模板的陽性對照。結(jié)果判定在陰性對照和陽性對照都成立的情況下：若未提取的假病毒原液和/或假病毒提取的 RNA 的 qPCR 結(jié)果為陽性，即出現(xiàn)典型的 S 型擴增曲線或依據(jù)試劑盒說明書判定，則表明原液中或假病毒內(nèi)含有 cDNA 雜質(zhì)，即為不合格， 應(yīng)重新消化去除 cDNA

14、雜質(zhì)。若未提取的假病毒原液和假病毒提取的 RNA 的 qPCR 結(jié)果為陰性，即未起峰或依據(jù)試劑盒說明書判定，說明無 cDNA ，即為合格。無菌檢測用 DMEM 培養(yǎng)基 37 培養(yǎng)假病毒原液 24 h，溶液澄清，無菌生長，即為合格。質(zhì)控品的制備對結(jié)果判定為合格的假病毒原液，根據(jù)需要使用適當(dāng)?shù)娜軇俨《驹线M行稀釋后，分裝至凍存 管，直接或凍干后 -20 保存。具體制備過程本文件不作贅述。質(zhì)控品的技術(shù)要求新型冠狀病毒靶標(biāo) RNA 的定量基本要求采用核酸提取方法提取假病毒質(zhì)控品的 RNA ，采用 RT-qPCR 法或數(shù)字 PCR 法對靶標(biāo) RNA 的濃度進行定值。使用推薦的或自行設(shè)計的引物和探針或

15、商品化試劑盒進行定值。核酸提取方法和靶標(biāo) RNA 濃度的定值方法均應(yīng)通過適宜的國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的驗證方可采用。RT-qPCR 定量法使用 RT-qPCR 法進行定量時，所使用的具體方法應(yīng)為針對新型冠狀病毒靶標(biāo) RNA 片段設(shè)計建立的方法。標(biāo)準(zhǔn)品可以為拷貝數(shù)已知的新型冠狀病毒 RNA 或 cDNA ，或含有相關(guān)目的 DNA 片段的重組質(zhì)粒。將標(biāo)準(zhǔn)品以 10 倍進行梯度稀釋至少 5 個梯度，分別以每個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板， 進行 RT-qPCR 反應(yīng)，根據(jù)各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的 Ct 值和濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式。根據(jù)質(zhì)控品 RNA 的 Ct 值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式計算出質(zhì)控品中新型冠狀病毒靶標(biāo) RNA

16、的濃度。數(shù)字 PCR 定量法使用數(shù)字 PCR 法進行定量時，所使用的具體方法應(yīng)為針對新型冠狀病毒靶標(biāo) RNA 片段設(shè)計建立的方法。提取假病毒 RNA ，上樣至數(shù)字 PCR 反應(yīng)體系，進行數(shù)字 PCR 反應(yīng)。按照式（1）計算質(zhì)控品 RNA 的濃度。C C1 A （1）BC質(zhì)控品中靶標(biāo) RNA 的原始濃度，單位為拷貝每微升；C1數(shù)字 PCR 檢測結(jié)果所示的靶標(biāo) RNA 的濃度，單位為拷貝每微升；A數(shù)字 PCR 反應(yīng)體系中靶標(biāo) RNA 的稀釋倍數(shù)；B核酸提取時靶標(biāo) RNA 的濃縮倍數(shù)。靶標(biāo) RNA 濃度的計算定值結(jié)果采取 10.1.2 或 10.1.3 所述的方法進行靶標(biāo) RNA 的濃度計算，質(zhì)控品

17、濃度為新冠核酸檢測試劑盒檢出限的 1.5-3 倍左右即為合格。均勻性檢測檢測方法按照J(rèn)JF 1006 和JJF 1343 的要求，依據(jù)每一批次質(zhì)控品的制備數(shù)量，隨機抽樣選擇不同數(shù)量的包裝單元進行均勻性檢測。對質(zhì)控品進行核酸提取后，按 10.1.2 或 10.1.3 的方法進行靶標(biāo) RNA 濃度測定，計算每一個包裝單元靶標(biāo) RNA 的濃度。均勻性判定對所得數(shù)據(jù)按照 JJF 1006 和 JJF 1343 的統(tǒng)計學(xué)要求進行檢驗，若結(jié)果無顯著性差異，則質(zhì)控品均勻性良好，即為合格。若存在顯著性差異，即為均勻性不合格。穩(wěn)定性檢測短期穩(wěn)定性短期穩(wěn)定性評價質(zhì)控品在使用溫度（205）和運輸溫度 4 下的穩(wěn)定性

18、。按 JJF 1006 和 JJF 1343的方法進行評價。按 10.1.2 或 10.1.3 的方法進行靶標(biāo) RNA 濃度測定。長期穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性評價質(zhì)控品在存儲溫度 -20 的穩(wěn)定性。按 JJF 1006 和 JJF 1343 的方法進行評價。按10.1.2 或 10.1.3 的方法進行靶標(biāo) RNA 濃度測定。Rnase 耐受性檢測Rnase 耐受性評價質(zhì)控品暴露于極端高濃度 Rnase 環(huán)境下的穩(wěn)定性。根據(jù) Rnase 的使用說明書進行質(zhì)控品的孵育。孵育后的質(zhì)控品，按 10.1.2 或 10.1.3 的方法進行靶標(biāo) RNA 濃度測定。穩(wěn)定性判定對不同時間點或 Rnase 處理前后所得質(zhì)