實(shí)驗(yàn)體外重組

1、關(guān)于實(shí)驗(yàn)體外重組第一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握體外DNA的重組過程；學(xué)習(xí)外源DNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后與載體的連接及轉(zhuǎn)化過程；學(xué)習(xí)對(duì)DNA重組子的篩選方法。 第二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)步驟預(yù)期結(jié)果注意事項(xiàng)第三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、實(shí)驗(yàn)原理1、DNA重組簡介2、DNA連接酶3、TA克隆4、藍(lán)白篩選第四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA重組是外源DNA與載體分子的連接，重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將經(jīng)過酶切的或脫磷酸處理的載體分子與

2、外源DNA分子進(jìn)行連接。這樣經(jīng)過重新組合的DNA叫做重組體或重組子。1、DNA重組簡介第五張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA重組包括如下步驟： 外源DNA片段的制備； 載體的選擇； DNA片段與載體連接； 導(dǎo)入宿主細(xì)胞。第六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2種連接酶T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。 （1）大腸桿菌DNA連接酶 僅能連接具有相同粘性末端的兩個(gè)DNA分子。2、DNA連接酶第九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2） T4噬菌體DNA連接酶 不僅

3、能連接具有相同粘性末端的兩個(gè)DNA分子，還可以連接平末端雙鏈DNA分子。 但后者連接效率比較低，一般可提高T酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。第十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月2、DNA連接酶 T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步： 首先，T4連接酶與輔助因子AMP形成酶-AMP復(fù)合物； 然后，酶-AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5-磷酸基和3-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化； 最后，產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。酶最適溫度為37 ，但該溫度下粘性末端氫鍵不穩(wěn)定，所以連接反應(yīng)一般采取1216 連接過夜。第十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月磷酸

4、二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接第十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3、TA克隆將3端具有單個(gè)“A”突出末端的PCR產(chǎn)物克隆到3端具有單個(gè)“T”突出末端的線性化載體的克隆法。第十三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4、 藍(lán)白篩選pUC質(zhì)粒載體含有大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lac z）的啟動(dòng)子（受IPTG誘導(dǎo)）及其編碼肽鏈（ -半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特稱為lac z基因）。位于 lac z基因中靠近5端有一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能。第十五張，PP

5、T共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月受體大腸桿菌細(xì)胞的-半乳糖苷酶發(fā)生了突變，失去的氨基末端。當(dāng)lacz基因編碼的肽鏈同失去了正常氨基末端的-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生出有活性的-半乳糖苷酶分子，在IPTG誘導(dǎo)下，會(huì)啟動(dòng)表達(dá)，分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色背景。第十六張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月當(dāng)MCS中插入外源基因后，會(huì)阻斷肽鏈合成，不能形成互補(bǔ)，不能產(chǎn)生功能活性的-半乳糖苷酶，也就不會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色背景。所以含有重組質(zhì)粒載體的克隆是白色的。第十七張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、實(shí)驗(yàn)材料l、儀器和材料 感受態(tài)細(xì)胞(如E. coli JMl09、DH5 a)恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u

6、床，恒溫水浴槽，1.5 mL微量離心管（Ep管），微量取液器200 L及20 L吸頭，電泳儀，電泳槽。第十八張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、試劑 (1) 載體：質(zhì)粒pUC l8/19 (2) 目的基因：如小牛胸腺DNA (3) 限制性內(nèi)切酶：EcoRI，Hind (4) T4 DNA連接酶 (5) 0.1 mol/L CaCl2溶液 (6) LB瓊脂固體平板 （含氨芐青霉素） (7) 5 mL LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素） (8) 20 mg/mL X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷） (9) 200 mg/mL IPTG（異丙基硫代-D-半乳糖苷） (10)

7、 瓊脂糖 (11) 無菌雙蒸水第十九張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、實(shí)驗(yàn)步驟1、雙酶切目的基因及載體（TA克隆法可省此步）2、連接與轉(zhuǎn)化3、培養(yǎng)觀察第二十張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1、連接（5L 體系）：pEASY T3 1L PCR純化產(chǎn)物 1-4L （Taq酶擴(kuò)增）25 連接15min。一般，載體:外源基因（摩爾比）=1:21:102、轉(zhuǎn)化：10L連接產(chǎn)物全用來轉(zhuǎn)化200L大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。在含Amp的LB平板上，添加40 L 20 mg/mL X-gal及4 L 200 mg/mL IPTG，然后涂布轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。3、培養(yǎng)：37 ，倒置培養(yǎng)16h后，觀察結(jié)

8、果。計(jì)數(shù)白色和藍(lán)色菌落。第二十一張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果37倒置培養(yǎng)1216 h后，平板上可見生長有藍(lán)色和白色的菌落，其中白色菌落含有重組DNA，藍(lán)色菌落含有未重組成功的質(zhì)粒DNA 第二十二張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月五、注意事項(xiàng)雙酶切時(shí)，注意選擇合適高效的2種酶，注意雙酶的緩沖液、溫度的協(xié)調(diào)。酶的加入量須小于反應(yīng)體積的1/10，否則酶液中所含有甘油會(huì)抑制酶解反應(yīng)。注意連接體系中，載體與插入片段之間的 摩爾比。插入片段所需量（ng）=載體含量（ng）*插入片段長度（kb）載體長度（kb）*片段與載體摩爾比第二十三張，PPT共二十五頁，創(chuàng)作于2022年6月時(shí)間安排8: 3