內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法

1、關(guān)于內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)?zāi)z法第一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月內(nèi) 容基本概念實(shí)驗(yàn)方法操作注意事項(xiàng)第二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素 細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的產(chǎn)物,它主要化學(xué)成分是脂多糖。細(xì)菌在生活狀態(tài)下不會(huì)釋放出來(lái)，只有當(dāng)細(xì)菌死亡后才會(huì)表現(xiàn)出毒性。第三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、概念及相關(guān)知識(shí)熱原反應(yīng)：病人在靜脈給藥15分鐘后發(fā)生冷感、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐、昏迷、休克等癥狀。熱原：任何可以導(dǎo)致肌體發(fā)熱的物質(zhì)。機(jī)理：外源性熱原質(zhì)通過(guò)內(nèi)源性熱原質(zhì)起作用。外源性熱原質(zhì)吞噬性白細(xì)胞內(nèi)源性熱原質(zhì)體溫調(diào)節(jié)中心發(fā) 熱新蛋白合成新mRNA翻譯第四張，

2、PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1942年，美國(guó)藥典首次收載熱原檢查法，中國(guó)藥典自第一版（1953年版）起收載。所有注射用藥品（肌肉注射、靜脈注射）都要經(jīng)過(guò)熱原檢查。熱原檢查法的局限性： 1、重現(xiàn)性差。 2、對(duì)藥物引起的增加、抑制作用無(wú)法控制。 3、不同細(xì)菌產(chǎn)生的熱原質(zhì)的致熱域有差別。 4、非定量反應(yīng)。雖然不排除有其他熱原物質(zhì)存在，但細(xì)菌內(nèi)毒素是最主要的熱原物質(zhì)。第五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)： 肽聚糖 脂蛋白革蘭氏陽(yáng)性菌 革蘭氏陰性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖細(xì)菌內(nèi)毒素：革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。當(dāng)細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)完整時(shí)不具備生物活性，只有當(dāng)細(xì)菌

3、死亡，脂多糖脫落才顯示出內(nèi)毒素活性。脂多糖結(jié)構(gòu)：多糖O抗原核心多糖類脂A致熱活性部分第六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素的生物活性 1、致熱性。 2、致死性毒性。 3、白細(xì)胞減少。 4、激活凝血系統(tǒng)。 5、降低血壓，休克。 6、 Shwartzman反應(yīng)。 7、刺激淋巴細(xì)胞有絲分裂，等等 。第七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素的耐熱性 細(xì)菌內(nèi)毒素具很強(qiáng)的耐熱性，一般的高壓滅菌不能去除細(xì)菌內(nèi)毒素，需250至少30分鐘以上的干熱滅菌才能使其滅活 。 第八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)用器具的處理 內(nèi)毒素試驗(yàn)中使用的器皿都要經(jīng)過(guò)處理去除可能存在

4、的外源性內(nèi)毒素。 耐高溫的玻璃器皿等置于電熱干烤箱內(nèi)180干烤至少2h或者250干烤至少30分鐘； 塑料器皿置于30雙氧水中浸泡4h，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗，60烘干備用。 第九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素的單位內(nèi)毒素的量值：1、內(nèi)毒素單位（EU） 1982年FDA將當(dāng)時(shí)美國(guó)代號(hào)為EC2的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)定為5EU/ng。1983年內(nèi)毒素單位（EU）被USP正式引用。2、國(guó)際單位（IU） WHO先后兩次組織協(xié)作標(biāo)定，建立內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，其中第二批內(nèi)毒素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品適用于所有內(nèi)毒素檢查法，且明確1IU1EU。第十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素檢

5、查法 凝膠法 濁度法 光度法 顯色基質(zhì)法 重現(xiàn)性好 能定量 能控制藥物的增強(qiáng)/抑制干擾 操作簡(jiǎn)便。節(jié)省時(shí)間方法分類方法特點(diǎn)第十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法概念 本方法是利用鱟試劑檢測(cè)由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法 。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測(cè)定法，由于凝膠法操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高，并且藥典規(guī)定當(dāng)不同試驗(yàn)方法的結(jié)果存在爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法為準(zhǔn)，所以凝膠法被廣泛應(yīng)用。第十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動(dòng)物門，在我國(guó)主要分布于浙江、福建及兩廣的

6、沿海一帶。鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測(cè)內(nèi)毒素的敏感試劑。第十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法概念 凝膠法是通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。第十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理內(nèi)毒素C因子活化的C因子凝膠B因子凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng)第十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、

7、細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法實(shí)驗(yàn)程序1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、儀器及用具2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法）5、供試品內(nèi)毒素限量檢查第十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的儀器 1. 超凈工作臺(tái) 第十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的儀器2. 恒溫培養(yǎng)箱 孵育樣品浸提液以及培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果。第十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的儀器3.干烤箱 用于實(shí)驗(yàn)用耐高溫器皿的去熱源，溫度范圍要求至少300第二十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的儀器4. 移液器和無(wú)熱源的移液尖（或者

8、去熱源的刻度吸管） 5. 計(jì)時(shí)器、漩渦混合器、電子天平等第二十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的器皿器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑1075mm）、試管架、小三角瓶或磨口瓶移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及無(wú)熱原吸頭其他酒精燈、脫脂棉球、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜、記號(hào)筆第二十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法中用到的試劑 1）鱟試劑：具有國(guó)家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號(hào) 2）細(xì)菌內(nèi)毒素工作品 3）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的無(wú)菌水） 4）75乙醇第二十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試

9、劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。 第二十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（）,將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘, 然后制成2、1、0.5和0.25四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。第二十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 取復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管各加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

10、用水作為陰性對(duì)照。 將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入371的適宜恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘。 第二十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果觀察 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180時(shí)，若管內(nèi)形成凝膠，且不從管壁滑脫者為陽(yáng)性；若不形成凝膠，或形成凝膠但倒轉(zhuǎn)180后從管壁滑脫者為陰性。 保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。 第二十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 若最大濃度2.0管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（c）

11、，計(jì)算方法見(jiàn)中國(guó)藥典。 反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。 當(dāng)c在0.52.0（包括0.5和2.0）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。 第二十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月凝膠法的試驗(yàn)步驟 下面我們結(jié)合中國(guó)藥典2010、 GB 14233.2醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 以及GB 15810一次性無(wú)菌注射器 來(lái)學(xué)習(xí)具體試驗(yàn)方法。 第二十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟 浸提介質(zhì)（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）體積計(jì)算公示： V浸提介質(zhì)體積，單位為（ml）； L產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（該產(chǎn)品允許含有的細(xì)菌內(nèi)毒素的

12、量），單位為EU/件； 鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值，單位為EU/ml。第三十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟樣品處理方法： a）管類和容器類器具用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水浸泡器具內(nèi)腔，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)； b）小型配件或?qū)嶓w類樣品置無(wú)熱源玻璃器皿內(nèi)，加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水振蕩數(shù)次，在（371）恒溫箱中孵育不少于1h，取浸提液進(jìn)行試驗(yàn)。 制備的供試液儲(chǔ)存不應(yīng)該超過(guò)2h。一般要求供試液的PH值在6.08.0之間，如不在該范圍內(nèi)，可用鱟試劑廠家提供的PH緩沖液調(diào)節(jié)浸提液的PH值。第三十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟第三十二張，PPT共四十

13、三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果觀察 B、C溶液的反應(yīng)管必須要陽(yáng)性，就是輕輕倒轉(zhuǎn)180度過(guò)來(lái)，鱟試劑安瓿里的反應(yīng)溶液形成了凝膠體，不滑落。 而D溶液，就是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水那2管，必須要陰性，3個(gè)條件都滿足，就說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果是可信的。最后看A溶液的反應(yīng)情況： 陽(yáng)性就說(shuō)明原套器具每件大于20EU，判定為不合格； 陰性就說(shuō)明小于20EU,結(jié)果是合格的； 1管陽(yáng)性、1管陰性則要重新復(fù)查，復(fù)試時(shí)，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性則判斷合格；否則判斷為不合格。第三十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)1. 每批鱟試劑在用于試驗(yàn)前首先要進(jìn)行靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)； 2. 安瓿開(kāi)啟前應(yīng)先用砂

14、石劃痕(不管是色點(diǎn)或包環(huán)易折安瓿)，用手半拉半掰將頸部折斷，千萬(wàn)不能用鑷子敲擊，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加入時(shí)，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確，緩緩加入避免氣泡。 4. 保溫過(guò)程中不可隨時(shí)取出觀察，防止形成的凝膠受到振動(dòng)后變形而誤判為陰性。 第三十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)5. 凍干的鱟試劑應(yīng)存放在2-8下；避免長(zhǎng)時(shí)間放置在高于25的溫度條件下。已復(fù)溶的鱟試劑在間歇使用過(guò)程中最好放在2-8的冰箱里，可存放24小時(shí)，在-20以下，可存放四個(gè)星期，鱟試劑只能凍融一次。 第三十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、操作注意事項(xiàng)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：1、玻璃器具

15、應(yīng)規(guī)范化，便于除熱原、計(jì)量準(zhǔn)確、清洗操作方便。洗凈 去污去內(nèi)毒素 去洗滌劑 精洗 除外源性熱原：250 干烤至少1小時(shí)。2、盡量用鋁制器具和不銹鋼用具，且用蒸餾水沖洗后250 干烤至少1小時(shí)。3、用于內(nèi)毒素檢測(cè)的稀釋試管最好用玻璃試管；塑料用具只能為一次性且保證無(wú)內(nèi)毒素。第三十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)環(huán)境：最好在潔凈室或潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，保證環(huán)境溫度、濕度及通風(fēng)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)人員：用適宜的洗滌劑洗手，用75酒精棉球消毒，戴工作帽和口罩。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)嚴(yán)格按要求低溫保存；工作標(biāo)準(zhǔn)品開(kāi)封后盡快使用且應(yīng)一次性用完，不再保存。2、溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品用封口膜封口后在漩渦振蕩器上混勻15min；進(jìn)一步稀釋時(shí)每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30s。第三十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月振蕩前振蕩后內(nèi)毒素分子在水溶液中的狀態(tài)第三十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、每一步稀釋液所用的移液器不能反復(fù)、交叉使用。4、鱟試劑復(fù)溶時(shí)應(yīng)將檢查用水順著瓶壁加入，避免產(chǎn)生氣泡。5、操作時(shí)間的長(zhǎng)短。環(huán)境溫度變化都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故操作應(yīng)盡量熟練、快速。6、恒溫器的溫度變化應(yīng)1，鱟試劑與樣品混勻后應(yīng)立即移入水浴槽