免疫組化基礎知識

1、免疫組織（細胞）化學基礎知識分享定義免疫組化利用抗原和抗體之間的結合具有高度特異性，先將組織或細胞中某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中同類的抗原物質，由于抗原和抗體的復合物是無色的，因此使用的抗體多是進行標記后的抗體，以達到對組織或細胞中未知抗原進行定性、定位或定量的研究。免疫組織化學在病理診斷中的應用范圍腫瘤診斷一未分化惡性腫瘤性質判定；圓形、梭形、多形性腫瘤細胞鑒別;轉移腫瘤的原發(fā)部位的確定。2.淋巴瘤的診斷一鑒定反應性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。3內分泌腫瘤的診斷(檢測腫瘤分泌的激素)4軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤

2、5小活檢組織病理檢查(能明確顯示瘤細胞存在與否)6微小癌、微小轉移灶(淋巴結和骨髓)7細針穿刺(細胞學診斷)8.部分腫瘤來源分類9乳腺癌激素受體檢測(ER,PR)10.腫瘤基因產(chǎn)物(p53,cerb-B2,ALK,CDs)增殖細胞核抗原(Ki-67,PCNA)判定腫瘤的預后12病因診斷(HBV,HCV,EBV,CMV,HIV等)抗原&抗體一、抗原的概念是一類在合適的條件下，能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能與免疫應答產(chǎn)生的效應物質在體內和/或體外發(fā)生特異性結合反應的物質。抗原的性能：免疫原性一一產(chǎn)生免疫應答反應原性一一產(chǎn)生特異性反應完全抗原：同時具有免疫原性和反應原性的物質。不完全抗原或半抗

3、原：無免疫原性。二、抗原的種類分類依據(jù)種類單獨存在時是否有免疫原性半抗原和完全抗原抗原來源外源性抗原和內源性抗原抗原與宿主關系異種抗原，同種異體抗原，目身抗原B細胞產(chǎn)生抗體時是百需要T細胞輔助胸腺依賴抗原，胸腺非依賴抗原化學物質蛋白質，多穂，脂蛋白f脂多糖，糖蛋白,核酸等物理狀態(tài)顆粒性坑原，可溶性坑原產(chǎn)生方式天然抗原，人工合成坑原，基因工程抗原抗原特異性程度特異性抗原，共同抗原抗體的制備方法多克隆和單克隆抗體三、抗體的概念機體受到抗原刺激后，通過體液免疫應答，B淋巴細胞活化、增殖、分化為漿細胞，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應的球蛋白。四、抗體的種類分類依據(jù)種類抗體的一般性質免疫球

4、蛋白約等于抗體f分五類：IgGJgMJgAJgDJgE抗體的途徑或來源不同免疫抗體；天然抗體；自身抗體抗原抗體在試管內是否出現(xiàn)肉眼反應完全抗體；不完全抗體免疫組織化學的基本技術一、取材實驗動物麻醉（處死）,鋒利刀片切成大小適中，厚度3mm4mm。小型實驗動物：灌注（流）固定后取材（生理鹽水和4%多聚甲醛）人體材料活檢組織、手術標本、細胞和組織二、固定原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，應采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為112h。1常用的定劑甲醛緩沖液廣泛應用于病理標本的固定，甲醛在很好地保護組織形態(tài)結構完整的同時也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細

5、胞膜的通透性不利于染色時抗體的滲透，因此染色前常用酶進行消化以使抗原決定簇充分暴露,固定時間不直超過24h。4%多聚甲醛磷酸緩沖液廣泛應用于光鏡細胞化學研究。戊二醛多聚甲醛緩沖液適用于光鏡、電鏡免疫組織化學研究。其它如PLP液(過碘酸、賴AA、多聚甲醛固定液)、丙酮及醇類、娥酸等。2.固定注意事項(1)固定液的選擇標準：A.組織形態(tài)結構保存良好。B.最大限度保存抗原的抗原性。組織塊的大小:1.5cmX1.5cmX0.5cm為宜。固定時間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。溫度：一般在室溫下進行，電鏡標本和固定時間較長時可放置在4C冰箱。固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。三、包埋石蠟包

6、埋2冷凍包埋3.環(huán)氧樹脂包理四、切片1載玻片的處理（1）清洗（2）涂膠（防止脫片）。常用粘附劑：明膠：銘磯明膠和甲醛明膠。樹脂膠：也稱白膠。多聚賴氨酸（PLL）o商品化粘附劑。2切片類型（1）石蠟切片：厚約35um,放置37C溫箱烘烤過夜，以減少脫片。（2）冷凍切片：2umo（3）振動切片：特點是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。神經(jīng)組織應用較多。免疫組化染色過程中基本技術蛋白酶消化技術進行固定時，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限

7、度地結合增強特異性染色。1常用的消化酶月夷蛋白酶、胃蛋白酶消化時間因組織而異，一般為530min,消化時間不宜太長，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。3/非特異染色的控制非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應所出現(xiàn)的染色。（1）原因分析組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內源性生物素等.試劑方面：因抗體不純、標記的酶和熒光不純或標記過量等。（2）消除方法力口1抗前加正常血清1030min,以封閉組織中帶電荷的基因，避免與1抗的非特異性結合。常用染色方法分類1）按標記物質的種類，如熒光染料、放射性

8、同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法、免疫鐵蛋白法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織抗原檢測免疫熒光細胞化學技術一、基本原理免疫熒光技術也是根據(jù)抗原抗體反應的

9、原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。二、熒光產(chǎn)生的原理分子都含有電子，電子載不斷的運動著。一般情況下，電子總是處于能量最低的能級（即基態(tài)）在一定的條例下，電子可吸收能量躍遷到較高的能量級（即激發(fā)態(tài)），這個過程叫激發(fā)。1、熒光色素一一能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物。特性：必須具備吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光；具有吸收一定頻率光能的生色團和能產(chǎn)生一定光亮子的熒光團。2、用于標記抗體的熒光素必須具備以下條件:1）應具有與蛋白質分子形成共價鍵的化學基因，結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產(chǎn)物容易排除。2）熒光

10、效率高，與蛋白質結合熒光效率下降不多。3）結合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質和生化性質無影響。4）與蛋白質結合的方法簡便而快速。5）熒光素容易溶解，溶解后不會與其它物質發(fā)生化學反應。6）熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結果。3、熒光素的類型異硫氧酸熒光素(fluotescienisothocyanate,FITC)四甲基異硫氧酸羅達明(tetraethylrhodamineisothocyanate,TRITC)四乙基羅達明(tetraethylrhodamine,RB200)其它三、免疫熒光染色方法1、直接法：用己知特異性抗體與熒光素結合，制成特異性熒光抗體,直接用于細胞和

11、組織抗原的檢查。優(yōu)點：特異性高缺點：一種熒光抗體只能檢測一種抗原。2、間接法：用特異性的抗體（1抗）與細胞或組織標本反應，隨后用緩沖液洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體（2抗）與結合再抗原上的抗體結合，形成抗原抗體熒光抗體的復合物。優(yōu)點：熒光亮度增強，提高了敏感度四、非特異性染色1、非特異性染色的主要因素1）部分熒光素未與蛋白質結合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素腺蛋白，可與組織成分非特異結合。3）組織內類屬抗原的存在。4）從組織中難以提純抗原性物質。5）抗體分子上標記的熒光素太多。6）熒光素不純，標本固定不當。7）細胞和組織內某些物質自

12、發(fā)熒光。8）染色時間過長，溫度過高，沖洗不夠或標本干燥。2、消除的方法1）襯染法（可抑制自發(fā)熒光）2）胰蛋白酶消化（可抑制非特異性熒光）3）吸收（用小屬肝粉消除組織非特異性熒光的染色）4）用正常（非免疫）血清（清除自發(fā)熒光和非特異性熒光）5）提高抗體和熒光抗體的質量五、熒光顯微鏡觀察六、染色標本的保存原則上應立即再熒光顯微鏡下觀察，拍照，此時熒光最強。用緩沖甘油封片，保存在4C中，過夜后特異性熒光強度減弱25%,保存1周后減弱60%免疫酶組織化學技術和酶標抗體技術1.免疫酶染色用酶作為標記物，可分為直接法、間接法、補體法、免疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法（PAP法）和雙PAP

13、法等。（1）直接法原理：用酶直接標記在特異性1抗上，與標本中的抗原結合，讓酶催化底物反應產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原抗體反應部位，即可在鏡下對標本的抗原進行檢測。優(yōu)點：簡便、快速、特異性強；缺點：敏感性差。（2）間接法原理：先用標記的特異性1抗與標本中相應抗原結合，再用酶標記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然后再加酶的底物，顯示抗原抗體抗原抗體復合物存在的部位，以對抗原進行檢測。如：1抗是由兔產(chǎn)生的多克隆抗體，貝吃抗常用羊抗兔IgG；1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體，貝吆抗常用羊或馬抗鼠IgG。以上兩種方法稱為酶標抗體法（3）非酶標記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過酶與込的特異性結合進

14、行標記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。丄常用的有PAP、sABC、LsAB法sABC法的操作過程基本原理：sABC(strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex)鏈球菌抗生物素(卵白蛋)生物素過氧化物酶復合物生物素(biotin):是一種分子量為244da的小分子的維生素?？股锼?avidin):是一種糖蛋白,分子量為68KDao生物素與抗生物素有很強的親和力，兩者一旦結合就很難解離。同時生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結合的能力。所以生物素-一抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強及方便快速等顯著優(yōu)點。附基本操作步驟ABC法基本

15、操作步驟步驟操作時間步驟操作時間ii11二甲苯脫蠟至水9PBS洗5minX320.3%H202甲醇阻斷30min10加sABC室溫3060min3流水洗11PBS洗5minX34PBS洗5minX312dab-h2o2反應液顯色210/15min5110%正常血清封閉室溫30min13流水洗6稀釋的特異性一抗室溫30-60min或4C過夜14核染色30slmin7PBS洗5minX315脫水透明封片8生物素標記的二抗室溫30-60min免疫電子顯微鏡技術一、免疫電鏡技術(immunoelectionmicroscopy)是利用抗原和抗體特異性結合的原理，在超微結構水平定位、定性及半定量顯示抗原

16、的技術方法。從細胞超微結構水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應，必須使抗體帶上具有高電子密度的標記物，這樣才能在電鏡下觀察反應分結果。到目前為止，己有三種標記技術：鐵蛋白標記技術酶標記技術膠體金標記技術免疫金標記技術(immunogoldstainingtechnique)用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標記物，制成免疫膠體金來研究抗原抗體的反應。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結構的觀察。根據(jù)抗體特異性結合的原理，在亞細胞水平定性定位。對抗體加以標記，形成高電子密度區(qū)，在電鏡下觀察反應過程。在對細胞內抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標記同一細胞內不同的抗原。進行多重標記。附：免疫金標記技術的應用范E（1）免疫金標記技術是金探針作為抗體與組織和細胞內抗原發(fā)生抗原抗體特異性反應，使金顆粒附著在反應部位，定位準確，金顆粒電子密度很高，EM下清晰可辨。