版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、Word文檔 磁珠法核酸提取及常見的6種誤區(qū) 人類對核酸物質的了解始于1869年,這一年Friederich Miescher從白細胞的細胞核中分別出一種他稱之為“核素”的化學物質,這是人類歷史/上/第一次有目的地提取細胞內的核物質,然而當時采納的方法非常簡潔,僅僅是通過轉變溶液的酸堿度,核酸便從酸性溶液中沉淀出來。這也是最早對核酸性質的描述,即是一種溶于堿性溶液,但不溶于酸性溶液的物質。 1953年,Watson和Crick闡明白DNA的結構,從今開啟了分子生物學的元年。此后不久,消失了分別核酸的標準試驗室程序。1958年,發(fā)覺DNA半保留復制原理的Meselson和Stahl開創(chuàng)性地應用密
2、度梯度離心法獲得DNA。這種方法利用離心力場中各組分的浮力密度差不同的原理進行DNA純化。由于銫離子(Cs)相對于水的密度更大,施加到CsCl溶液的超高離心力導至形成密度梯度。核酸在這個梯度上遷移,直到達到中性浮力,即等密度點。該方法具有以低成本供應特別純的高產DNA的優(yōu)點。其它的液相純化方法還包括經典的苯/酚-氯仿法、CTAB法等。但直到二十世紀90年月,DNA提取仍舊是耗時、繁瑣、低效率的操作。1989年,McCormick建立了一種用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白質的基因組DNA提取方法。它類似經典的酚/氯仿提取法,即用酚化的二氧化硅酚代替酚,這是最早消失的固相吸附提取方法。相比起液相抽提,
3、固相吸附法的優(yōu)勢很明顯,因此傳統(tǒng)的液相分別提取核酸方法漸漸被以固相吸附支持物為基礎的新方法所取代。目前常見固相材料有硅膠、玻璃顆粒、硅藻土、陰離子交換載體等。但固相法通常需實行數次快速離心、真空抽濾等步驟來實現分別,而且對于樣本需求量大,耗費樣品較多,不便于高通量、自動化操作,嚴峻限制了在臨床基因診斷領域的應用。抱負的核酸提取方法應當滿意以下4個條件:1)靈敏、快速、簡潔、重復性好;2)產物純度較高,不影響后續(xù)步驟3)環(huán)保、無毒害4)無交叉污染風險磁珠法提取 為了適應現代分子生物學檢測試驗高通量、高靈敏度、自動化操作的需要,磁珠法應運而生。第一個利用磁珠法提取DNA的并且在美國勝利申請專/利的
4、商品化試劑消失在1998年。磁珠法先通過裂解細胞,將游離出來的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面,而蛋白質、多糖等雜質則留在溶液中;在外加磁場的作用下,磁性顆粒與液體分開,棄除液體后,再經洗脫即得到純化的核酸分子。磁珠法利用了磁性顆粒活性基團在肯定條件下可與核酸結合和解離的原理,盡可能地避開了提取過程中核酸的丟失,還能很好地去除標本中存在的干擾物質(如血紅蛋白、膽紅素及脂血等因素)影響,獲得質量較高的核酸模板。隨著磁珠法提取技術的進展,DNA提取才真正開頭實現標準化、快速化和自動化。而基于磁珠法提取的商業(yè)試劑盒也得到廣泛應用。這種試劑盒不需要任何有機溶劑,無需重復離心,目前可以從全血、血清、血漿
5、、唾液、尿液、糞便、腦脊液、組織和細胞中提取高質量的DNA和RNA,且耗時更短、回收率更高。最顯/著的優(yōu)勢是可以通過機械設備實現提取過程自動化和無人源干擾。近年來分子診斷技術快速進展,隨著基因測序等技術的成熟,成本進一步降低,在臨床上的應用也越來越普遍。分子診斷檢測的樣本類型多達數十種,而處理后產物適用的檢測項目也涵蓋了熒光定量PCR、基因測序、基因芯片、生物質譜等各類分子生物學技術平臺。然而,無論是哪一類檢測項目,精確的檢驗結果無疑依靠于高質量的標本及標本前處理過程。因此臨床分子診斷自動化趨勢將逐步在國內臨床試驗室成為主導,而自動化首先將在目前手工操作較普及且對結果影響最大的核酸提取上實現。
6、磁珠法提取試劑加自動核酸提取儀,就成為解決臨床分子診斷樣品前處理的完/美組合。然而,使用生物磁珠提取核酸的過程中,也存在著一些誤區(qū)。誤區(qū)1:磁珠越多,提取效果越好有許多老師喜愛在提取效果不佳的時候,增加磁珠的用量,認為磁珠多加一點,就能吸上更多的核酸,不得不說這種想法是不行取的。磁珠的主要特點是既可以分散于液體中,也可以在外加磁場作用下以固態(tài)方式和液相分別,任何試劑體系,磁珠和液體的比例都應當是有肯定閾值的,超過肯定的比例,過多的磁珠將由于無法勻稱分散于液體中,而丟失其分散的特性,也使得洗滌過程中無法充分增加核酸磁珠和液體接觸的效率。而過量的磁珠也會吸附更多的雜質,對于除雜的效果影響特別大。甚
7、至有些時候,過多的磁珠會吸附蛋白酶、溶菌酶等在液體體系中起主要作用的功能成分,導至整個試劑盒效率低下。有許多時候,在提取效果不佳的時候,削減磁珠使用量,反而是提升提取效果的最優(yōu)途徑。通常狀況下,磁珠法試劑盒給出的參考磁珠用量都是略微過量的,因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的狀況并不多,但假如確定是磁珠用量不足導至的提取效果不好,是可以在肯定范圍內通過增加磁珠用量來改善提取效果的。誤區(qū)2:試劑使用的越多,提取效果越好裂解效果不好?多加點裂解液。洗滌效果不好?多加點洗滌液。這是許多客戶在使用試劑盒中的慣性思維。但是對于磁珠法而言,每增加一部分液體體積,就削減了更多的磁珠碰撞幾率,而降低磁珠碰撞幾率
8、,會導至吸附率的大幅度下降。所以許多時候,雖然增加裂解液和洗滌液的確能夠起到增加裂解和增加洗滌的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,無法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的,所以單純增加試劑使用量改善提取效果并不肯定完全有效。誤區(qū)3:洗滌次數越多,提取效果越好提取得到的核酸雜質過多時,使用者會考慮多進行幾次洗滌,以得到更為純潔的核酸。增加洗滌次數的確有利于提純核酸,但考慮到每次洗滌都會損失肯定量的核酸,且增加了核酸斷裂水解的可能性,所以一般來說洗滌次數掌握在24次為宜。誤區(qū)4:樣本取用的越多,提取效果越好在樣本不夠新奇或者核酸含量本身就很少的狀況下,往往核酸提取效果不好,許多老師
9、就會采納多取樣本的方式增加核酸提取量。但簡潔地增加樣本取樣量,有時會引入過多的雜質,超出裂解液裂解力量,也會使提取效率降低,所以并不推舉通過簡潔的增加樣本取樣量的方式來達到增加提取量的目的。假如的確是由于樣本量不足而引起的提取量過低,建議在前處理先經過富集或者濃縮步驟再開頭提取?;蛘咴黾恿呀獾耐耆裕垢嗟暮怂岜┞冻鰜硪彩且环N解決方法。誤區(qū)5:某一種磁珠好,就應當在全部試驗中效果都好磁珠的種類是多種多樣的,粒徑大小不同,分散性不同,磁響應時間不同,包被基礎基質不同,外層修飾官能團不同,包被密度不同,官能團臂長不同,會導至磁珠特性千差萬別。所以不同磁珠所適應的試驗和體系也是不同的。就像同樣是核酸提取的試劑,配方也并不完全相同,同樣應用于核酸提取的磁珠,性質也并非完全全都。有的磁珠在常量核酸提取中表現出了更高的吸附效率,有的磁珠更適用于微量核酸提取。有的磁珠適合偏酸性系列的試劑體系,有的磁珠適合偏堿性系列的試劑體系。有的磁珠磁響應性好但是沉降速度快,更適合磁棒式自動提取儀;有的磁珠沉降速度慢但是磁響應時間長,更適合移液式自動提取儀。很少有一種磁珠能適用于全部試驗的狀況,除了固定的試劑盒協(xié)作,多數狀況下
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025年度夜間商業(yè)街區(qū)治安巡邏打更服務協(xié)議范本4篇
- 2025年度個人信用貸款簡易合同范本年度更新3篇
- 二零二五年度車輛掛名轉讓過戶手續(xù)辦理服務協(xié)議4篇
- 2025廠房租賃安全協(xié)議書:消防安全責任與維護細則2篇
- 二零二五年度車輛安全技術研發(fā)獎勵合同4篇
- 二零二五年度砂石料行業(yè)碳排放交易合同范本3篇
- 自我驅動學習如何有效提升學生的自主學習能力?案例分析
- 科技園區(qū)巡察的智能化與標準化進程
- 百色2025年廣西百色邊境管理支隊招聘輔警10人筆試歷年參考題庫附帶答案詳解
- 2025年度個人信用保證合同范本5篇
- 八年級語文下冊 成語故事 第十五課 諱疾忌醫(yī) 第六課時 口語交際教案 新教版(漢語)
- 中考語文二輪復習:記敘文閱讀物象的作用(含練習題及答案)
- 老年外科患者圍手術期營養(yǎng)支持中國專家共識(2024版)
- 子宮畸形的超聲診斷
- 2024年1月高考適應性測試“九省聯(lián)考”數學 試題(學生版+解析版)
- (正式版)JBT 11270-2024 立體倉庫組合式鋼結構貨架技術規(guī)范
- EPC項目采購階段質量保證措施
- T-NAHIEM 101-2023 急診科建設與設備配置標準
- 《復旦大學》課件
- 針灸與按摩綜合療法
- 四川2024年專業(yè)技術人員公需科目“數字經濟與驅動發(fā)展”參考答案(通用版)
評論
0/150
提交評論