光鏡與電鏡技術2、光學顯微鏡

1、光鏡與電鏡技術上海海洋大學水產與生命學院 周平凡 第一部分：光學顯微鏡第二部分：電子顯微鏡光鏡與電鏡技術教 材電子顯微鏡技術與應用實用生物醫(yī)學電子顯微鏡技術參考書：植物顯微技術一、教 學第一部分光學顯微鏡技術與電子顯微鏡理論第二部分透射電鏡原理、結構與操作第三部分掃描電鏡原理、結構與操作第四部分電鏡樣品制備與超薄切片技術二、實 驗光學顯微鏡成象系統(tǒng)調整與使用光學顯微鏡制樣與拍攝掃描電鏡樣品的脫水與干燥、粘樣與鍍膜(演示)透射電鏡照明系統(tǒng)與成像系統(tǒng)合軸等(暫停)掃描電鏡燈絲飽和點、曝光曲線調節(jié)等(暫停)透射電鏡消像散與拍攝(暫停)掃描電鏡消象散與拍攝(演示)載網支持膜制備、玻璃刀制作與超薄切片機

2、使用(暫停)顯微鏡的發(fā)展一、光學顯微鏡 顯微鏡理論、制作和應用的發(fā)展從十五世紀開始逐漸發(fā)展起來的。1674年荷蘭人用自制的顯微鏡為人類打開了微觀世界的大門。一、光學顯微鏡顯微鏡的歷史1590年 荷蘭的眼鏡匠詹森父子發(fā)明了世界上第一臺光學顯微鏡1660年 羅伯特胡克改良了復合顯微鏡，第一次發(fā)現(xiàn)了植物的細胞結構1685年 荷蘭商人列文虎克在顯微鏡中加了一塊透鏡，使得放大倍率達到了200多倍，借助這臺顯微鏡，他觀察到了細菌、浮游生物等，成為了第一個發(fā)現(xiàn)微生物的人 顯微鏡的發(fā)明 使人類更深刻地揭示了自然界的奧秘，推動了各學科的發(fā)展，反過來由于科學的發(fā)展，又促進了顯微鏡技術的改進，使之日趨完善。顯微鏡設

3、計與制造現(xiàn)代多為光、機、電的三結合體。一、光學顯微鏡顯微鏡根據(jù)照明光源的性質可為兩大類：光學顯微鏡利用人眼可見光(包括不可見的紫外光線)作為光源的而謂之。根據(jù)結構、附件、原理、性能以及應用范圍的不同又可分為多種類型。光學顯微鏡的分辨率約為0.2-0.4毫微米，最高放大率為1500倍左右。一、光學顯微鏡非光學顯微鏡利用電子束作為光源，根據(jù)“軸對稱的電磁場對電子束起著透鏡作用這一理論制成所謂的“電磁透鏡”，即為電子顯微鏡。電子顯微鏡的分辨率約為幾個埃，放大率可達幾百萬倍左右。一、光學顯微鏡 顯微鏡的種類繁多，根據(jù)應用范圍可分三大類：生物顯微鏡應用范圍最廣，種類最多，是一類極為重要的研究工具。金相顯

4、微鏡工業(yè)檢測顯微鏡歸納光學顯微鏡的分類有：1、單式顯微鏡：各種放大鏡、平臺解剖鏡2、復式顯微鏡：普通型（小型教學用），特種型（中 型研究用），高級型（大型聯(lián)機多用途研究）一、光學顯微鏡根據(jù)結構和功能可分為普通型：供一般常規(guī)鏡撿、教學和研究用，如通常的復式顯微鏡。特種型：利用不同的光學原理設計而制作的顯微鏡，而且是供某種專門觀察和研究之用。如暗場、相襯、偏光、微分干涉、螢光、體視、例置、比較、金相、顯微攝影、電視顯示、電影攝影顯微鏡等。高級型：萬能顯微鏡，指大型多用途、附件較齊全、物鏡及目鏡等光學部件均高級的顯微鏡。特種型及高級型: 性能較高，而且應用于不同的研究目的，以達到特定的研究效果。又稱

5、為“研究用顯微鏡”。一、光學顯微鏡顯微鏡的幾個基本概念一、光學顯微鏡顯微鏡的作用是一種處理波的工具，是處理可見光及近可見光波段的波，使之成束地照射在被檢物體上。其成象落在人眼的視網膜、感光片或其它記錄系統(tǒng)(如電視顯示或電影)上，突破了人類生理的限制。把視覺伸展到人眼不能分辨的微觀世界中去。用來觀察、記錄和研究經過制片技術處理后的被檢物體的細微結構。對微觀世界的探索及理論上的研究起著極其重要的作用。廣泛地應用于各學科的領域中。一、光學顯微鏡人眼的重要性人眼具有敏捷的性能，視覺傳入大腦的信息約占各種信息的80，其高度的準確性、靈敏度、分辨力和適應性等方面，至今在理論上尚未完全解釋清楚。人眼的局限性

6、 不能看清很遠或太小的物體。對所觀察到的物體的形狀、大小和遠近，不能作出精確的定量比較和計量。對發(fā)生在瞬間的現(xiàn)象或事物不能留下長久的記錄。只能感受光譜中很窄的可見光（波長約為400-700毫微米）范圍內的電磁波。一、光學顯微鏡顯微鏡的組成一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡光學顯微鏡的組成均由單個和多個透鏡組成，即由物鏡、目鏡及聚光鏡等部件。透鏡是組成顯微鏡光學系統(tǒng)的最基本的光學原件。透鏡依其外形的不同可分為兩大類1、凸透鏡（又稱會聚透鏡、正透鏡）2、凹透鏡（又稱散發(fā)透鏡、負透鏡）一、光學顯微鏡透鏡成象凸透鏡在物方所成的象是光線真正的交點，稱為“實象”。實象在屏幕上能顯現(xiàn)出來，而虛象則不

7、能，但當我們用眼睛對著透鏡觀察時，則完全能看到它。凹透鏡所形成的象是與物體處在同一方，稱為“虛象”。虛象當一束平行于光軸的光線通過凹透鏡后，形成散射光，在象方空間不能相交于一點，只有它們的延長線才能在物方空間相交于一點，這個點稱“虛焦點”，這個平面稱“虛焦點平面”。一、光學顯微鏡顯微鏡的成象原理一、光學顯微鏡顯微鏡的成象原理當物體位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象；當物體位于透鏡物方焦點以內時，則像方也無象的形成，而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。一、光學顯微鏡顯微鏡成象原理圖一、光學顯微鏡。透鏡的成象質量透鏡所形成的象除了象的位置、

8、大小、倒正、虛實之外還有成象的質量問題，也就是說，物體通過透鏡后所成的象與理想象上的差異。所產生的象差將直接影響顯微鏡成象的清晰度和象的變形。透鏡所形成的象，應滿足幾何相似的要求點的象應為一點直線的象應為一直線平面的象應為一平面一、光學顯微鏡光具有的物理性質折射和折射率光線在均勻的各向同性介質中，二點之間應以直線傳播，當通過不同密度介質的透明物體時，則會發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質中的傳播速度不同所造成的。 不同介質的折射率空氣 1.0水 1.33甘油 1.405一、光學顯微鏡“象差”的概念一、光學顯微鏡影響透鏡成象質量的因素從一點發(fā)出的光束在通過透鏡后，光束的同心性或多或少地受到破壞（

9、由光具有的物理性質及使用的光源的特點以及光具的制作技術而造成），在象空間并不相交于一點，而是分布在一個很小的區(qū)域內，所形成的象與理想象在形狀、顏色上有著一定的差異，這種差異稱為“象差”（Aberration）。一、光學顯微鏡六種象差的變形情況：1、色 差2、球 差3、像 散4、慧形差5、場 曲6、畸 變一、光學顯微鏡無色差有色差1、色差一、光學顯微鏡2、球差一、光學顯微鏡3、像散一、光學顯微鏡4、慧形象差一、光學顯微鏡5、場曲一、光學顯微鏡6、畸變一、光學顯微鏡色差的校正采用單色光作為光源，如采用綠色光；但不能避免球差。利用凸、凹透鏡兩者所產生的色差型彼此相反，同時采用色散力不同而折射率相同的

10、兩種玻璃，分別作成凸凹透鏡，將其膠合起來以消除色差。消色差物鏡用光學樹脂膠合起來做成透鏡組校正色差的產生。復消色差物鏡用各種品種的玻璃以及繭石作成透鏡組，可將三種光素(紅、綠、藍)會聚在一點，這樣便有效地降低了各焦點和剩余顏色的色差。一、光學顯微鏡顯微鏡各項光學的技術參數(shù)一、光學顯微鏡 顯微鏡各項光學技術參數(shù)數(shù)值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、復蓋差、工作距離、圖像亮度、視場亮度等。合理使用參數(shù)各項參數(shù)并不都是越高越好，在使用時，應根據(jù)鏡檢的目的和實際情況來協(xié)調各參數(shù)之間的關系，以保證分辨率為準。 一、光學顯微鏡數(shù)值孔徑（NA）又稱“鏡口率”、“開口率”，簡寫NA或A。是物鏡和聚光鏡的主

11、要技術參數(shù)，是判斷其性能高低的重要標志。數(shù)值的大小分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。物鏡數(shù)值孔徑（NA）是前透鏡與被檢物體之間介質的折射率（）和孔徑角（）半數(shù)的正弦之積。用公式表示為NASin（/2）。物鏡的數(shù)值孔徑（NA）一般在0.85-1.4之間。一、光學顯微鏡聚光鏡數(shù)值孔徑（NA） 一般在0.05-1.4范圍內變化，它可通過調節(jié)孔徑光闌的大小來改變NA值的大小，從而達到與物鏡NA值相匹配。有的聚光鏡可以把上透鏡推出光路，NA值則下降。聚光鏡的正確使用在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值；在顯微照相時，則應小于物鏡的NA值。一、光學顯微鏡分辨率又稱“鑒別率”、“解象力”和“分辨

12、本領”.是衡量顯微鏡性能的又一個重要技術參數(shù)。分辨本領：德國著名理論光學家Abbe早在100多年前就給出分辨本領：=0.61/nSin式中，n為物體所處媒介的折射率；為孔徑角；為發(fā)射光波長。一、光學顯微鏡人眼的分辨本領在照明良好的情況下，能分辨約0.1mm距離的兩物體點。顯微鏡的分辨本領最小分辨距離也有一定限度，理論計算為物鏡能分辨約0.2m距離的兩物體點。一、光學顯微鏡 有效放大率把由顯微鏡的分辨本領所能分辨開的兩點間的距離，放大成相當于人眼能分辨的距離。人眼的分辨本領大致為0.1mm,所以分辨本領為0.2m的顯微鏡，其有效放大率是 0.11000/0.2=500倍。顯微鏡觀察物體時，把物體

13、的像放大到超過肉眼已能詳細辨認細節(jié)的程度是沒有必要的。一、光學顯微鏡 放大率的概念放大率即為放大倍數(shù),是指被撿物鏡經物體放大再經目鏡放大后，人眼所看到的最終圖象的大小對原物體大小的比值。是物鏡和目鏡放大倍數(shù)的乘積。是指長度的放大，而不是指面積的放大。物鏡和目鏡的放大倍數(shù)均標刻在其外殼上。總放大率(M)物鏡放大率(Mob)x目鏡放大率(Moc) 一、光學顯微鏡 物鏡與目鏡的合理使用觀察時應在有效放大率的范圍內來選擇。使用100X的物鏡時，應使用6.7X或10X的目鏡較好，如用5X目鏡則達不到人眼所能分辨的大??；用20X的目鏡則為無效放大。在觀察時，一般使用10X的目鏡為好，愈是高級的研究用顯微鏡

14、常配置二對10X的目鏡，10X目鏡為“標準目鏡”。作高倍鏡撿時，首先應考慮更換物鏡，而不要盲目更換過高倍率的目鏡。 一、光學顯微鏡 兩組物鏡與目鏡配合使用比較20X（物鏡0.40NA）與20X（目鏡）搭配使用圖象質量欠佳40X（物鏡0.65NA）與10X（目鏡）搭配使用圖象質量優(yōu)良中間鏡在研究用顯微鏡中，目鏡與物鏡之間若有中間鏡，則總放大率應再乘以中間鏡的放大倍數(shù)。一、光學顯微鏡焦深焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體點時，不僅位于該點平面上的各點都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清晰部分的厚度就是焦深。焦深大，可看到被檢物體的全層，而焦深小，則

15、只能看到被檢物體的一薄層。焦深與總放大倍率及物鏡的數(shù)值孔徑值成反比。放大倍率愈高，數(shù)值孔徑值愈大，焦深則愈小。一、光學顯微鏡視場直徑也稱視場寬度或視場范圍，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑大小是由目鏡里的視場光闌所限定。視場直徑愈大，愈便于觀察。使用廣角目鏡可以增大視場直徑。增大物鏡的倍率，視場直徑減小。一、光學顯微鏡復蓋差由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產生了象差，這就是復蓋差。復蓋差的產生影響了顯微鏡的成象質量。蓋玻片的標準厚度為0.17mm，允許范圍在0.160.18mm。物鏡外殼上標刻的0.17，即表明該物鏡

16、所要求蓋玻片的厚度。低倍物鏡不受蓋玻片影響，使用油鏡時蓋玻片不能太厚。一、光學顯微鏡鏡象亮度與視場亮度鏡象亮度是顯微鏡的圖像亮度的簡稱，指在顯微鏡下所觀察到圖象的明暗程度。使用時，對鏡象亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼，使眼睛不感到疲勞為好。鏡象亮度對于在高倍鏡下觀察和顯微攝影及投影時尤為重要，如果沒有足夠的鏡象亮度，顯微照相要延長曝光時間，顯微投影屏上的圖象也因暗淡，從而影響觀察。一、光學顯微鏡工作距離工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離，它與焦距是兩個概念。調焦實際上是調節(jié)工作距離。物鏡倍數(shù)小，其工作距離長；反之，孔徑大的高倍物鏡，其工作距離短。研究用顯

17、微鏡的物鏡前透鏡處帶有彈簧裝置，顯微鏡的機械部分也加有“限位裝置”。倒置顯微鏡其工作距離可達14mm，體視顯微鏡的工作距離可達20mm。一、光學顯微鏡高低倍物鏡工作距離的比較一、光學顯微鏡物鏡的使用方法一、光學顯微鏡物鏡物鏡是顯微鏡最重要的光學部件，物鏡最前面的透鏡稱“前透鏡”，最后面的透鏡稱后透鏡”。物鏡復合透鏡組的總焦距為物鏡的焦距。物鏡前透鏡與被檢物體之間的距離稱為工作距離。在高倍鏡檢時，為了防止壓碎玻片和損傷物鏡，除物鏡的前端裝有彈簧裝置外，低倍至高倍物鏡必須齊焦。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡不同種類的物鏡 干燥系物鏡即放大率為1,2,4,10,20,40,60X的物鏡。鏡檢時物鏡前透

18、鏡與蓋玻片之間以空氣（n1）為介質。油浸系物鏡即放大率為90、100X油鏡。鏡檢時物鏡前透鏡與蓋玻片之間以香柏油、無熒光油（n1.5左右）為介質。該類鏡物外殼上常標刻有“Oil”、“IL”或“HI”字樣。一、光學顯微鏡平場物鏡平場消色差物鏡在鏡頭的外殼上標有P1an ACF。平場復消色差物鏡在鏡頭的外殼上標有P1an AFO。平場半復消色差物鏡外殼上標刻有P1an SAO。超平場復消色差物鏡外殼上標刻有SP1an SAO。特種物鏡帶校正環(huán)物鏡校正由蓋玻片厚度不標準所引起的復蓋差。帶虹彩光闌物鏡在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌，增大焦深的作用。一、光學顯微鏡相襯物鏡用于相襯鏡檢術的專用物鏡，其特點

19、是在物鏡的后焦點平面處裝有相板。無熒光物鏡專用于落射式熒光顯微鏡上的物鏡，這種物鏡即使受到很強的激勵光源也不發(fā)出熒光?！癠V、FL”字樣作為標志。長工作距離物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡。一、光學顯微鏡目鏡目鏡的作用是把物鏡放大的實象（中間象）再放大一次，并把物象映入觀察者的眼中，實質上目鏡就是一個放大鏡。目鏡的種類惠更斯目鏡這是最常應用的一種目鏡，由平凸單透鏡組成，凸面都朝下，視場光闌位于兩透鏡之間，被廣泛地用于普通生物顯微鏡上，不能滿足高級研究鏡檢的要求。冉姆斯登目鏡由兩塊平凸透鏡相隔一定距離組成，兩塊透鏡的凸面相對，這比惠更斯目鏡優(yōu)越，便于觀察。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡不同種類的目鏡凱爾

20、勒目鏡接目鏡是由兩片透鏡膠合而成，是一種消色差的目鏡，圖象質量進一步得到改善。平場目鏡增加了一塊負透鏡，能校正場曲的缺陷，而使視場平坦。在目鏡的外側或端面常標刻“P1an”或“P”字樣，適用于觀察和顯微相照。廣視場目鏡由多片透鏡構成，在研究用顯微鏡中多為此種目鏡。標刻有“W”或“WF”和WHK字樣。在高檔研究用顯微鏡上，有的還配置超廣視場目鏡，視場范圍更大，更便于觀察，目鏡外側標有“SWK”字樣。一、光學顯微鏡照相目鏡專供顯微照相和投影之用，不能用于觀察。它的特點是視場平坦，可校正物鏡的殘留色差，放大倍率一般在2.5X6.7X之間不等倍率的目鏡。其它目鏡有比較目鏡、投影目鏡、指示目鏡、測微目鏡

21、及網格目鏡等這些目鏡是作為顯微鏡的一種附件，專用于某項特殊的用途。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡聚光鏡的使用聚光鏡彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光線性質，將光線聚焦于被檢物體上，以得到最強的照明光線。 聚光鏡的結構形式類型阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成，有著較好的聚光能力，多用于普通顯微鏡上。消色差等光程聚光鏡由一系列透鏡組成（5、7片），是明場鏡檢中質量最高的一種聚光鏡，高級研究用顯微鏡配用。一、光學顯微鏡搖出式聚光鏡在低倍物鏡時(如4X)使用，數(shù)值孔徑可從0.16-0.90改變。極低倍聚光鏡與極低倍物鏡(如1X、2x)配合使用的聚光鏡，其數(shù)值孔徑最大值為016。其它聚光鏡暗場聚光鏡、相襯聚光

22、鏡、偏光聚光鏡、微分干涉聚光鏡、長工作距離聚光鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡不同種類的聚光鏡顯微鏡的透射式照明法的正確使用一、光學顯微鏡照明裝置透射式照明又稱反射式照朋，分中心照明和斜射照明兩種形式，適用于透明或半透明的被檢物體，落射式照明適用于非透明的被檢物體。中心照明是最常用的透射式照明法，它又分為“臨界照明”和“柯勒照明”兩種。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡臨界照明普通的照明法，不適用于顯微照相。柯勒照明這種照明的熱焦點不在被撿物體的平面處，即使長時間的照明，也不致?lián)p傷被撿物體。是成功進行顯微照相必須的一種照明法，在視場內看不到燈絲的象，使照明變得均勻。觀察時，應把視場光闌開

23、啟到視場周緣的外切處，使不在物鏡視場內的物體得不到任何光線的照明，避免散射光的干擾。一、光學顯微鏡斜射照明這種照明光束的中軸與顯微鏡的光軸不在一直線上，而是與光軸形成某種角度斜射照射到被檢物體上。又可分為：明場斜射照明光束經聚光鏡后，斜射被檢物體而進入物鏡如相襯顯微術。暗場斜射照明光束是以更大的傾斜度射向被檢物體后不直接進入物鏡，而由物體表面所反射和衍射的光線進入物鏡如暗視野顯微術。一、光學顯微鏡落射式照明又稱“反射式”或“垂直式”照明。這種照明的光束來自物體的上方，通過物鏡后射到被檢物上，這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。適用于非透明物體，如金屬、礦物以及大而厚的生物樣品的鏡檢。在高級熒光顯微鏡及

24、大型研究用顯微鏡中，除透射照明裝置外，還設有落射照明裝置。體視顯微鏡的落射照明是利用自然光或照明燈具由側上方斜向照射被檢物體。一、光學顯微鏡顯微鏡的光軸調節(jié)在顯微鏡的光學系統(tǒng)中，光源、聚光鏡、物鏡和目鏡的光軸以及光闌的中心必須與顯微鏡的光軸同在一直線上。一、光學顯微鏡柯勒照明的調整步驟必須用10 x物鏡觀察。先將聚光鏡的視場光闌縮小并進行中心調正。在視場內可見到視場光闌的輪廓象，如不在視場的中央，則利用聚光鏡外側的兩個調正螺絲將其調正至中央部分。當緩慢地增大視場光闌時，能看到光束兩視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓象完全與視場邊緣內接，說明已經臺軸。合軸后再略為增大視場光闌，使輪廓象剛好處于視

25、場外切或稍大一些，這樣最適于作觀察之用。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡常用顯微鏡UIS2光學系統(tǒng)平行光路設計，可以自由添加光學附件 高性能光學元件 獨特的離子沉淀鍍膜技術 人性化外形設計，環(huán)保材料顯微鏡的各種觀察方式各種觀察方式1.明場觀察BF2.暗場觀察DF3.相差觀察PH4.偏光觀察PO5. 微分干涉觀察DIC6. 浮雕相襯觀察RC7.熒光觀察FL現(xiàn)代顯微鏡的款式與發(fā)展動態(tài)一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡原子力顯微鏡的技術指標一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、

26、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、高級顯微鏡(研究用顯微鏡圖譜)(一)明場觀察方式常規(guī)觀察方式應用領域：常規(guī)鏡檢、病理、染色標本優(yōu)點：視野亮度高、均勻，應用范圍廣，操作簡單，價格低，物鏡適用于熒光觀察缺點：透明標本對比度低，標本沒有立體感(一)明場觀察方式光強的調節(jié)和色溫： 1. LBD日光平衡濾色片 2. 通過調節(jié)電壓來調節(jié)光強，色溫變化 3. 通過ND灰度片減弱光強，色溫不變孔徑光闌的調節(jié)載玻片和蓋玻片的厚度 載玻片 1mm 蓋玻片 0.17mm 注意：倒置顯微鏡明場觀察時注意把玻片倒置， 即蓋玻片朝下明場一、光學顯微鏡透射式明場顯微鏡特種（專用）顯微鏡一、光學顯微鏡特種（專用）顯

27、微鏡包括7種類型：1、暗場，2、熒光，3、倒置，4、相襯，5、偏光，6、干涉，7、體視。一、光學顯微鏡暗場顯微鏡一、光學顯微鏡暗場顯微鏡觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線；視場成為黑暗的背景，被檢物體則呈現(xiàn)明亮的象。只能觀察物體的存在運動及外部形態(tài)，很難分辨其內部結構。與明場顯微鏡的不同處是采用了暗場聚光鏡。能觀察到明場下而觀察不到的極其微小的物體。光軸調整參照柯勒照明法。蓋玻片必須無疵痕且無塵土。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡暗場一、光學顯微鏡相襯顯微鏡相襯顯微鏡的發(fā)明在光學顯微鏡的改進過程中，相襯顯微鏡的制造成功和普遍的應用，是近代顯微鏡技術中的重要成就。1935年荷蘭學者澤尼克（Zerni

28、ke）提出了相襯法原理，到1941年由德國蔡司（Carl Zeiss）工廠誕生了世界上第一臺相襯顯微鏡。它的產生，從信息利用的角度來看，人們將它視為光學信息處理概念下的第一個產品，因而澤尼克獲了1953年諾貝爾獎金。一、光學顯微鏡相襯鏡檢原理 鏡檢時，光源只能通過環(huán)狀光闌的透明環(huán)，經聚光鏡后，這束光線通過被檢物體，因各部分的光程不同，光線將發(fā)生不同程度的偏斜（衍射）。使直射光和衍射光產生光的干涉，變相位差為振幅差。這樣在相襯鏡檢時，通過無色透明物體光線，使人眼不可分辨的相位差轉變?yōu)槿搜劭煞直娴恼穹?。一、光學顯微鏡 相襯顯微鏡的特點利用被檢物體的光程（折射率與厚度之乘積）之差進行鏡檢的方法，有

29、效地利用光的干涉現(xiàn)象。將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?。是普通顯微鏡難以達到的一種鏡檢方法。能使無色透明活體標本的細微結構在相襯顯微鏡下變得清晰可見。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡 相襯顯微術的負相襯與正相襯在相襯鏡檢時，由于相板鍍膜情況的不同，則有不同的鏡檢效果。采用負相襯物鏡觀察：小粒子的象比背景明亮。負相襯的效果是“暗中之明”，又稱“明反差”。采用正相襯物鏡觀察：小粒子的象比背景黑暗。正相襯的效果是“明中之暗”，又稱“暗反差”。一、光學顯微鏡（二）相差觀察方式 原理利用被檢物體的光程（折射率 x 厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直

30、射光通過補償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板 聚光鏡環(huán)狀光闌(二)相差觀察方式 特點鑒定活體細胞最實用、最經濟的方法需要光強高 應用：無色透明活體標本的細微結構鑒定活體細胞(培養(yǎng)細胞,分離細胞)(二)相差觀察方式使用注意點：需要使用內置有相差環(huán)的專用相差物鏡聚光鏡中的相差環(huán)需要和物鏡相匹配 光學元件表示可用物鏡IX-PHLPHLUPLFLN4XPHIX-PHCPHCCPLN10XPH,CPLFLN10XPH, LCACHN20XPHIX-PH1PH1UPLFLN10XPH,UPLFLN20XPH ,CPLFLN10XPH,LCACHN20XPH,LUCPLFLN20XPH,IX-PH2PH2U

31、PLFLN40XPH, UPLFLN60XOIPH, LCACHN40XPH, LUCPLFLN40XPH , LUCPLFLN60XPHIX-PH3PH3UPLFLN100XOIPH五熒光觀察方法一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡相襯顯微鏡包括環(huán)狀光闌、相板、中心（合軸）調正望遠鏡。環(huán)狀光闌裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一整體組成相襯聚光鏡。由大小不同的環(huán)形光闌裝在一園盤內，外面標有10X、20 x、40X、100X字樣，相應與不同倍率的物鏡配合使用。相襯物鏡在物鏡的后焦點平面處裝有相板，外殼上常有“Ph”字樣。一、光學顯微鏡相板物鏡的后焦點平面處裝的相板，它分為兩部分：1、是通

32、過直射光的部分，為半透明的環(huán)狀，叫“共軛面”；2、是通過衍射光的部分，叫“補償面”。一、光學顯微鏡 中心(臺軸)調正望遠鏡是一種長工作距離、放大倍率約4-5倍的放大鏡。用以調正環(huán)狀光闌所形成的象與相板共軛面完全吻合。使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在一直線上。相襯顯微鏡的使用要求1)光源要強，因環(huán)狀光闌遮掉大部分光源。同時應將視場光闌和孔徑光闌完全開啟。一、光學顯微鏡2)為了獲得良好效果，應使用波長范圍窄的近于單色的光源，相位的變化常因照明光線的波長而不同，通常采用綠色濾光鏡來調整光源波長，最好按廠家專用相襯鏡險的綠色濾光鏡進行鏡檢。3)切片不能太厚，以5-10左右為宜，否則將引起其它光學現(xiàn)象

33、，而影響成象質量。4)載玻片、蓋玻片的厚度應符合標準，且不應有疵痕；制片的封固劑應均勻一致。一、光學顯微鏡偏光顯微鏡偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡，凡具有雙折射性的物質，就能分辨的清楚?？捎糜谏飳W植物學如鑒別纖維、染色體、紡經絲、淀粉粒、細腦壁與細胞質問以及組織中是否含有晶體等?？捎糜谥参锊±砣玷b別病菌入侵引起組織內化學性質的改變的物種?？捎糜谌梭w及動物學如鑒別骨鉻、牙齒、膽固醇、神經纖維、腫瘤細胞、橫紋肌和毛發(fā)等。一、光學顯微鏡偏光鏡檢術的要求光源：用單色光。載物臺：用可以調節(jié)中心且邊緣刻有角度（3600）能旋轉的圓形載物臺。物鏡：用無應變消色差物鏡。目鏡：用帶有十字線的

34、目鏡。聚光鏡：用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡伯特蘭透鏡：用把物體所造成的初級象放大為次級象的輔助性透鏡，它裝置在檢偏鏡與目鏡之間。補償片：用石膏、云母及石英補償片等。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡微分干涉襯顯微鏡微分干涉襯顯微鏡是在60年代中期出現(xiàn)的新型顯微鏡。是利用偏光干涉原理的一種顯微鏡。通過利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束，使圖象呈現(xiàn)立體的三維感覺。能觀察無色透明的物體，而且圖象呈現(xiàn)出浮雕狀的立體感。具有相襯顯微術所不能達到的某些優(yōu)點，觀察效果更為逼真。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡熒光顯鏡微一、光學顯微鏡熒光顯鏡微熒光是一種非溫度輻射，是一種冷光（紫外光）。是用人眼不可見的一定

35、波長的紫外線作光源照射被檢物體；使之受激發(fā)后而產生人眼可見的熒光，然后再經顯微鏡成象系統(tǒng)放大來進行鏡檢。熒光顯鏡微是生物、醫(yī)學中的重要工具，如對生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學等諸方面的鑒定等。一、光學顯微鏡熒光現(xiàn)象其實質是分子吸收了短波光的能量，又以發(fā)光的形式，以波長較長的熒光射出而為人眼可見。熒光現(xiàn)象有二種自發(fā)熒光又稱“固有熒光”或 “自發(fā)熒光”，經紫外線照射發(fā)生熒光。激發(fā)熒光又稱“繼發(fā)熒光”，經熒光素處理后再經紫外線照射才能發(fā)生熒光。一、光學顯微鏡熒光顯微鏡的裝置能提供充分的特定波長的光源，使被檢物體得到理想的激發(fā)而發(fā)出強的熒光。均借助濾光片把激發(fā)光的光譜限定在這一特定的波

36、長區(qū)域內，而把伴隨發(fā)出的可見光全部吸收或反射掉。對聚光鏡（透射式用）、載破片、蓋玻片和物鏡均有一定的要求。一、光學顯微鏡熒光顯微鏡種類透射式不適用于非透明的被檢物體。較難操作。激發(fā)光來自被檢物體的下方，聚光鏡為暗場聚光鏡，使激發(fā)光不進入物鏡，而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，能得到很暗的視場背景。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡落射式在光路中具有分光鏡，光源來自被檢物體的上方，對透明與非透明的被撿物體均適用。物鏡起到了聚光鏡的作用，便于操作。從低倍到高倍，可以實現(xiàn)整個視場的均勻照明。在低倍情況下則暗，而高倍則明。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡（五）熒光觀察方式 原理物質中的電子吸收光

37、的能量由低能狀態(tài)轉變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時放出的光熒光 特點吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長激發(fā)波長（損失熱能）熒光強度極小于激發(fā)光的強度有不同程度的衰減熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物度、熒光效率 優(yōu)點：檢出能力高（放大作用）對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）能進行多重染色 用途：物體構造的觀察熒光素熒光的有無、色調比較進行物質判別抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質定性、定量分析（五）熒光觀察方式使用注意點：1. 熒光光源汞燈、氙燈等提供激發(fā)光(U、V、B、G)汞燈使用壽命有限（200-300h）注意使用！2. 熒光濾色鏡選擇激發(fā)波長，濾除雜散熒光U激發(fā)藍色染料，如DAPI、HochestB激發(fā)

38、綠色染料，如GFP、FITCG激發(fā)紅色染料，如PI、TRITC觀察時必須將與染料相適應的濾色鏡轉入光路中（五）熒光觀察方式入射光激發(fā) 濾色鏡分光 濾色鏡吸收 濾色鏡激發(fā)濾色鏡的選擇與熒光色素的應用濾色鏡根據(jù)不同生物體的各種組織、細胞、器官、微生物、病毒等，可利用不同的激發(fā)濾色鏡來達到最佳的激發(fā)光源。熒光色素必須應用適合某種被檢物體的熒光素，來獲得滿意的觀察效果。一、光學顯微鏡熒光鏡檢術的樣品制片要求不能用加拿大樹膠作封固劑，可用甘油等。不用本身能產生熒光的藥劑，一般用酒精、甲醛作固定劑，時間不宜過長，甲醛以甲醛氣進行固定為好。切片不能太厚，約在10左右，尤以透射式熒光鏡檢時要求更嚴。蛋白粘貼劑

39、不能用以熒光色素處理的材料。如為石蠟制片，脫蠟必須徹底，載玻片、蓋玻片最好為螢石玻璃制成。一、光學顯微鏡熒光鏡檢術的注意事項應在較暗的室內進行。盡可能縮短觀察時間，暫時不觀察時，應用擋板遮蓋激發(fā)光源。作油浸觀察時，應用“無熒光油”。作熒光顯微照相時，要增加數(shù)倍甚至幾十倍曝光時間。可使用特快片，如：200ASA(24DIH)、400ASA(27DIH)。避免直接看到照明光源，以防紫外線損傷視網膜。電源應裝置穩(wěn)壓器。一、光學顯微鏡熒光鏡檢一、光學顯微鏡體視顯微鏡的使用方法體視顯微鏡又稱“實體顯微鏡”或“解剖鏡”，是一種具有正象立體感的顯微鏡。特點雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行的，而是具有一定的夾角

40、（體視角120-150），成象呈現(xiàn)三維立體感。象是直（正）立的，便于操作和解剖；最高為200倍左右，工作距離長,焦深大，便于視察被檢物體，視場直徑大。物鏡的倍率為1x，并附有（2、0.75及0.5)。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡萬能研究用顯微鏡 集：多用途、附件齊全的高級大型聯(lián)機。除有明場外，均能作暗場、相襯、偏光、微分干涉和熒光顯微術（不能作倒置與體視鏡檢）。裝：有小型135和大型(45) 等自動顯微照相系統(tǒng)。附：有高分辨率投影屏、描繪器、共覽、電視及電影攝像等裝置。如物鏡的轉換、調焦；視場光闌、孔徑光闌的自動匹配以及顯微照相系統(tǒng)的自動調節(jié)等。一、光學顯微鏡被檢物體大小的測量方法一、光學顯微

41、鏡游標尺的使用普通顯鏡微游標尺常攜刻在載物臺上的推動器上，研究顯微鏡游標尺多刻在載物臺的縱橫邊緣上。主標尺每小格為1mm分度，讀數(shù)為1毫米。副標尺一般分10小格，每小格為主標尺的9/10毫米分度，讀數(shù)為0.1毫米。作用1）可粗測被檢物體的大小或長度。2）快速查找被檢物體。一、光學顯微鏡顯微測微尺顯微測微尺是用來測量視場中被檢物體的大小、長短的測微工具。包括有目鏡測微尺和測微臺尺，用時必須兩者互相配合，才能完成其測量效用。1、目鏡測微尺為一園形玻璃片，其上有刻度，常用的分為5大格，每格分10小格(共50小格) ，2、臺測微臺尺為一特制的載玻片，其中央膠粘一小園形玻片，刻有尺度，一般為1毫米，分1

42、0大格，每格再分為10小格(共100格)。一、光學顯微鏡 計算方法目鏡測微尺每小格臺尺重疊格數(shù)10/目尺重疊格數(shù)例：目鏡測微尺上的第5格與測微臺尺上的第8格重疊，就可知道目鏡測微尺上的5小格810（因測微臺尺每小格等于10m）80m；而目鏡測微尺上的每小格則為80516m。當確定目鏡測微尺每小格的數(shù)值后，在測定被檢物體的大小、長短時，必須在原顯微鏡的放大率下進行，否則目鏡測微尺的數(shù)值又有變化，如改變倍率應重新再測測量時，不再用測微臺尺，在視場中只利用目鏡測微尺便可測出。例如某一部位的大小為4小格時，即41664m。一、光學顯微鏡顯微鏡的功能附件一、光學顯微鏡描繪器描繪器的形式有多種，即將兩個不

43、同的視場合并在一起。觀察時，一方面接受由顯微鏡所成的圖象；另一方面將顯微鏡外方的繪圖紙、筆和手投射進入視場內。它成為顯微鏡的中間附件，不處于目鏡的上方，而是在物鏡與目鏡之間；鏡外需放置一臺燈，照射在繪圖紙上來進行描繪。所描繪的圖，其放大倍數(shù)的計算方法：參照前述。一、光學顯微鏡投影屏和投影目鏡投影屏它的優(yōu)點在于可多人同時進行觀察和研究，須在較暗的室內才能取得良好的效果；投影屏的屏幕系由毛玻璃做成。 投影目鏡是將顯微鏡所成的象投射在銀幕上，它必須在暗室內進行投影，不僅更為能多人觀察研究，而且也適用教學，同時也可利用它把圖象投射到繪圖紙上，進行教學掛圖的繪制。一、光學顯微鏡共覽裝置簡單為雙人指示目鏡

44、，其中裝一個棱鏡，光線既能垂直又能折射，利用折射的光線安裝一目鏡，而達到兩人同時觀察的目的。此外，在視場光闌平面處裝有一個能自由移動的指針，這樣可以利用指針指著目的物進行觀察研究。新型可供2-5人（有的可供9人）一起使用，均為雙目觀察，每人眼睛的屈光度都可調節(jié)。在主覽的鏡筒中裝有可移動的指針或指示箭頭，當指到被檢物體的某一結構時，所有觀察者可同時觀察。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡顯微攝影技術不同類型顯微照相裝置及其功能從幀幅大小分為135型、4x5或6x9型；從控制系統(tǒng)分為：手控、半自控和全自動三種類型。手控式較難掌握曝光時間；半自控可測出準確的曝光時間以及光源的色溫。全自動高級研究型全自動顯

45、微照擁有。拍攝系統(tǒng)為自動控制，功種齊全，是研究用顯微鏡的理想顯微照相裝置。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡顯微照相對物鏡、目鏡及聚光鏡的選擇物鏡的選攝必須選用平場消色差物鏡和平場復消色差物鏡；消色差物鏡不適用于顯微照相； 在進行高倍（40）干燥系物鏡的顯微照相時，采用帶校正環(huán)物鏡。在暗場、透射式熒光及油浸顯微照相時，應選用帶虹彩光闌的物鏡；在進行油浸熒光顯微照相時，應放用無熒光油。一、光學顯微鏡目鏡的選擇觀察目鏡不能用作顯微照相，必須使用原配照相目鏡。聚光鏡的選擇與孔徑光闌的應用 聚光鏡的作用產生與物鏡相適應的光束使圖象的反差和焦深處在最佳狀態(tài)。聚光鏡的調節(jié)應調節(jié)在物鏡數(shù)值孔徑60-80%之間為最

46、佳狀態(tài)。例：用數(shù)值孔徑為0.25的10 x物鏡，使孔徑光闌縮小到80，則0.25800.20，這時應將聚光鏡上標明數(shù)值孔徑刻度的標記放在0.2的位置上。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡拍攝前聚光鏡虹彩光闌大小的調節(jié)方法 照明系統(tǒng)有透射式及落射式照明， 采用柯勒照明法為了獲得均勻的照明效果，濾光鏡的作用合理的選用濾光鏡能提高圖象的襯（反差）度、分辨率；在彩色顯微照相中，能調節(jié)光源的色溫。一、光學顯微鏡可見光譜的特點、原色和補色 白光通過分光鏡分為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫。光譜是由三種原色光組成藍、綠、紅。原色和補色稱互補色兩個相對著的色光能相互吸收，藍色能吸收黃色，透射或反射藍色；黃色能吸收藍色，

47、透射或反射黃色，即黃色為藍色的“補色”，而兩者則稱為“互補色”，其它類推。 一、光學顯微鏡濾光鏡的種類與功能濾光鏡為有色玻璃（或有色膠膜）制成的透明鏡片。濾光鏡常有下列數(shù)種乳白濾光鏡藍色濾光鏡黃色濾光鏡綠色濾光鏡紅色濾光鏡色溫平衡濾光鏡中性密度濾光鏡吸熱濾光鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡濾光鏡在黑白顯微照相中的作用可增加照片反差應選用濾光鏡的顏色與物色互為補色（物色被吸收）?？山档驼掌床顟x用濾光鏡的顏色與物色同色（物色被通過）。未經過染色的黑、白、灰無彩色的制片，可不加濾光鏡。一、光學顯微鏡顯微攝影中色溫的概念一、光學顯微鏡光源的色溫及色溫平衡濾光鏡 光源的色溫即光源的放射能

48、，是由波長表示，并由光的顏色來表現(xiàn)能的高低。光源的藍紫光多，光源放射能高；色溫即高。光源的紅橙光多，光源放射能低；色溫即低。顯微鏡的照明光源色溫為2600-3400K；色溫平衡濾光鏡有兩種淡橙色將照明光源色溫轉換為3400K。淡青色將照明光源色溫轉換為5500K。一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡一、光學顯微鏡 IX71研究級倒置熒光顯微鏡 適用標本：在各種容器中培養(yǎng)的活細胞標本 制片后的各類標本 觀察方式：明場、相差、熒光 BX51正置熒光顯微鏡 適用標本： 制片后的各類染色標本 觀察方式：明場SZX7、SZX16體視顯微鏡 適用標本：各種實體標本探索微觀世界的奧秘顯微鏡的新技術與新進展 顯微鏡的

49、新進展激光共聚焦顯微鏡共聚焦與普通熒光顯微鏡的區(qū)別高分辨率(提高了:1.4倍)高靈敏度(PMT,快光子計數(shù))放大倍率更高(0-40X無級變倍)4. 多熒光標記樣品的圖像采集5. 無損傷、連續(xù)光學切片，顯微“CT”6. 真正的三維結構重組和展示7. 動態(tài)追蹤熒光探針的漂移,對未知熒光的識別8. 可進行:FRAP,FLIP,FLAP,FRET,UNCAGING等應用9. 定性,定量, 定位,定時分析10. xyt 、xyzt 和 xt 掃描 時間序列掃描11. 旋轉掃描，區(qū)域掃描,光譜掃描 12. 對細胞及組織的損傷更小 共焦掃描系統(tǒng)的主要優(yōu)點：物鏡標本針孔激光共聚焦的原理OLYMPUS197XY

50、掃描顯微鏡Z雙鏡掃描Olympus FV1000 configurationWHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY 生物用激光共焦掃描顯微鏡主要是對_顯微觀察方法的改進？熒光主要應用：生物熒光相關研究領域 幾乎含蓋整個生物領域的定位、定量、定時、定性相關的研究 1、活細胞或組織切片觀察，進行細胞精細結構觀察 和三維重建如何選擇合適的共聚焦2、多維圖象獲得，X、Y、Z、T、（光譜波長）、 （旋轉角度）I（光強度）等多維組合觀察4、細胞內離子熒光標記，細胞內Ph值和鈣、鎂離子濃度比例 和動態(tài)變化測定3、熒光探針標記的活細胞，膜標記、免疫物質、受體或配體， 核酸觀察，多重熒光標記觀察

51、5、利用TIRF技術觀察單分子熒光，放大研究一個特定分子 在膜表面的運動6、蛋白質動力學、生物化學等等顯微鏡的新進展激光共聚焦顯微鏡dEpi-FluorescenceTIRFMEvanescent fieldto observe cell surface and intracellular in the same cell顯微鏡的新進展全內反射顯微鏡顯微鏡的新進展全內反射顯微鏡abAPO100XOHR(NA1.65) PLAPO100XOTIRFM(NA1.45)PLAPON60XOTIRFM(NA1.45)TIRF系統(tǒng)物鏡顯微鏡的新進展全內反射顯微鏡分子馬達研究Cell 表面成像細胞/底物接

52、觸膜表面動力學/蛋白質定位研究單分子成像肌球蛋白，肌動蛋白與Cy3標記ATP胞吐/胞吞作用(配合高速CCD)TIRFM的應用顯微鏡的新進展全內反射顯微鏡顯微鏡的新進展活細胞工作站c光損傷小 細胞活力 延時拍攝穩(wěn)定性 高速熒光光閘 CO2培養(yǎng)裝置 各種熒光蛋白 方形視場光闌 高速高靈敏CCD 軟件控制硬件設備Live Cell 焦點零漂移系統(tǒng) 電動Z軸馬達氣墊式防震臺顯微鏡的新進展活細胞工作站1、全電動倒置顯微鏡IX812、活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)3、光源、高速電動熒光光閘4、電動載物臺/電動Z軸5、高速高靈敏冷CCD6、焦點零漂移系統(tǒng)ZDC7、多種部件同時工作的控制軟件8、其他顯微鏡的新進展活細胞工作站顯微鏡的新進展智