臨床微生物學(xué)

1、1 臨床微生物學(xué)基礎(chǔ)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所徐 曉 剛2感染性疾病的危害性根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)感染性疾病導(dǎo)致死亡原因中居第二位在致殘病因中居第一位全球每年死于結(jié)核病者達(dá)300萬(約14人/分鐘）世界人口的1/3曾感染結(jié)核中國為結(jié)核病高發(fā)區(qū)，居第二位中國人中45曾感染結(jié)核3 抗菌藥物、病原微生物及 機(jī)體相互作用關(guān)系抗菌藥物機(jī)體 病原微生物耐藥性藥效學(xué)(PD )毒性藥動(dòng)學(xué)(PK)感 染防 御4細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)荷蘭人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek）用自己制造的顯微鏡觀察到了被他稱為“小動(dòng)物”的微生物世界 5感染和感染性疾病十九世紀(jì)德國Koch在固體培養(yǎng)基上分離出第一個(gè)

2、純培養(yǎng)的細(xì)菌-碳疽芽孢桿菌通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，提出了確定病原微生物的“郭霍法則（Koch postulate ）” 動(dòng)物感染部位能分離到特定微生物健康動(dòng)物體內(nèi)分離不到這一微生物這一微生物接種于健康動(dòng)物可致病被感染動(dòng)物能再分離到這一微生物6感染和感染性疾病金黃色葡萄球菌引起的癤結(jié)核分枝桿菌引起的淋巴結(jié)核1882-1894年期間分離出許多重要的致病菌，被稱為細(xì)菌學(xué)發(fā)展的“黃金時(shí)代”7感染性疾病與病原微生物?鴨子天鵝部分感染臨床表現(xiàn)不典型89金葡菌青霉素耐藥金葡菌革蘭陽性菌耐藥性的進(jìn)化甲氧西林耐藥金葡菌 (MRSA)甲氧西林1970s青霉素1950s萬古霉素萬古霉素耐藥腸球菌(VRE)1997萬古霉素中度

3、耐藥金葡菌(VISA) 2002 萬古霉素耐藥金葡菌(VRSA)金葡菌獲得了vanA最后防線 195510嗜麥芽窄食單胞菌出現(xiàn)抗菌藥物嗜麥芽窄食單胞菌（1310株）耐藥敏感左氧氟沙星12.185.0復(fù)方磺胺甲噁唑11.786.6米諾環(huán)素2.096.311“中國”對(duì)“萬古霉素耐藥”并無免疫力12臨床標(biāo)本分離到泛耐藥菌株不一定預(yù)后差有的感染部位藥物濃度高有的感染具有自限性有的分離株為寄植，而非感染病原有研究顯示，部分耐藥株毒力低于敏感株與感染部位及基礎(chǔ)疾病密切相關(guān)中樞感染及血流感染預(yù)后差13主要內(nèi)容基本概念及常見病原微生物日常診療工作相關(guān)基礎(chǔ)研究14感染和感染性疾病臨床常見的病原微生物臨床標(biāo)本的采

4、集和檢測一、基本概念及常見病原微生物15感染和感染性疾病感染(infection)：病原體突破宿主的抵御功能，侵入體內(nèi)，與機(jī)體相互作用、相互斗爭的過程.感染性疾病(infectious diseases)：導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生臨床癥狀、體征或生理功能異常.16感染和感染性疾病根據(jù)機(jī)體的免疫狀態(tài)及侵入機(jī)體的病原微生物的毒力、數(shù)量等不同可出現(xiàn)以下結(jié)局： 病原清除隱性感染顯性感染潛伏性感染病原攜帶顯性感染病原清除隱性感染潛伏性感染病原攜帶17致病菌和外源性感染 致病微生物(pathogen)： 一般健康人體不攜帶，能引起人類疾病的微生物稱為致病微生物或病原微生物,細(xì)菌、真菌則稱為致病菌. 如:炭疽桿菌、結(jié)核

5、分支桿菌、腦膜炎奈瑟菌、白喉棒狀桿菌、痢疾志賀菌、福氏志賀菌、宋內(nèi)志賀菌，甲、乙、丙、丁肝炎病毒等外源性感染（exogenous infection）：指由外界的致病微生物進(jìn)入正常人的人體組織，與宿主相互作用、相互斗爭的過程；引起宿主組織損傷和功能障礙者則稱為感染性疾病. 如：炭疽病、結(jié)核病、腦膜炎、白喉、細(xì)菌性痢疾、病毒性肝炎等18常見病原微生物病原微生物分類細(xì)菌bacterium (pl. bacteria)需氧菌 aerobe厭氧菌 anaerobe病毒virus真菌fungus (pl. fungi)其他 others支原體、衣原體 Mycoplasma, Chlamydia立克次體

6、Rickettsieae螺旋體 spirochetes19臨床主要病原菌球菌 cocci：革蘭陽性球菌Gram-positive cocci革蘭陰性球菌Gram-negative cocci桿菌bacilli：革蘭陰性桿菌Gram-negative bacilli革蘭陽性桿菌Gram-positive bacilli20革蘭陽性球菌 Gram-positive coccci葡萄球菌屬 Staphylococcus spp.：金黃色葡萄球菌(金葡菌) Staphylococcus aureus表皮葡萄球菌(表葡菌) S. epidermidis腐生葡萄球菌 (腐葡菌) S. saprophyti

7、cus鏈球菌屬 Streptococcus spp.化膿性鏈球菌 Streptococcus pyogenes肺炎鏈球菌 S. pneumoniae草綠色鏈球菌 S. viridans腸球菌屬 Enterococcus spp.:糞腸球菌 E. faecalis屎腸球菌 E. faecium21革蘭陽性菌所致的感染性疾病葡萄球菌屬：皮膚軟組織感染skin and soft tissue infections(SSTI)敗血癥septicemia,心內(nèi)膜炎endocarditis呼吸道感染respiratory tract infections(RTI)尿道感染urinary tract inf

8、ections (UTI)鏈球菌屬：咽炎pharyngitis、扁桃體炎tonsillitis、肺炎pneumoniae細(xì)菌性心內(nèi)膜炎bacterial endocarditis腦膜炎meningitis腸球菌屬：尿路感染UTI腹腔感染abdominal infections膽道感染biliary tract infection細(xì)菌性心內(nèi)膜炎bacterial endocarditis22革蘭陰性桿菌Gram-negative bacilli腸桿菌科 Enterobacteriaceae埃希菌屬：大腸埃希菌 Escherichia coli克雷伯菌屬：肺炎克雷伯菌Klebsiella pneu

9、moniae腸桿菌屬：陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae、 產(chǎn)氣腸桿菌E. aerogenes沙雷菌屬：粘質(zhì)沙雷菌Serratia marcescens變形桿菌屬：奇異變形桿菌Proteus mirabilis摩根菌屬：摩根摩根菌Morganella morganii枸櫞酸桿菌屬：弗勞地枸櫞酸桿菌Citrobacter freundii沙門菌屬：沙寒沙門菌Salmonella typhi志賀菌屬：福氏志賀菌屬Shigella flexneri23革蘭陰性桿菌Gram-negative bacilli非發(fā)酵菌 Nonfermenters假單胞菌屬：銅綠假單胞菌P. aerugin

10、osa不動(dòng)桿菌屬：鮑曼不動(dòng)桿菌A. baumanni窄食單胞菌：嗜麥芽窄食單胞菌S. maltophilia產(chǎn)堿桿菌：糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes faecalis黃桿菌屬：腦膜敗血黃桿菌F. meningosepticum24革蘭陰性桿菌Gram-negative bacilli其他others:嗜血桿菌屬：流感嗜血桿菌H. influenzae鮑特菌屬：百日咳鮑特菌Bordetella pertussis軍團(tuán)菌屬：嗜肺軍團(tuán)菌Legionella pneumophilia螺桿菌屬：幽門螺桿菌Helicobacter pylori彎曲菌屬：空腸彎曲菌Campylobacter jejuni

11、25革蘭陰性桿菌引起的感染革蘭陰性桿菌可引起幾乎所有臟器的感染血流感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染泌尿生殖系統(tǒng)感染肺部感染腹腔感染26正常菌群 在正常人體體表與外界相通的腔道：口腔、鼻咽腔、腸道、泌尿生殖道存在的多種微生物.在機(jī)體免疫功能正常時(shí)對(duì)人體有益無害，因以細(xì)菌和真菌為主，故稱“正常菌群”在正常情況下，宿主、正常菌群和外界環(huán)境相互適應(yīng)，保持平衡狀態(tài)正常菌群的存在是保持人體健康的重要因素生物拮抗免疫形成產(chǎn)生維生素等2728內(nèi)源性感染（endogenous infection）當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，原來正常寄居或致病力很低的微生物可能侵入人體其他易感部位造成的感染，又稱自身感染或機(jī)會(huì)感染條件致病菌（opp

12、ortunistic pathogen）環(huán)境中通常不致病的細(xì)菌人類正常菌群異位人類正常菌群失調(diào)條件致病菌和內(nèi)源性感染29二重感染（suprainfection）臨床上較長期、大量使用廣譜抗菌藥物殺滅了大量正常菌群耐藥的致病和低度致病的病原體大量繁殖生長破壞了原有平衡，形成菌群失調(diào)，嚴(yán)重時(shí)稱菌群失調(diào)癥或菌群交替癥，即二重感染30 苛 養(yǎng) 菌肺炎鏈球菌嗜血流感桿菌是一類生長需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，與許多感染性疾病有關(guān)，其分離培養(yǎng)較為困難31苛 養(yǎng) 菌營養(yǎng)要求高 肺炎鏈球菌 培養(yǎng)基內(nèi)要加入血或血清 流感嗜血桿菌 X、V因子比較脆弱 對(duì)干燥、對(duì)寒冷的抵抗力低培養(yǎng)條件 510CO2、35培養(yǎng) 24 48

13、h呼吸道其他快生長細(xì)菌的覆蓋使分離率非常低32臨床標(biāo)本的采集和檢測標(biāo)本類型呼吸道標(biāo)本 深部咳出痰 支氣管灌洗液 咽拭子 鼻氣管吸出液 尿液 血液 腦脊液傷口、膿液其它體液 胸水 心包液 引流液 腹水 滑囊液33標(biāo)本的采集抗菌藥物使用前正確的部位正確的時(shí)間足夠的數(shù)量無菌的容器特殊要求應(yīng)在化驗(yàn)單上注明34標(biāo)本的處理涂片光鏡檢查分離培養(yǎng)和鑒定免疫學(xué)檢查動(dòng)物接種35涂片光鏡檢查各種標(biāo)本均應(yīng)制成涂片，行革蘭染色或特殊染色（抗酸或墨汁染色），直接形態(tài)學(xué)檢查診斷很多感染性疾病病原的最基本和快速的方法痰涂片和革蘭染色白細(xì)胞（WBC）25/LPF鱗狀上皮細(xì)胞（SEC）10/LPF合格痰標(biāo)本必須具備的條件，如不符

14、合上述指標(biāo)，檢驗(yàn)科有責(zé)任通知臨床重新采樣Konemans Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 2006. 6th ed.37尿液檢查未離心的尿液鏡檢10 WBC/mm3尿沉渣鏡檢5WBC/HPF清潔中段尿培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)： 104-105菌落/ 毫升病原微生物生化反應(yīng)鑒定微量化根據(jù)純分細(xì)菌的形態(tài)、菌落特征，特征性的生化反應(yīng)，選擇合適的API鑒定系統(tǒng):腸桿菌科細(xì)菌：API 20E非發(fā)酵革蘭陰性桿菌：API 20NE葡萄球菌屬：Slidex Staph Plus API Staph鏈球菌屬：Slidex Strepto Kit A

15、PI Strep奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬：API NH厭氧菌：API 20A38菌種鑒定鑒定到種首先須涂片鏡檢臨床的要求尿中的抗酸桿菌流感嗜血桿菌桿菌，副流感嗜血桿菌科研的要求谷氨酸棒狀桿菌G+變多殺巴斯德菌G-流感嗜血桿菌桿菌與副流感嗜血桿菌39菌種鑒定鑒定到種簡稱：藥敏試驗(yàn) 測定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長能力的試驗(yàn),稱細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)，亦稱抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)。40抗感染藥物的敏感性試驗(yàn)供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物時(shí)的參考細(xì)菌耐藥性監(jiān)測和耐藥性變遷評(píng)價(jià)新抗菌藥物的藥效學(xué)特征對(duì)細(xì)菌耐藥譜分析和分型有助于某些菌種的鑒定作為醫(yī)院內(nèi)感染流行病學(xué)調(diào)查的手段之一41藥敏試驗(yàn)的目的稀釋法試管稀釋法

16、（肉湯稀釋法）平板稀釋法（瓊脂稀釋法）擴(kuò)散法（紙片法）Kirby-baure(K-B)法E-Test聯(lián)合藥敏42藥物敏感性試驗(yàn)測定的方法43若干常用指標(biāo)MIC(最低抑菌濃度 minimal inhibitory concentration)在體外能夠抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度 MBC(最低殺菌濃度 minimal bactericidal concentration)在體外能夠使細(xì)菌總數(shù)減少(殺滅)99.9%以上的最低藥物濃度。MIC50、MIC90在一批實(shí)驗(yàn)中能抑制50%或90%受試菌所需的MIC。 MBC50 MBC90在一批實(shí)驗(yàn)中能使50%或90%受試菌的活菌數(shù)減少99.9%所需的MBC

17、。臨界濃度（breakpoint）根據(jù)抗菌藥物抑制細(xì)菌生長所需要的MIC，結(jié)合常用劑量時(shí)該藥所能達(dá)到的血藥濃度，劃定細(xì)菌對(duì)各種抗菌藥物敏感或耐藥的界限。 S 敏感 I 中介 R 耐藥 臨床意義？44如何閱讀藥敏試驗(yàn)報(bào)告常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到平均血濃度，一般相當(dāng)于或略高于對(duì)細(xì)菌的MIC當(dāng)細(xì)菌引起的感染，僅在應(yīng)用高劑量抗菌藥物時(shí)才有效，或者細(xì)菌處于體內(nèi)抗菌藥物濃縮部位，如尿液，膽汁等才被抑制，稱細(xì)菌對(duì)該藥呈中度敏感。45中介 I藥物對(duì)某一細(xì)菌的MIC高于藥物在血或體液中可能達(dá)到的濃度有時(shí)細(xì)菌能產(chǎn)生滅活抗菌藥物的酶，則不論其MIC值大小如何，仍應(yīng)判定該菌為耐藥46耐藥 RMRSAPNSPVRE 和HLARE

18、 ESBLAmpC47臨床重要耐藥細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床意義苯唑西林：1ug/片金葡菌 11-12mm凝固酶陰性葡萄球菌 17mm4%NaCl- 6ug/ml苯唑西林鹽平板培養(yǎng)條件：35，24-48小時(shí)結(jié)果：1個(gè)菌落生長，判定為甲氧西林耐藥（MR）菌株頭孢西?。?0ug/片金葡菌 19mm凝固酶陰性葡萄球菌 24mm分子生物學(xué)方法:PCR擴(kuò)增mecA基因48耐甲氧西林葡萄球菌的檢測臨床意義-lactamasesmecA抗菌藥物MSSA(甲氧西林敏感金葡菌)/除青霉素外大多敏感MRSA(甲氧西林耐藥金葡菌)大多耐藥（萬古霉素除外）49萬古霉素紙片擴(kuò)散法含量：30ug/片結(jié)果：透射光，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)

19、薄霧狀或任何其他生長或抑菌圈14mm均表示耐藥抑菌圈15-16mm為中度敏感，MIC抑菌圈17mm判定為敏感萬古霉素耐藥確證試驗(yàn)含6ug/ml萬古霉素的MH平板1-10ul 0.5 5MacFarland Standard菌懸液35 ，24小時(shí)，1個(gè)菌落生長即判定為耐藥 分子生物學(xué)方法:VanA、VanB、VanC 等基因50耐萬古霉素腸球菌檢測臨床意義耐藥表型特性VAN AVAN-R、TEC-R VAN BVAN-R、TEC-SVAN CVAN-I、TEC-SVRE菌株耐萬古霉素腸球菌可測試對(duì)氯霉素、紅霉素及利福平的敏感性51上海地區(qū)以vanM型為主上海地區(qū)多家醫(yī)院開始出現(xiàn)此型萬古霉素耐藥耐藥腸球菌多數(shù)菌株表現(xiàn)為多重耐藥，僅對(duì)少數(shù)新上市藥物敏感53二、日常診療工作相關(guān)基礎(chǔ)研究動(dòng)物及其他體外模型研究分子生物學(xué)研究生物信息學(xué)研究快速診斷技術(shù)54 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與感染