高通量測(cè)序培訓(xùn)班3-高通量測(cè)序在遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用與進(jìn)展

1、18/5/15人類疾病分類染色體?。喝旧w數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱為染色體病。通量測(cè)序在遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)與進(jìn)展單基因?。河捎趩蝹€(gè)基因的突變而引起的遺傳病。由于單基因病的發(fā)生基本上受一對(duì)等位基因控制，故又稱孟德爾遺傳病。人類遺傳性疾病獲得性疾?。ú粫?huì)遺傳）多基因?。菏芏鄠€(gè)微效基因和環(huán)境因素共同影響的疾病，又稱多因子病或復(fù)雜疾病。夏 昆中南學(xué)命科學(xué)學(xué)院線粒體遺傳?。壕€粒體DNA突變可以引起的人類疾病。復(fù)雜疾病單基因病Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（假性肌肥大型）多基因病染色體病John Forbes Nash 著名數(shù)學(xué)家；1994年諾貝爾經(jīng)濟(jì)學(xué)獎(jiǎng)得主；博弈論創(chuàng)始人之一凡高和他的向日葵唇裂與腭裂

2、遺傳學(xué)研究三大里程碑遺傳 因 素染色體病單基因病環(huán)境 因 素1953年 發(fā)現(xiàn)DNA 雙螺旋2003年哮喘、精神分裂癥糖尿病、唇裂完成HGP計(jì)劃高血壓脊柱裂2005年 啟動(dòng)國(guó)際人類單體型圖計(jì)劃消化性潰瘍先天性心臟病結(jié)核病傳染病壞血病認(rèn)識(shí)人類疾病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)成為可能物理、化學(xué)因素?fù)p傷118/5/15遺傳和基因組學(xué)對(duì)醫(yī)學(xué)的影響 2009，基因組醫(yī)學(xué)（Genomic Med） 2011，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)（Precision Med）疾病的負(fù)擔(dān)和復(fù)發(fā)監(jiān)控孕前和產(chǎn)前診斷預(yù)后和治療決策基因組學(xué)循證醫(yī)學(xué)向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)變疾病的易感性篩查和診斷新生兒篩查Calzone, et al. (2013)基因結(jié)構(gòu)變化遺傳變異：遺

3、傳和基因組學(xué)對(duì)生命周期的管理DNA SequenceDNA 序列n 單個(gè)堿基的變異 點(diǎn)突變 、單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)孕前和產(chǎn)前篩查Single base-pair changes point mutations 、SNPs (Single生命結(jié)束后管理新生兒篩查Nucleotide Polymorphisms: 3Mb diff. between any two genomes; 0.1%)n 小片段的插入/缺失 移框突變，微衛(wèi)星.Small insertions/deletions frameshift, microsatellite, minisatellite.n Mobile e

4、lementsretroelement insertions (300bp -10 kb)n 較大片段基因組變異（重復(fù)、缺失、擴(kuò)增）生命末期管風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)理Large-scale genomic variation /Deletions and Amplifications(10 kb)合適的時(shí)間給病合適的篩查，診斷和治療n基因組拷貝數(shù)變異(CNVs)個(gè)體化醫(yī)療篩查與診斷Segmental Duplications /deletions/ CNVs (Copy Number Variation, Upto 15Mb diff. between any two genomes, 3%)疾病分型Cyt

5、ogeneticsn 染色體變異 易位、倒位、融合基因.細(xì)胞遺傳學(xué)Calzone, et al. (2013)Chromosomal variationtranslocations、inversions、fusions.什么是點(diǎn)突變、小片段插入缺失？一、基于高通量測(cè)序檢測(cè)點(diǎn)突變、小片段插入缺失218/5/15測(cè)序技術(shù)概況第二代測(cè)序第代測(cè) 1977年，Sanger測(cè)定了第個(gè)基因組序列2001年， HGP就是以Sanger測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)第代測(cè)序具有通量、準(zhǔn)確性、靈敏度、動(dòng)化程度和低運(yùn)成本等優(yōu)勢(shì)適用于少量樣品的單個(gè)基因測(cè)序，測(cè)序于分析成本很高，無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用。Genome SequencingTG.GT

6、TC.CCCG.CA隨著二代測(cè)序技術(shù)的AC.GCTT.TCAC.GC GA.GCTG.ACCT.TGGT.GCAC.GCAC.GCAA.GC AT.ATTT.CC發(fā)展，外顯子捕獲等靶向捕獲技術(shù)快速發(fā)展。GenomeShort fragments of DNAShort DNA sequencesACGTGGTAACGTATACACTAGGCCATAACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACACGTGACCGGTACTGGTAACGTACACCTACGTGACCGGTACTG

7、GTAACGTACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAACGTATACCTCT.GTAATGGCGTGGCGTATACACCCTTAGCATAACGTGGTAATGGCGTATACACCCTTAGGCCATASequenced genome全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)分析全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析Leslie G. Biesecker, et al. N Engl J Med 2014Leslie G. Biesecker, et al. N Engl J Med 2014318/5/15點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)流程BWAGATKANNOVARAccuracy rate:SNVs: 98%;I

8、nDels (1-3 bp): 95%;InDels (4-15 bp): 90%;InDels (15-50 bp): 85%;Grimm D, Hagmann J, Koenig D, et al. Accurateindel prediction using paired-end short readsJ.BMC genomics, 2013, 14(1): 132.418/5/152010年采芯定位+外顯組測(cè)序技術(shù)克隆共濟(jì)失調(diào)致病基因TGM6遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（SCA）亞型致病基因的定位與克隆發(fā)病年齡較晚，40-48歲，平均43.70 2.90歲病情進(jìn)展緩慢，沒(méi)有遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象小腦

9、性共濟(jì)失調(diào)表現(xiàn)，頭部MRI為小腦萎縮伴明顯錐體外系表現(xiàn)，如痙攣性斜頸排除所有已知SCA基因突變一個(gè)四代常染色體顯性遺傳的SCA大家系(CS家系)新一代測(cè)序鑒定致病基因的研究策略遺傳病家系Yes已知基查No小家系系分析測(cè)序家系共在其他家系先證者發(fā)現(xiàn)新的驗(yàn)證發(fā)患者中篩查基因序SNPs和STR連鎖分析將該SCA家系的致病基因定位于20p13-12.2，18.45cM(8.4Mb) ，91個(gè)候選基因518/5/15四位患者全外顯子組重測(cè)序平均深度和模深度分布CS家系內(nèi)四名患者外顯子重測(cè)序高級(jí)生物信息分析結(jié)果Sample III:6(Whole/Locus)Sample III:7(Whole/Locu

10、s)Sample III:17(Whole/Locus) (Whole/Locus)Sample IV:1FilterNS/SS/ Indel5796/34869/65649/40734/95780/40931/85842/37891/8III:6III:7IV:1Not in dbSNP 129 Not in dbSNP 129, nor ineight HapMap exomes 616/6520/6674/7661/7Not in dbSNP 129, eightHapMap exomes, nor indbSNP thousandsgenome309/4211/1262/3203/13

11、41/6214/1384/5212/1III:17Mean Depth: 65.10Predicted to be damagingTGM6基因L517W突變位置及Sanger測(cè)序驗(yàn)證TGM6基因在另外一個(gè)家系（LY）D327G的突變孤獨(dú)癥（自閉癥）：嚴(yán)重影響兒童健康神經(jīng)發(fā)育障礙疾病 孤獨(dú)癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorders） 1943年美國(guó)兒童精神病學(xué)家Kanner首次報(bào)道二、以孤獨(dú)癥為例闡述高通量測(cè)序在復(fù)雜遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用與進(jìn)展 核心癥狀：社會(huì)交往障礙、狹隘興趣和重復(fù)刻板行為（DSM-V）。 起病年齡：兒童發(fā)育早期（4.4萬(wàn)/年l終身社會(huì)負(fù)擔(dān)：350萬(wàn)美元(

12、美國(guó))和200萬(wàn)英鎊(英國(guó)) 重度患者造成終身殘疾，輕度患者成年后可能出現(xiàn)情緒障礙和反社會(huì)行為ll美國(guó)弗吉尼亞理工大學(xué)槍擊案(ASD)美國(guó)桑迪胡可小學(xué)槍擊案趙承熙亞當(dāng)蘭扎臨床異質(zhì)性高、表型復(fù)雜，伴多種發(fā)育和精神癥狀等Co-occurringconditionsDevelopmentalIntellectualdisabilityLanguagedisordersADHDProportionCo-occurringconditionsGeneticsyndromesSleepdisordersPsychiatricProportion5%45%5080%Variable2844%1438%Anx

13、iety4256%1270%TicdisordersDepressionMotorabnormality79%Obsessive-compulsivedisorder724%GeneralmedicalEpilepsyPsychoticdisorders1217%16%1628%45%830%970%38%SubstanceusedisordersOppositionaldefiantdisorderEatingdisordersGIproblemLai et al. Lancet2014Immunedysregulation 無(wú)客觀診斷標(biāo)準(zhǔn)、無(wú)有效治療，早診斷、早預(yù)警、早干預(yù)至關(guān)重要718/

14、5/15國(guó)際對(duì)ASD的研究重視程度越來(lái)越高孤獨(dú)癥是全球性的公共健康問(wèn)題! 患病率急劇上升l 美國(guó)：1.47% (CDC, 2014)2007年12月18日，聯(lián)合國(guó)確立每年的4月2日為世界孤獨(dú)癥日。這是繼“世界愛滋病日”之后聯(lián)合國(guó)確定的第2個(gè)疾病日l(shuí) 英國(guó)：1.13-1.57% (Simon BJP. 2009)l 韓國(guó)：2.6% (Kim et al. AJP. 2011)l 全球：1% (Elsabbagh Aut Res. 2012)What causes autism?Lai et al. Lancet2014 全球患者數(shù)6700萬(wàn) 兒童患孤獨(dú)癥人數(shù)超過(guò)兒童癌癥、糖尿病、艾滋病三者的總和

15、孤獨(dú)癥的病因被Science雜志列為當(dāng)前人類125個(gè)問(wèn)題之一我國(guó)的現(xiàn)狀：孤獨(dú)癥的病因和病理機(jī)制不明l 1982年開始報(bào)道孤獨(dú)癥（南京醫(yī)科大學(xué)陶國(guó)泰）l 缺乏廣泛和系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查n病因復(fù)雜，遺傳因素的作用超過(guò)90%l 基礎(chǔ)研究穩(wěn)步提高，部分領(lǐng)域逐漸與國(guó)際接軌群體患病率同胞患病率異卵雙同病致率同卵雙同病致率l 我國(guó)預(yù)計(jì)有約220萬(wàn)患兒l 我國(guó)兒童精神殘疾之首l 搶救價(jià)值最大，早期干預(yù)效果好n 其他因素：6.73-5%3-10%60-80%l 表觀遺傳：MeCP2等l 環(huán)境因素：孕期壓力、颶風(fēng)、噪音、父母親生育年齡、神經(jīng)生化毒素、感染和免疫、圍產(chǎn)期病變、孕期用藥以及早產(chǎn)等全基因組相關(guān)研究(GWA

16、S)Genome wide association study孤獨(dú)癥與兩個(gè)染色體區(qū)域中常見變異相關(guān)全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)1p13.2與孤獨(dú)癥顯著相關(guān)l CDH9 和CDH10 基因之間的6 個(gè)SNPs 達(dá)到基因組顯著性水平l SEM5A基因附近3個(gè)SNPs達(dá)到基因組顯著性水平IlluminaChipsAnalysisMethodsCohortsAnalysisDesignSubjects TriosSKLMGtrios GWASFamilyBased 370K825270-TDTLogisticregressionSKLMGccGWASCase-control 370K/610K 1120AGR

17、ESFARIAGPMeta-analysis FamilyBased 550KMeta-analysis FamilyBased 1MMeta-analysis FamilyBased 1M11772067975285698TDTTDT5p14.15p15.2Laurenetal.NATURE2009&WangKetal.NATURE20093X2i5a et al. MTolDPTsychiat，2014818/5/15Common variants at 1p13.2 were replicated in three European cohortsRiskhaplotypesinvolv

18、edAMPD1,CSDE1,NRASandTRIM33genes1p13.2區(qū)域的常見變異同中國(guó)孤獨(dú)癥兒童發(fā)病相關(guān)hap2hap1hap31p13.2Xia et al. Mol Psychiatr 2014Xia et al. Mol Psychiatr 20143個(gè)單體型累及的SNPs影響腦組織mRNA表達(dá)水平，并且CSDE1，NRAS和TRIMM33在孤獨(dú)癥和正常對(duì)照腦尸解腦中表達(dá)水平存在顯著差異。Contribution of de novo coding mutations to autism spectrum disorder多個(gè)變異影響腦mRNA表達(dá)(eQTLs)Caucasia

19、n (n=109)DSCAM, CHD2,ADNP,KDM6B, MED13L,NCKAP1,ANKRD11, DIP2A,TNRC6B,WDFY3, PHF2,WAC, KDM5B,RIMS1, FOXP1,GIGYF1, KMT2E,TCF7L2ProbesSource Type III SSMSFPANK2, ARID1B,ARID1B, CHD8,DYRK1A, GRIN2B,KATNAL2, POGZ,SCN2A,SNPs rs926938-rs8453-rs10489525 with AMPD1-NRAS-CSDE1NRASrs8453rs84531.00740.79950.503

20、70.39973.944.890.0223*0.0093*CSDE1.1TBR1CSDE1.1rs104895250.4323.29510.95510.2161.64750.47762.533.30.0843*0.0407*0.0993*CSDE1.2CSDE1.3rs8453rs8453ASCSSC2.36SNPs in the second haplotype with TRIM33TRIM33 rs7511633 0.44980.22490.22492.852.852.970.0625*0.0625*0.056*孤獨(dú)癥和正常腦差異表達(dá)TRIM33 rs66610530.4498Front

21、al cortexTRIM33rs111028000.46730.2337Autism(n=16)Control(n=16)TRIM33 rs1102807Est 0.4S7e2.10.23E61stSe. 30.05p43*NRASCSDE1.1BCAS29.915 0.0729.692 0.0608.670 0.0379.064 0.0378.243 0.0199.7120.0790.0463 *9.8518.7988.9588.2970.0650.0400.0410.0200.0570*0.0155 *0.0431 *0.0423 *TRIM33.1TRIM33.3Iossifov et

22、 al., Nature 2014Rubeis et al., Nature 2014夏昆課題組. Xia et al. Mol Psychiat，2014新發(fā)突變與罕見遺傳變異Introduction of ASDTorre-Ubietaetal.NatureMedcine201620-30%5-10%3-5%5-10%Krummetal.NatureGenetics2015Gaugler et al. Nat Genet. 2014918/5/15高達(dá)50%的孤獨(dú)癥患者可以通過(guò)全基因組測(cè)序檢測(cè)到致病變異JiangYHetal.AmJHumGenet.2013高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)部分孤獨(dú)癥雙患家庭

23、攜帶相同的致病突變，部分雙患家庭攜帶不同的致病突變，且表型出差異的臨床表型Ryan K C Yuen et al. Nature Medicine 2015高通量測(cè)序可以有效發(fā)現(xiàn)孤獨(dú)癥致病基因候選捕獲測(cè)序鑒定基因（孤獨(dú)癥為例）Molecular Inversion Probes (MIPs)Cost effective method for candidate resequencingADNPADSLCDKL5CHD1CTNNB1 DYNC1H1 GRIN2A MBD5CTTNBP2 DYRK1A GRIN2B MECP2PAX5PHIPSBF1SHANK3 TAF13SLC6A1 TBL1X

24、R1 TSC1SMARCC2 TBR1 TSC2TRIP12ZC3H4SCN1ASCN2AZMYND11ARID1B CHD2CHD8CNTNAP2 DDX3XBCL11A COL4A3BPDIP2ACUL3DDHD2 FOXP1GIGYF1 IRF2BPL NOTCH1 PPP2R5D SETD2FMR1HIVEP3 MED13L POGZIQGAP3 NFIAPPM1D SETBP1 SRGAP2 TCF7L2 UBR3They report sequencing of 5,205 samples from families with ASD identified 18 newcandid

25、ate ASD-risk genes. In 294 of 2,620 (11.2%) of ASD cases, a molecular basiscould be determined and 7.2% of these carried copy number variations and/orASH1LAUTS2ST3GAL6 TNRC18 VCPSTXBP1 TNRC6B WACGIGYF2 KATNAL2 NTNG1PROX2PTENSETD5189 genes included: De novo and rare LGD mutation with high effect size

26、chromosomal abnormalities.Ryan K C Yuen et al. Nature Neuroscience 2017CACNA1C CSMD1 DSCAM GRB10LAMC3NUAK1SH夏A昆NK課1題S組Y N.GWAPa1n gT RTIOet al. NYaTtHCDoC1m mun, 2017SCN2A和CHD8新發(fā)突變頻率最高中國(guó)人群與歐美人群孤獨(dú)癥新發(fā)突變差異夏昆課題組. Wang T et al. Nat Commun, 2017夏昆課題組. Wang T et al. Nat Commun, 20171018/5/15整合新發(fā)突變和新發(fā)拷貝數(shù)變異結(jié)

27、果提示新的風(fēng)險(xiǎn)基因三、基于高通量測(cè)序檢測(cè)拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異及其在遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用夏昆課題組. Wang T et al. Nat Commun, 2017傳統(tǒng)方法1：染色體核型分析1973年夏家輝率先在我國(guó)開展了“染體病的診斷與產(chǎn)前診斷”。1973年夏家輝率先在國(guó)內(nèi)建了1971年Seabright發(fā)現(xiàn)的類染體G顯帶技術(shù)，在國(guó)際上創(chuàng)了75度烤法；相繼建了Q帶、C帶、N帶、LX、SCE技術(shù)和550-1000條帶染體分辨技術(shù)。 病例07號(hào)： ，14歲，因體矮，1973年8 12 就診。 染體檢查：45, XO診斷為特納綜合征病例20號(hào)：7歲, 1974年722就診, 平產(chǎn)。染體檢查：47,

28、XX, +21診斷為21三體先天愚型1970年以前的染色體分析技術(shù)G顯帶技術(shù)與核型分析（1973年）1118/5/15傳統(tǒng)方法2：基于比較基因組雜交芯片的方法 分型成千上萬(wàn)SNPs 發(fā)現(xiàn)基因拷數(shù)變異 基因拷貝數(shù)變異(CopyNumber Vriations)是指在人類基因組中廣泛存在的，從1000bp堿基對(duì)到數(shù)百萬(wàn)bp范圍內(nèi)的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異。 拷貝數(shù)變異”(CNVs)和“單核苷酸多態(tài)性”(SNPs)是人類表型變異的兩個(gè)重要潛在來(lái)源。 Redon et al. Nature 200636/1800例患者攜帶染色體異常：2%拷貝數(shù)變異在人類基因組中廣泛存在PIDSexKaryo

29、typesInheritanceBeadChipResultsl 270個(gè)個(gè)體;DELETIONORDUPLICATIONM8422male46,XY,12q?del(16)(q12.1-qter)denovonal 發(fā)現(xiàn)1,447個(gè)拷貝數(shù)變異B18274/M11409B30118/M16070B30123/M16084male46,XY,del(1)(p22.1-21.1)47,XXYdenovodenovodenovochr1:93416265-105648801(12.23M)malenafemale46,XX,?6p+(6q24.3-q27DUP)chr6:148602550-1704

30、69934(21.87M)chr18:61,038,861-78,015,180(16.976M)l 占人類基因組12%B55090/M26818RINGCHROMOSOMEB48029/M23053MARKERCHROMOSOMEM8145femalemale46,XX,?1846,XY,r(22)denovo Redon et al.Nature 2006denovochr22:50,856,222-51,304,565(4.48M,SHANK3)malemale47,XY,+mar47,XY,+mardenovodenovochr15:19157192-26194101(7M)idic(

31、15)chr15:19767013-30690437(10.9M)idic(15)chr15:20049770-30500698(10.5M)idic(15)B27571/M15042B30121/M16079B42485/M20070B44951/M21839male47,XY,+mar47,XY,+mar47,XX,+mardenovodenovodenovomalenafemalechr18:82,931-15,400,035(15.3M)BALANCEDCHROMOSOMALREARRANGEMENTSurprisingly！ Copy Number Variations affect

32、s 12 percent of the genome!M8736malemale46,XY,t(10;11)(q26;q23)46,XY,t(8;11)(q13;q21)unknownunknownresequencingmappingbreakpointsresequencingmappingbreakpoints much more than suspected !B48035/M23070B41040/M19604B30201/MD3696B48106/M23252B50310/M23688B23425/M8745B61206malemalemalemalemalemale46,XY,t

33、(3;12)(p13;q13)46,XY,t(4;8)(p16.3;p23.2)46,XY,inv(10)(q11.2q23)46,XY,t(8;16)(q24.3;q22)46,XY,inv(11)(p11.2q23)46,XY,t(6;10)(q13;q22)maternalpaternalmaternalpaternalpaternalpaternalresequencingmappingbreakpointsresequencingmappingbreakpointsresequencingmappingbreakpointsresequencingmappingbreakpoints

34、resequencingmappingbreakpointsresequencingmappingbreakpoints高通量測(cè)序特別是全基因組測(cè)序可以有效檢測(cè)拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異32 de novo or rare CNVs (1M) (6.2%)CNVstatusrecurrentRegionLength (bp)IIDInheritancecandidateGeneBandde novoN56 genes (including OLFM3)chr1:93416265-105648801chr5:80564-87232191p22.1-21.112,232,5378,642,65621,8

35、67,38515,273,9287,036,91010,923,42510,450,9295,913,1255,894,1011,391,3994,320,9691,150,040DelM11409M8820de novode novode novode novode novode novode novode novode novode novode novode novode novode novoN5p15.33-15.2Del55 genes (including SLC9A3)126 genes (including ARID1B)Nchr6:148602550-170469934 6

36、q24.3-q27DupDelM16084M9118N117 genes (including RP1L1/XKR6)chr8:791912-160658398p23.3-p22Y(5)Y(5)Y(5)Y(5)Y(5)Y(2)Nchr15:19157192-26194101chr15:19767013-30690437chr15:20049770-30500698chr15:20306549-26219673chr15:20314760-26208861chr15:26762141-28153539chr15:66041595-70362563chr16:32090048-33240087ch

37、r20:55665989-62426157chr22:46871209-4949859015q11.2-q13.315q11.2-q13.3DupDupDupDupDupDelM8145142 gene (including UBE3A, GABRB3)162 gene (including UBE3A, GABRB3)155 gene (including UBE3A, GABRB3)119 gene (including UBE3A, GABRB3)M15042M16079M10117M16147M15147M16229M830215q11.2-q13.315q11.2-q13.115q1

38、1.2-q13.1109 gene (including UBE3A, GABRB3)6 genes (including APBA2)15q13.1-13.215q2334 (including GANP32A, GRAMD2)DelN16p11.2DupDupDel6 genesN20q13.31-13.33 6,760,16922q13.31-13.33 2,627,381M9118117 genesNM1608740 genes (including SHANK3)6 genes (including NLGN4X)Y(2)Y(2)chrX:3944205-7480499Xp22.33

39、-22.31Xp22.32-22.313,536,2953,695,876DelDelM8590de novode novo10 genes (including NLGN4X)chrX:4482028-8177903M15199inherited unknownGuo H et al. Sci Rep, 2017.1218/5/15結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)的基本原理拷貝檢測(cè)的基本原理Five approaches to detectStructural variation sequenceCNVs from NGS short reads.A. Paired-end mapping (PEM)strat

40、egy detects CNVs throughsignatures. There are fourgeneral sequence-basedanalytical approaches used todetect structural variation.Theoretically, read-pair (RP),split-read and assembly methodscan be used to discover variantsfrom all classes of structuralvariant (SV), but each hasdifferent biases depen

41、ding on theunderlying sequence content ofthe variants and the dataproperties of the sequence reads.However, read-depth approachescan be used to detect only losses( d e l e t i o n s ) a n d g a i n s(duplications), and cannotdiscriminate between tandem andinterspersed duplications.discordantly mappe

42、d reads.Adiscordant mapping is producedif the distance between two endsofa read pair is significantlydifferent from the average insertsize. B. Split read (SR)-basedmethods use incompletelymapped read from each readpair to identify small CNVs. C.Read depth (RD)-basedapproach detects CNV bycounting th

43、e number of readsmapped to each genomic region.In the figure, reads are mappedto three exome regions. D.Assembly (AS)-based approachdetects CNVs by mappingcontigs to the reference genome.E. Combinatorial approachcombines RD and PEMinformation to detect CNVs.Alkan, C., Coe, B. P. & Eichler, E. E.Geno

44、me structural variation discoveryand genotyping. Nature reviews.Genetics12, 36376 (2011).Zhao M, Wang Q, Wang Q, et al. Computational tools for copy number variation (CNV)detection using next-generation sequencing data: features and perspectivesJ. BMCBioinformatics, 2013, 14(Suppl 11): S1.通過(guò)全基因組測(cè)序在中

45、國(guó)孤獨(dú)癥樣品中檢測(cè)到新發(fā)的拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異全基因組測(cè)序檢測(cè)孤獨(dú)癥新發(fā)的結(jié)構(gòu)變異Unpublished dataWilliam et al. AJHG 2016全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)父親遺傳的結(jié)構(gòu)變異同孤獨(dú)癥高度相關(guān)William, et al Science 20181318/5/15遺傳變異等位基因頻率和性狀/表型的關(guān)系Manolio et al. 2009 Nat Genet孤獨(dú)癥遺傳病因研究策略核型分析 致病基因拷數(shù)分析 (CNVs) 易感基因臨床亞型病理機(jī)制基因型-表型關(guān)聯(lián)研究全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)測(cè)序：全基因組、外顯組、靶向Luis et al. Nat Med,2016孤獨(dú)癥基

46、因型-表型關(guān)聯(lián)研究的臨床轉(zhuǎn)化2.48+6.6+4+(罕變異)+3050(常變異)%=5070%早期診斷孤獨(dú)癥臨床亞型早期（產(chǎn)前）診斷早期預(yù)警（新生兒篩查）A model: excessive UBE3A dosagemight lead to increased ubiquitylationof the ALDH1A family members anddecreased RA biosynthesis resulting inreduced RA activity, which mightmechanistically underlie this subtypeof human ASD.發(fā)現(xiàn)

47、自閉癥潛在治療靶點(diǎn)!降低孤獨(dú)生率早期干預(yù)，預(yù)后改善個(gè)體化治療Xu et al. Cell Res 20171418/5/15第三代測(cè)序技 以PacBio公司的SMRT、Oxford NanoporeTechnologies納孔單分測(cè)序。四、第三代測(cè)序技術(shù)在遺傳性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展最特點(diǎn)：?jiǎn)畏譁y(cè)序，測(cè)序過(guò)程需PCR。優(yōu)勢(shì)：讀很，達(dá)10kb以上PacBio SMRT也應(yīng)用邊合成邊測(cè)序，以SMRT芯片為測(cè)序載體。三代測(cè)序技術(shù)更有效發(fā)現(xiàn)CNV或結(jié)構(gòu)變異Cell 20181518/5/15Identification of repeat-expansion mutations in SAMD12Na

48、ture Genetics, 2018Two repeat configurations of abnormal repeat expansions in SAMD12五、高通量測(cè)序在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用與發(fā)展染色體非整倍體NIPT常規(guī)產(chǎn)前診斷的不足：血清學(xué)篩查：假陽(yáng)性率高達(dá)5%，漏篩率高達(dá)20-40%羊水穿刺等存在創(chuàng)傷、感染及流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)在國(guó)內(nèi)率先研發(fā)達(dá)到臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的染色體非整倍體NIPT無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷（NIPT）的優(yōu)勢(shì)：無(wú) 流產(chǎn)、感染等風(fēng)險(xiǎn)高 靈敏度ESI高引論文高 特異性周 期短疾病靈敏度特異性陽(yáng)性預(yù)測(cè)值陰性預(yù)測(cè)值Trisomy 21100% (40/40) 100% (372/372)100%

49、 (14/14) 100% (398/398)100% (4/4) 99.75% (407/408)100% (40/40) 100% (372/372)Trisomy 18Trisomy 13Trisomy 9XO100% (14/14) 100% (398/398)80% (4/5)*100% (1/1)83.3% (5/6)100% (1/1)100% (407/407)100% (411/411)100% (405/405)100% (411/411)Lo等采用新一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)母血漿中游離DNA，診斷胎兒21三體、18三體、13三體型綜合征等非整倍體疾病。100% (1/1)100%

50、 (411/411)100% (5/5) 99.75% (406/407)XXX100% (1/1)100% (411/411)1618/5/15重要論文國(guó)際同行評(píng)價(jià)非整倍體NIPT獲全球首個(gè)臨床應(yīng)用許可證血清學(xué)篩查該研究被歐洲人類遺傳學(xué)會(huì)和人類NIPT（n=481,453）生殖與胚胎學(xué)會(huì)當(dāng)前歐洲醫(yī)學(xué)輔助生殖與遺傳學(xué)問(wèn)題與共識(shí)、國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)發(fā)布的染色體異常篩查委員會(huì)立場(chǎng)聲明引用，并病種優(yōu) 絕于 對(duì)特異性靈敏度特異性靈敏度PPV1.00%65.00%T21 99.97%99.91%94.80%277家省市產(chǎn)前診斷中心推廣應(yīng)用 1.00% 50.00%作為無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)臨床應(yīng)用的代表。全國(guó)T18 99.98%99.92%89.81% T21、T18 和 T13 檢測(cè)特異性 99.98%，靈敏度 99.94%，各項(xiàng)指標(biāo)處國(guó)際領(lǐng)先水平NA* NA*T13 99.98%99.99%49.63% 阻止了7716例嚴(yán)重遺傳病患兒的出生，為國(guó)家減少直接經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)約83.2億元cSMART技術(shù)引起國(guó)際同行高度關(guān)注候選策略用于產(chǎn)前診斷環(huán)化單分子擴(kuò)增重測(cè)序技術(shù)(cSMART)被美國(guó)臨床化學(xué)學(xué)會(huì)(AACC) 譽(yù)為“分子診斷的革命性突破”美通社、路透社等上百家媒體重點(diǎn)報(bào)道。實(shí)現(xiàn)胎兒?jiǎn)蝹€(gè)堿