三乙烯四胺對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用教學(xué)提綱

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。三乙烯四胺對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用-三乙烯四胺對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用鄧小紅劉建輝*鄭旭煦陳剛郭麗霞(重慶工商大學(xué)藥物化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)研究中心，重慶，400067)摘要目的探討三乙烯四胺(triethylenetetramine,TETA)對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用。方法構(gòu)建c-MYC啟動子的熒光報告質(zhì)粒及其突變體，經(jīng)過序列測定后，轉(zhuǎn)染HEK293細胞24h后，以終濃度為0mol/L,0.1mol/L,1.0mol/L,10mol/L,100mol/L的TETA處理，測定其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，計

2、算TETA對其轉(zhuǎn)錄活性抑制率。結(jié)果成功構(gòu)建c-MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter及其突變體pGL3-Basci/c-MYCNHEIII1promotermutant。將二者分別轉(zhuǎn)染細胞后發(fā)現(xiàn)，TETA可以劑量依賴的抑制c-MYC啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，而對突變體的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用明顯下降。結(jié)論TETA能通過c-MYC啟動子上的超敏元件對其轉(zhuǎn)錄活性具有負調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞：TETA；c-MYC啟動子；G四鏈體；轉(zhuǎn)錄活性基金項目：國家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃（NCET-07-0913）以及重慶市科委重點基礎(chǔ)

3、項目（CSTC,2005BA5023）的資助。作者簡介:鄧小紅，女，在讀博士*通訊作者:劉建輝，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師Tel:(023)62769652Email:jhliuTETAregulatesthetranscriptionofc-MYCpromoterbyenhancingthestabilityofG-quadruplexDENGXiao-hong,LIUJian-hui*,ZHENGXu-xu,CHENGang,GUOLi-xia(ResearchCenterofPharmaceuticalChemistry&ChemicalBiology,ChongqingTechnolog

4、yandBusinessUniversity,Chongqing,400067,China)ABSTRACT:OBJECTIVETostudytheeffectoftriethylenetetramine(TETA)onthetranscriptionofc-MYCpromoter.METHODSAfterthewildandmutantreportergeneplasmidscontainingthec-MYCNHEIII1sequencewereconstructed,thetwoplasmidweretransfectedintoHEK293cells.Thetransfectedcel

5、lswerereplatedinto96wellsplate,andtreatedwithdifferentconcentrationsofTETA(0.0mol/L,0.1mol/L,1mol/L,10mol/L,100mol/L)forabout6-8h,theluciferaseactivitywasdeterminedwithitssubstrateBrightGlo.TheinhibitingrateofTETAonthereportergenewerecalculatedbytheluciferaseactivity.RESULTSTheluciferasereportgenepl

6、asmidsincludingpGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoteranditsmutantwereconstructedsuccessfully.AndTETAcouldinhibitthetranscriptionactivityofwildreportergeneinadose-dependentmanner,butforthemutatedgene,theinhibitingratewasdecreasedsignificantly.CONCLUSIONTTETAhasnegativeregulatoryeffectonc-MYCpromoterthroughn

7、ucleasehypersensitiveelementIII1.Keywords:Triethylenetetramine；c-MYCpromoter；G-quadruplex；transcriptionc-MYC是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生理功能，如在G1/S的過渡、G2/M的轉(zhuǎn)化中都有作用，與細胞的生長、增殖、分化密切相關(guān)。它同時也是一種重要的原癌基因，位于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多種信號通路的關(guān)鍵交匯點，其蛋白的表達失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)1,2，過量表達將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。研究表明，c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄85-90是由其啟動子區(qū)的核酸超敏元件III1(nucleasehype

8、rsensitiveelementIII1,NHEIII1)所控制3。該元件即為G4-DNA結(jié)構(gòu)，一段富含鳥嘌呤的重復(fù)序列，該序列在一定條件下可以形成四鏈螺旋結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在端粒、免疫球蛋白開關(guān)區(qū)、基因啟動子區(qū)等許多具有重要生物學(xué)功能的基因組中出現(xiàn)。目前已有多種小分子化合物顯示出對G4-DNA的穩(wěn)定作用，其中包括酰胺蒽醌類化合物4-7、卟啉類化合物等8-10。TETA是一種小分子化合物，在中性溶液中帶正電，類似于K，我們前期通過圓二色譜以及熱力曲線證明，TETA在體外能夠增強人端粒DNA和c-MYCNHEIII1啟動子序列形成的G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性11,15本文將研究TETA在細胞內(nèi)對c-M

9、YC啟動子的調(diào)節(jié)作用，為TETA的抗腫瘤作用機制提供實驗依據(jù)。1.實驗材料藥品和試劑c-MYC啟動子質(zhì)粒Pbv-Del1由美國哈佛醫(yī)學(xué)院Dr.BertVogelstein惠贈，限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRV購自于TaKaRa公司，c-MYC啟動子突變體引物由上海生工合成，突變試劑盒購自于Stratagene公司，Bright-GloTM熒光試劑購自Promega公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。HEK293細胞株，購自中國科學(xué)院上海生化細胞所。細胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清均購自Hyclone公司，TETA購自于Aldrich公司。2.方法2.1c-

10、MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒的構(gòu)建將Pbv-Del1和PGL3-Basic兩種質(zhì)粒分別都用NheI和EcoRV進行雙酶切，凝膠電泳后，切膠回收c-MYC啟動子2500bp的片斷和酶切后的PGL3-Basic質(zhì)粒。將此兩種酶切后回收產(chǎn)物按1:5比例在4下連接過夜，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5中。37過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，并提取其質(zhì)粒后，用NheI和EcoRV進行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒命名為PGL3-Basic/c-MYCpromoter。2.2c-MYC啟動子突變體的構(gòu)建根據(jù)GeneBank登錄號：HYPERLINK/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val

11、=22539123AC103819gi:22539123中的c-MYC啟動子序列，設(shè)計突變引物為，上游:ATGGGGAGGGTGAGGAGGGTGGGGAAGGTGGGG，下游:TTCCCCACCCTCCTCACCCTCCCCATAAGCGCC。根據(jù)Stratagene的突變試劑盒說明，首先以PGL3-Basci/c-MYCpromoter質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，再將DpnI酶加入到擴增產(chǎn)物中，37作用1h后直接轉(zhuǎn)化到XL-bule菌，涂板。37過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌，提取質(zhì)粒后，用NheI和EcoRV進行酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送TaKaRa公司測序，將突變成功的質(zhì)粒命名為PGL3

12、-Basci/c-MYCpromotermutant。2.3TETA對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用腫瘤細胞HEK293以1105/mL接種于6孔板中，待其融合度達到6580時準備轉(zhuǎn)染。提取的PGL3-Basic/c-MYCpromoter和PGL3-Basic/c-MYCpromotermutant兩種質(zhì)粒分別調(diào)其濃度為0.5g/L。將此兩種質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體Lipofectamine2000混合均勻后，轉(zhuǎn)染于HEK293細胞中，置37，5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分別以1106/mL濃度接種于96孔板，100L/孔。待細胞貼壁后，約2h4h，加入稀釋的TETA，使其終濃度分別為：0mol/L,

13、0.1mol/L,1.0mol/L,10mol/L,100mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h后，VeritasTURNERBIOSYSTEMS上測定細胞的熒光值。將TETA濃度為0的組設(shè)定為control(A)，同批測定其它組的值(X)計算抑制率(I），抑制率(I)(AX）/A100，統(tǒng)計分析，采用origin7.5軟件進行。3.結(jié)果3.1c-MYC啟動子熒光報告質(zhì)粒的構(gòu)建從Pbv-Del1質(zhì)粒上酶切下了c-MYC啟動子的全片斷，并將其與PGL3-Basic質(zhì)粒連接。經(jīng)過對單克隆菌株質(zhì)粒的酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)從PGL3-Basic酶切下大小為2500bp的DNA片斷，連接成功的質(zhì)?？偞笮?300bp左右

14、，從而構(gòu)建了c-MYC啟片動子熒光報告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCpromoter(Fig.1,Fig.2）。圖1.c-Myc基因結(jié)構(gòu)Fig1.Structureofc-MYCgene圖2.pGL3-Basic/c-mycpromoter的酶切鑒定Fig.2IdentifictionofpGL3-Basic/c-MycpromoterdigestedwithNheIandEcoRVLane1:DNAmarkerDL15000;Lane2:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmid;Lane3,4:PGL3-Basic/c-mycpromoterplasmiddige

15、stbyNheIandEcoRVLane5:DNAmarkerDL20003.2c-MYC啟動子突變體的構(gòu)建以pGL3-Basic/c-MYCpromoter為模板進行PCR定點突變，擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-bulez菌，挑取到含有PGL3-Basic/c-MYCpromoter突變位點的質(zhì)粒，經(jīng)過測序，發(fā)現(xiàn)c-MYC啟動子NHEIII1的G12A突變成功(Fig.3)，由此獲得了pGL3-Basci/c-MYCpromotermutant。AB圖3.PGL3-Basci/c-mycpromotermutant質(zhì)粒的酶切鑒定和測序結(jié)果Fig3.IdentificationofPGL3-Basci/c

16、-MycpromotermutantdigestedwithNheIandEcoRV(A)andthesequencereport(B)3.3TETA對c-MYC啟動子的調(diào)節(jié)作用為了考察TETA對c-MYCNHEIII1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響，我們分別用不同濃度的TETA處理轉(zhuǎn)染了野生型和突變型報告基因質(zhì)粒的293細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，加入TETA的細胞孔的熒光值明顯下降；100MTETA作用8小時對報告基因的轉(zhuǎn)錄抑制率可以達到66.2%，即使TETA濃度低至nM水平，也有明顯的抑制作用，0.1MTETA作用8小時對報告基因的抑制率為30.4%。但是，當我們對c-MYCNHEIII1啟動

17、子形成G四鏈體的關(guān)鍵核苷酸突變之后，TETA的這種抑制作用明顯下降，0.1和100MTETA作用8小時的抑制率分別為4.3%和25.7%，表明TETA對c-MYCNHEIII1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用與其穩(wěn)定該序列形成的G四鏈體結(jié)構(gòu)有關(guān)。實驗結(jié)果如圖4所示。圖4.TETA對c-MYC啟動子轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用Fig4.Triethylenetetramineinhibitsthetranscriptingactivityofc-MYCpromoterNHEIII1.AftertheHEK293cellsweretransfectedwithplasmidofwildandmutantedc-M

18、YCNHEIII1promoterfor24h,thecellswerereplatedin96wellplate,afterthecellsattached,indicatedconcentrationsofTETAwereadded,andcontinuetoincubatefor6-8h,afterthat,theluciferaseactivitiesweredetectedwithitssubstrate(Brightglo).AllthedataareshownasmeanSDfromthreeindependentexperiments.*，p0.01Vscontrol.4討論c

19、-MYC與腫瘤有著密切的聯(lián)系，其蛋白的過表達將直接或間接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而c-MYC蛋白的表達水平最主要取決于其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性高低。c-MYC的啟動子屬于內(nèi)啟動，包含在外顯子1中。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，c-MYC啟動子中存在一段富含鳥嘌呤的重復(fù)序列，即G4-DNA結(jié)構(gòu)，其主要控制著該蛋白的轉(zhuǎn)錄。實驗證實，K+離子存在時，NHEIII1區(qū)堿基能夠形成4種平行結(jié)構(gòu)的G4-DNA12,13。當能夠提高G4-DNA穩(wěn)定的陽離子卟啉化合物TMPyP4作用與腫瘤細胞時，細胞中c-MYCmRNA及蛋白水平均被下調(diào)；與之相對應(yīng)當NHEIII1區(qū)的DNA序列發(fā)生GA突變時，G4-DNA的穩(wěn)定性降低，c-MYC啟動子的轉(zhuǎn)

20、錄活性能提高3倍14。Lemarteleur等發(fā)現(xiàn)三嗪衍生物9944，陽離子卟啉化合物TMPyP4等多種已報道的通過G4-DNA能夠有效的穩(wěn)定c-MYC啟動子NHEIII1區(qū)形成G4-DNA結(jié)構(gòu)，并有可能在腫瘤細胞中抑制c-MYC基因的轉(zhuǎn)錄，從而有可能阻止腫瘤細胞周期的進程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TETA能穩(wěn)定人端粒DNA以及c-MYCNHEIII1形成的G四鏈體DNA結(jié)構(gòu),并能抑制c-MYC基因的表達15。但是，我們還沒有獲得TETA抑制c-MYC表達的直接證據(jù)。本文中，我們通過基因定點突變技術(shù)，利用報告基因法對TETA調(diào)節(jié)c-MYCNHEIII1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進行了分析，實驗結(jié)果表明，TET

21、A可能通過c-MYC啟動子的G4-DNA結(jié)構(gòu)對其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性具有調(diào)節(jié)作用。本實驗構(gòu)建了c-MYC全長啟動子的熒光報告質(zhì)粒PGL3-Basic/c-MYCNHEIII1promoter，其中包含其P1和P2啟動子(圖1)。以此質(zhì)粒為模板，在其啟動子的G4-DNA區(qū)域內(nèi)設(shè)計一突變位點，將G12突變?yōu)锳，以破壞其結(jié)構(gòu)，從而改變啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。由于該突變位點位于富含GC區(qū)，因此采用QuikChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene)試劑盒進行突變，以保證突變成功。經(jīng)過生物公司測序，我們成功獲得突變體質(zhì)粒PGL3-Basci/c-MYCpromot

22、ermutant。將此兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，我們發(fā)現(xiàn)，當加入TETA作用后，野生型啟動子的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降，且呈劑量依賴關(guān)系，但對突變體，這種抑制作用明顯下降，提示TETA抑制c-MYC基因表達可能與其在體內(nèi)能與c-MYC啟動子的超敏元件相互作用，增加G4-DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。大量的研究結(jié)果證實，c-MYCNHEIII1形成的G4-DNA在不同條件下有不同的結(jié)構(gòu)(圖5)，主要包括籃式結(jié)構(gòu)和椅式結(jié)構(gòu)16。該突變位點為G12，處于形成G四鏈體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位置，當其被突變以后，造成其G四鏈體結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，使得G4-DNA松散，從而可能增加了啟動子與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用的機會或增加了轉(zhuǎn)錄酶通過

23、該區(qū)域的機會，從而增加了其轉(zhuǎn)錄活性。我們也同時發(fā)現(xiàn)，高濃度的TETA對突變型的c-MYCNHEIII1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性仍有一定的抑制作用，這可能是由于其單一位突變不能完全破壞其高級結(jié)構(gòu)，仍能在一定程度上形成G-四鏈體DNA結(jié)構(gòu)。圖5.突變位點在G4-DNA結(jié)構(gòu)的示意(AbstractfromPNAS,2002；99(18):1159311598)致謝本項目得到國家自然基金(30600813,30701020)、教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃（NCET-07-0913）以及重慶市科委重點基礎(chǔ)項目（CSTC,2005BA5023）的資助。參考文獻RAMIROAR,JANKOVICM,CALLENE,et

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