MAPK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長因子誘導PC12細胞分化的作用

1、MAPK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長因子誘導PC12細胞分化的作用【關(guān)鍵詞】神經(jīng)生長因子;,P12細胞;,細胞分化;,信號傳導摘要:目的研究絲裂原激活蛋白激酶(APK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt途徑在蛇毒神經(jīng)生長因子(NGF)誘導P12細胞分化中的作用。方法應用蛋白免疫印跡法分析p44/p42APK和Akt的磷酸化程度,并利用APK抑制劑PD98059和PI3K抑制劑LY294002,觀察其對NGF誘導的P12細胞形態(tài)學改變的影響。結(jié)果眼鏡蛇毒NGF在10ng/L即可誘導P12細胞長出突起,100,1000ng/L作用明顯,呈劑量效應關(guān)系;NGF能有效刺激p44/p42APK、Ak

2、t的磷酸化;分別用特異抑制劑PD98059抑制APK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF誘導的細胞分化均受抑制。結(jié)論蛇毒神經(jīng)生長因子誘導P12細胞的分化作用與p44/p42APK和PI3K/Akt途徑相關(guān)。關(guān)鍵詞:神經(jīng)生長因子;P12細胞;細胞分化;信號傳導ABSTRAT:bjetiveTinvestigatetherlefitgenativatedprtEinkinase(APK)andphsphinsitide3kinase(PI3K)/AktpathaysindifferentiatinfP12ellsinduedbynervegrthfatr(NGF)frven.ethds

3、Thephsphrylatinfp44/p42APKandAkteredetetedbyesternblt.TherlefAPKandPI3KintheellularatinfPV12ellsinduedbyNGFereassessedbyuseAPKandPI3KspeifiinhibitrPD98059andLY294002respetively.ResultsNGFfrbravenanstiulatep44/p42APKandAktphsphrylatinandinduethedifferentiatinfP12ellsfr10ng/Lt1000ng/L.Thedifferentiati

4、nfP12ellsinduedbyNGFasinhibitedhenAPKrPI3KpathayasablishedbythespeifiinhibitrPD98059andLY294002.nlusinThedifferentiatinfP12ellsbyNGFfrbravenrelatestp44/p42APKandPI3K/Aktpathay.KEYRDS:nervegrthfatr;P12ell;elldifferentiatin;signaltransdutin神經(jīng)生長因子(NGF)自發(fā)現(xiàn)以來,其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用倍受關(guān)注。實驗說明,NGF能促進大鼠嗜鉻瘤P12細胞系的分化。NGF的

5、分化信號是通過與其高親和力受體TrkA結(jié)合而觸發(fā)的1,進而依次激活一系列信號途徑。然而,信號途徑如何參與其激活增殖及分化調(diào)控還未完全清楚。多種細胞的生存、分化、凋亡信號通過受體RasRaf絲裂原激活蛋白激酶(APK)又稱胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和受體磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)Akt(又稱蛋白激酶B)信號途徑進展傳導23。筆者討論APK、PI3K信號途徑與眼鏡蛇毒來源的神經(jīng)生長因子誘導的P12細胞分化間的關(guān)系。1材料和方法1.1材料1.1.1細胞株P(guān)12細胞(大鼠嗜鉻瘤細胞株),由福建醫(yī)科大學分子醫(yī)學研究中心鄭志教授贈送。1.1.2主要試劑蛇毒神經(jīng)生長因子(NGF)用凝膠通透層析和離子交

6、換層析等方法自蛇毒粗毒凍干粉(廣東產(chǎn)眼鏡蛇)中提純。信號途徑的特異抑制劑APK抑制劑PD98059、PI3K抑制劑LY294002(美國Prega公司),溶于DS配制成儲存液?？筽ERK、pAkt(ser)、tubulin抗體,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗,EL檢測系統(tǒng)(美國Santaruz公司)。多聚賴氨酸(PlyLLysine,美國Siga公司);DE/F12培養(yǎng)基(美國Gib公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料);馬血清(美國Hylne公司)。1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)P12細胞生長于含10馬血清、5胎牛血清的DE/F12培養(yǎng)液(37,體積分數(shù)為0.05的2,飽和濕度)

7、,常規(guī)傳代。實驗時培養(yǎng)器皿用多聚賴氨酸溶液包被,增加P12細胞對培養(yǎng)器皿黏附力。1.2.2p44/p42APK、Akt磷酸化檢測對數(shù)生長期P12細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板,用無血清培養(yǎng)液饑餓12h,參加不同濃度的PD98059(0.1,1,5,20,50和100l/L)或LY294002(1,25,50和100l/L)作用30in,再以100ng/LNGF作用10in。各組處理P12細胞用冷PBS洗2次,參加細胞裂解液(含1l/LNa3V4)0.15L,置冰上30in后,搜集,離心,上清液即為總的細胞蛋白溶解成分。按常規(guī)方法進展蛋白免疫印跡,別離膠為10,100A轉(zhuǎn)膜(N膜),含5脫脂奶粉封閉液

8、封閉4過夜,依次結(jié)合一抗和二抗,最后用EL系統(tǒng)進展檢測,X光片顯影,以tubulin為內(nèi)參照。1.2.3抑制劑對NGF誘導的P12細胞分化的影響搜集常規(guī)培養(yǎng)的P12細胞于含2%胎牛血清的DE/F12培養(yǎng)液中。將細胞以5104L-1接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板中,每孔體積2L。細胞分組:對照組、NGF組(10,100,1000ng/L)、NGF100ng/L)+PD98059(20l/L)、NGF(100ng/L)+LY294002(50l/L),對照組參加等體積的培養(yǎng)液。每組3孔。倒置顯微鏡下觀察細胞分化的形態(tài)改變。細胞有1個或以上突起且突起的長度為胞體直徑的2倍以上,確定為已分化細胞

9、4。作用4d,每組隨機選取10個視野(200),計數(shù),計算分化細胞的百分率。1.3統(tǒng)計學處理顯著性檢驗采用t檢驗。福建醫(yī)科大學學報2022年1月第41卷第1期何艷等：APK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長因子誘導P12細胞分化的作用2結(jié)果2.1NGF刺激P12細胞p44/p42APK和Akt的磷酸化APK、PI3K等信號途徑可以被多種細胞生長因子激活,參與介導細胞增殖、抗凋亡及分化等。P12細胞在無血清的培養(yǎng)液中饑餓12h,然后用100ng/LNGF刺激10in,esternblt結(jié)果顯示(圖1),NGF能明顯激活P12細胞p44/p42APK的磷酸化而活化,對Akt磷酸化也有激活作用。2.2抑制

10、劑對不同信號途徑的抑制作用為明確APK、PI3K途徑在P12細胞分化中的作用,應用信號途徑的特異抑制劑,觀察這些抑制劑是否可以選擇性阻斷其特異的信號途徑。結(jié)果說明PD98059劑量依賴性地抑制NGF刺激的p44/p42APK磷酸化,而不抑制Akt的磷酸化;LY294002對Akt的磷酸化抑制也呈劑量依賴性,而不抑制p44/p42APK的磷酸化(圖1)。2.3抑制劑對NGF誘導P12細胞分化的影響未經(jīng)NGF處理的P12細胞呈圓形或橢圓形,無明顯突起,參加10,100,1000ng/LNGF作用96h,可見細胞出現(xiàn)多個突起,有長有短,突起數(shù)目不等,細胞出現(xiàn)明顯分化。而在NGF作用前30in,以20

11、l/LPD98059或50l/LLY294002預處理P12細胞,96h后P12細胞仍以圓形或橢圓形居多,突起細胞數(shù)明顯減少,細胞突起的長度和數(shù)目也顯著降低,NGF誘導的P12細胞分化作用根本受到抑制(表1,圖2)。表1PD98059、LY294002對神經(jīng)生長因子作用的P12細胞分化的影響略3討論NGF誘導P12細胞分化是研究細胞分化過程在分子、生化和生理程度上互相聯(lián)絡的一個很好的模型。雖然作用機制不非常清楚,但NGF誘導P12細胞蛋白質(zhì)磷酸化已有文獻報道56。APK是磷酸化瀑布中的激酶之一,是一族細胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布的含有絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶,可被有絲分裂原和促分化因子激活。其激活對細胞的

12、生存、分化和凋亡起重要作用。PI3K是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,由一個催化亞基(p110)和一個調(diào)節(jié)亞基(p85)構(gòu)成。PI3K是許多生命活動中關(guān)鍵的信號分子,參與調(diào)節(jié)細胞的分裂、分化、凋亡等活動。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,是原癌基因akt的表達產(chǎn)物。多種細胞因子都能通過與其受體結(jié)合產(chǎn)生與PI3K的p85亞基高親和性的位點,誘導Akt的活化。在P12細胞中,眼鏡蛇毒NGF對細胞的分化作用是否通過APK和PI3K途徑？國內(nèi)學者報道了長白白眉蝮蛇(A.halys)蛇毒來源的NGF能激活P12細胞的APK激酶和APK并使其表達增加7。本研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒來源的NGF能激活ER

13、K、PI3K/Akt信號途徑。p44/p42APK在NGF刺激5in后即可發(fā)生磷酸化而活化,10in明顯磷酸化。Akt作為PI3K的下游靶蛋白也在NGF作用后發(fā)生磷酸化而活化。為明確這些途徑的活化與蛇毒NGF誘導的P12細胞分化的關(guān)系,實驗利用特異的抑制劑PD98059和LY294002分別阻斷APK和PI3K/Akt信號途徑,結(jié)果說明,兩種抑制劑都能抑制激酶的活性,而且沒有穿插抑制作用。當分別阻斷信號通路后,細胞的分化都受到明顯的抑制,即APK和PI3K/Akt途徑都參與NGF誘導的P12細胞的分化,與文獻報道一致5,8。與神經(jīng)前體細胞分化不完全一樣,BarnabeHEider等研究認為,E

14、RK同時參與神經(jīng)前體細胞的分化和存活,而PI3K主要參與細胞的存活9。信號途徑的傳導與細胞分化之間存在復雜的關(guān)系。有研究認為APK進入核內(nèi)是P12細胞分化的關(guān)鍵,APK磷酸酶3(KP3)的存在可阻斷APK進入核內(nèi)而抑制細胞分化10。也有研究認為NGF激活Ras/APK信號是通過依賴AP反響元件結(jié)合蛋白(REB)的機制。而對PI3K信號途徑,NGF可能并不充分改變PI3K全部活性,更可能是使磷酸化而活化的PI3K分子在細胞內(nèi)重新定位,通過Gabl調(diào)節(jié)PI3K的活性,加強NGF誘導P12細胞DNA合成、存活和分化。因此,NGF誘導P12細胞的分化是一個包括APK和PI3K/Akt途徑在內(nèi)的復雜的信

15、號調(diào)節(jié)過程,有待更深一步的研究。參考文獻：1ZhangY,hebanDB,nayBR,etal.ellsurfaeTrkreeptrsediateNGFinduedsurvivalhileinternalizedreeptrsregulateNGFindueddifferentiatinJ.JNeursi,2000,20(15):56715678.2LiF,riN,JinG,etal.perativeexpressinfsurvivalpERKandpAktsignalsinratbrainneurnsaftertransientAJ.BrainRes,2022,962(1):2126.3al

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